Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 310

оставляют   в   холодильнике   на   ночь   Затем   нагревают   в

эмалированной   посуде   и   кипятят   на   слабом   огне   30   мин,

фильтруют   через   один   слой   марли   и   измеряют   количество

фильтрата. На 350 мл печеночного экстракта добавляют 500

мл   раствора   Фингера,   16   г   пептона   ферментативного,   1,2   г

солянокислого   цистеина,   0,8   г   мальтозы.   Нагревают   до

закипания, доводят рН до 5,8-6,0, доливают 0,3-0,4 мл 0,5 %-

ного водного раствора метиленового синего, фильтруют через

одинарный бумажный фильтр, разливают в стерильные колбы

по 400 мл и автоклавируют при 112 °С 20 мин. Хранят среду в

холодильнике   при   4   °С.   По   мере   надобности   разливают   в

стерильные пробирки по 5 мл, предварительно обогатив ее в

колбе сывороткой крови лошади или крупного рогатого скота

без   консерванта   (20   %)   и   добавив   для   подавления

бактериальной   флоры  1.000  ЕД/мл  натриевой   или   калиевой

соли   бензилпенициллина   и   1.000   мкг/мл   стрептомицина

сульфата.   Поверхность   среды   в   пробирках   заливают

стерильным вазелиновым маслом, толщина слоя 5 мм.

В   1970-х   годах   М.В.Яцуха   и   соавторы   разработали

оригинальные   питательные   среды,   изготавливаемые  ex

tempore 

из   стандартных   ингредиентов,   выпускаемых

отечественной   промышленностью.   Ниже   представлены

рецепты трех вариантов сред.

Среда №1 содержит "О мл дрожжевого аутолизата, 100

мл   солевого   раствора,   10   мл   гидролизата   казеина   для

парентерального  белкового  питания,  30  мл  сыворотки   крови

лошади или крупного рогатого скота без консерванта, 10 мл 20

%-ного раствора мальтозы, по 160.000 ЕД бензилпенициллина

и 1 мкг стрептомицина сульфата.

Среда   №2  содержит   10   мл   5   %-го   раствора

гемогидролизата   для   культур   тканей   вместо   гидролизата

казеина.   Остальные   ингредиенты   берутся   в   тех   же

количествах, как и в среде №1.

Среда   №3  содержит   10   мл   10-кратного   концентрата

среды №199 для культур тканей вместо гидролизата казеина.

Солевой раствор, растворы мальтозы и метиленового

синего готовят в лаборатории.

Состав солевого раствора в смеси с метиленовым синим: 

хлорид натрия 0,5 г, хлорид калия 0,14 г, хлорид кальция 0,12 г,

гидрокарбонат натрия 0,2 г, 0,5 %-ный раствор метиленового 

синего 0,5 мл, дистиллированная вода 1 л.

Стерилизация в автоклаве при 120 °С 30 мин. 20 %-

ный   раствор   мальтозы   стерилизуют   кипячением   20   мин   в

водяной бане.

Дрожжевой аутолизат готовят следующим образом.

Пекарские   дрожжи   измельчают,   закрывают   в   бутыли,

оставляют для аутолиза на 2 суток при 60 °С. Затем густую ко-

ричневую   массу   разбавляют   тройным   объемом   теплой

водопроводной   воды,   перемешивают   и   дважды

центрифугируют по 10 мин при 1000 об/мин. К надосадочной

жидкости добавляют 0,5 % хлорида натрия, доводят рН до 7,4-

7,5 и автоклавируют 30 мин при 120 °С. Хранят при 4 °С.

Приготовление   среды   для   производства   посевов

заклю

 

 чается в следующем.

 

 

Приведенные   в   рецептах   растворы   в   указанном

объеме сливают в стерильную колбу, смешивают, доводят рН

до   6,3,   добавляют   антибиотики,   разливают   в   стерильные

пробирки по 5 мл, поверхность среды заливают стерильным

вазелиновым маслом.

Хранят при 4 °С не более 2 недель.

Указанные   среды   нашли   широкое   применение   в

лабораториях   дерматовенерологических   учреждений,   на

большом материале показано их высокие ростовые свойства.

Рядом   исследователей   была   показана   возможность

конструирования   питательных   сред   для   выращивания

различных микроорганизмов на основе непищевого сырья, в

частности,   из   белковых   гидролизатов   для   парентерального

питания. Некоторые из этих препаратов выпускаются в сухом

виде. Б.М.Раскиным с соавторами (1979 г.) разработан способ

распылительной сушки жидких кровезаменителей с истекшим

сроком годности, что имеет большое экономическое значение.

М.М.Васильев   (1980   г.)   разработал   рецепт

высокоэффективной   сухой   питательной   среды   с   основой   из

смеси   гидролизата   казеина   ЦОЛИПК   и   гидролизина   (1:2)   и

изучил с положительным результатом ее свойства при посеве

на влагалищные трихомона-ды.

Состав среды:

гидролизат казеина ЦОЛИПК с гидролизином (1:2) 50 г,

хлорид натрия 6 г, хлорид калия 0,1 г, хлорид кальция 0,1 г,

гидрокарбонат   натрия   0,1   г,   метабисульфит   натрия   0,3   г,

мальтоза   10   г,   оротовая   кислота   0,025   г,   дистиллированная

вода 1 л.

рН 6,5-6,6; автоклавирование при 112 °С 20 мин. Обога-

щение - 20 % сыворотки крови лошади или крупного рогатого

скота   без   консерванта,   добавление   бензилпенициллина   и

стрептомицина   сульфата   по   1.000   ЕД/мл   и   мкг/мл

соответственно. Хорошие результаты дает добавление в среду

амфоглюкамина (40 ЕД/мл), задерживающего рост грибов.

Среду   разливают   по   5   мл   в   стерильные   пробирки,

поверхность покрывают стерильным вазелиновым маслом.

Возможно использование вместо гидролизата казеина

ЦО-ЛИПК с гидролизином аминопептида в том же количестве

(50 г).

Т.Е.Вахниной   (1990   г.)   для   выделения   влагалищных

три-хомонад была предложена аналогичная, но жидкая среда

из кровезаменителей с истекшим сроком годности.

Состав среды:

гидролизат   казеина   8,3   мл,   гидролизин   16,7   мл,

дистиллированная вода 125 мл, хлорид натрия 0,9 г, хлорид

калия 0,015 г, хлорид кальция 0,015 г, гидрокарбонат натрия

0,015   г,   метаби-сульфит   натрия   0,045   г,   мальтоза   1,5   г,

оротовая кислота 3,75 мг, бензилпенициллин и стрептомицин

сульфат   по   180.000   ЕД/мл   и   мкг/мл   соответственно   на

указанный   объем   среды.   Возможна   замена   гидролизата

казеина   и   гидролизина   аминопептидом   (50   мл).   В   обоих

вариантах вместо оротовой кислоты может быть использован

аргинин (7,5 мг) или гипоксантин (350 мкг).

Приготовление жидкой среды состоит в следующем.

Вышеуказанные   навески   ингредиентов   растворяют   в

дистиллированной воде.  К полученному раствору добавляют

гидролизат казеина с гидролизином или аминопептид, смесь

перемешивают,   устанавливают   рН   6,0-6,3,   стерилизуют   в

автоклаве при 112 °С 20 мин. К охлажденному до 50 °С раствору

добавляют   сыворотку   и   антибиотики.   Разливают   среду   в

стерильные пробирки по 5 мл под вазелиновое масло.

Высокими  ростовыми  свойствами  обладает  среда,  полу-

ченная из белкового порошка (ТУ-62-3-204-84) - отхода производ-

ства фармацевтической промышленности при изготовлении лизо-

цима (Васильев М.М., 1990 г.).

Состав среды:

белковый порошок 12,5 г, хлорид калия 0,1 г, хлорид каль-

ция 0,1 г, гидрокарбонат натрия 0,1 г, аскорбиновая кислота 0,6 г,

лимонная кислота 0,12 г, оротовая кислота 0,075 г, лактат кальция

1 г, мальтоза 10 г.

Белковый  порошок растворяют в 900 мл стерильной ди-

стиллированной  воды,   добавляют  сыворотку,   антибиотики.   Этот

раствор стерилизации не подлежит. Все другие вышеуказанные

ингредиенты растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной

воды и стерилизуют 20 мин при 112 °С. Раствор охлаждают и сое-

диняют с раствором белкового порошка, реакция среды колеблет-

ся от 6,0 до 6,2. Среду разливают по пробиркам, покрывают вазе-

линовым маслом и хранят до использования в холодильнике. На

среде быстро размножаются трихомонады, они хорошо подвиж-

ны, но белковый раствор не стерилен, поэтому среда быстро про-

растает;   в   этой   среде   целесообразно   увеличить   концентрацию

антибиотиков:   бензилпенициллин   1.000   ЕД/мл,   стрептомицин

сульфат 2.000  мкг/мл,   полимиксин  М  и линкомицин  по 4.000

ЕД/мл, амфоглюкамин 40 ЕД/мл.

В ЦНИКВИ были проведены также исследования по кон-

струированию питательной среды для выращивания трихомонад

из ферментативных гидролизатов биомассы микроорганизмов, а

также из экстракта кормовых дрожжей (ЭКД),  имеющего произ-

водственный выпуск (Вахнина Т.Е., 1990 г.). Разработанная среда

обладает высокими ростовыми свойствами.

Ее 

   состав:

 

 

сухой   ферментолизат   биомассы   микроорганизмов   1,4   г,

мальтоза 0,8 г, хлорид натрия 0,6 г, хлорид калия 0,01 г, гидрокар-

бонат натрия 0,12 г, дистиллированная вода 100 мл. Обогащение

среды 20 % сыворотки; антибиотики.

Вместо сухого ферментолизата можно использовать ЭКД

в том же количестве.

В   ЦНИКВИ   с   успехом   изучена   эффективность

применения   набора   "ТрихомонаСкрин"™,   предназначенного

для   выявления   возбудителя   мочеполового   трихомониаза

методом культурального исследования образцов отделяемого.

Производственный   выпуск   набора   "ТрихомонаСкрин"™

осуществляет   ТОО   ВТК   БИОСЕРВИС,   РФ.   Диагностикум

производится   с   использованием   технологии,   разработанной

фирмой Empyrean Diagnostics Inc, США.

Набор "ТрихомонаСкрин"™ основан на использовании

питательной   среды   для   культивирования   трихомонад   в

комбинации с тест-пакетами из гибкого прозрачного пластика,

предназначенных   для   выращивания   трихомонад   и

микроскопического   исследования   образцов   в   процессе

культивирования   без   вскрытия   тест-пакетов.   Набор

применяется для культурально-микроскопического выявления

возбудителя   трихомониаза   в   цер-викальных,   вагинальных   и

уретральных   образцах.   Диагностикум   выпускается   в   виде

набора:

1)  Селективная   питательная   среда,  сухая,   в

желатиновых   капсулах,   содержащая   дрожжевой

экстракт, сыворотку крови крупного рогатого скота, L-

цистеин,   антимикробные   агенты   для   подавления

роста других микроорганизмов.

2)  Тест-пакеты  -  мешочки   из   гибкого   прозрачного

пластика,   предназначенные   для   культивирования

трихомонад   и   микроскопического   исследования

образцов без вскрытия тест-пакетов.

3)  Пипетки   градуированные  из   полиэтилена   для

внесения воды в тест-пакет.

4) Предметные стекла - полистироловые пластинки с двумя

липкими полосами для фиксации тест-пакетов при 

микроскопическом исследовании. Помимо наборов требуются 

следующие материалы и оборудование:

*   дистиллированная вода для растворения среды;

*       стерильные   ватные   тампоны   или   ложечки

Фолькмана

 

для

 

забора

 

отделяемого

урогенитального тракта у пациентов, если набор не

укомплектован одноразовыми зондами;

*   термостат на 35-37 °С;

*   световой микроскоп с 100-400 кратным увеличением.

Перед   проведением   исследования   капсулу   со   средой

помещают в тест-пакет, раскрывая его путем оттягивания на

себя   переднего   края,   укрепленного   проволочной   лентой.

Капсулу на дно пакета опускают стерильным пинцетом. Через

стенки пакета ее раздавливают. Полное растворение порошка

происходит   через   5   мин.   Желательно   растворять   среду

непосредственно в день использования, но разведенную среду

в плотно закрытом пакете можно сохранить при 4 °С в течение

недели. При этом из холодильника следует вынимать пакеты

непосредственно

 

перед

 

употреблением.

 

Посев

патологического   отделяемого   от   пациента   в   питательную

среду   производят   с   помощью   стерильного   ватного   тампона

или   ложечки   Фолькмана,   которые   опускают   в   среду   и   легко

вращают. Удаляют из пакета избыточный воздух и закрывают

его,   закрутив   верхний   липкий   край   пакета   несколько   раз.

Маркируют тест-пакеты, клейкими участками фиксируют его на

вертикальной поверхности и помещают в термостат (35-37 °С).

В   процессе   культивирования   трихомонад   цвет   среды   может

меняться на желтый.

Микроскопию   культуры   в   тест-пакете   производят

следующим   образом.   Через   сутки   нижнюю   часть   пакета,   не

взбалтывая,   закрепляют   на   липких   полосках   стекла   и

исследуют   в   световом   микроскопе   при   100-400   кратном

увеличении. Начинают исследование с  нижнего края пакета,

продвигаясь   к   верхней   части.   При   отсутствии   трихомонад

через сутки просматривают культуру ежедневно еще 4 суток.

Даже   единичные   подвижные   трихомонады   указывают   на

положительный результат посева.

Наборы   хранят   при   4-30   °С,   срок   их   годности   6

месяцев. Один набор рассчитан на 30 анализов.

В ЦНИКВИ МЗ РФ был изучен данный препарат на 57

образцах отделяемого урогенитального тракта от 50 женщин и

7 мужчин с диагнозом трихомониаза, а также на 30 образцах

от   пациентов   с   воспалительным   заболеванием   не

трихомонадной   этиологии.   Установлена   100   %

чувствительность и специфичность метода.

Вышеописанная

 

тест-система

 

рекомендована

Комитетом   медицинских   и   биологических   препаратов   к

применению в практике здравоохранения.

Ряд   авторов   подчеркивает   значение   повторных

исследований   культур   при   бактериологическом   анализе   на

трихомониаз.   Некоторые   отмечали   зависимость   появления

видимого   роста   трихомонад   на   питательной   среде   от

величины   посевной   дозы.   С.Л.Зильман   (1980   г.)   изучала

жизненный   цикл   популяции   влагалищной   трихомонады   в

культуре   в   зависимости   от   величины   посевной   дозы,   что

служило   моделью   различных   концентраций   возбудителя   в

патологическом   материале.   Она   установила,   что   при   низких

посевных   дозах  (10-40   особей)  длительность   жизненного

цикла  составляет  311,5 + 10,6 час,  число генераций  -18,7 ±

0,2;   при   средних   посевных   дозах  (800-7.000   особей)  эти

параметры соответственно равны 249 ± 15,9 час и 12,2 ± 0,5;

при высоких посевных дозах  (60.000-390.000 особей) -154 ±

10,3 час и 5,9 ± 0,5.

Проведенные   исследования   явились   основой   для   по-

строения   графика,   позволяющего   определить   оптимальные

сроки   изучения   культур   с   различными   посевными   дозами

трихомонад.

Для   диагностических   целей   предложены   следующие

периоды микроскопического контроля посевов.

1   -   3-5   день   культивирования.  В   этот   период

определяются   трихомонады   в   культурах   со   средними   и

высокими посевными дозами.

2   -  7-9   день   инкубации   посевов.  Определяются

трихомонады в культурах со средними и низкими посевными

дозами.

3-  11-17   день   культивирования.  В   этот   период

выявляются   трихомонады  в   культурах   с   низкими   посевными

дозами.

Использование   приведенных   сроков   исследования

культур   позволяет   значительно   повысить   эффективность

культурального метода исследования.

СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

С   60-х   годов   активизировались   исследования   по

серологической   диагностике   мочеполового   трихомониаза.

П.П.Петров   (1969   г.)   и   М.О.Танрыбердыева   (1976   г.)

предложили

 

методики

 

постановки

 

реакции

иммунофлюоресценции   с   сыворотками   крови   обследуемых

лиц   (РИФ-80).   С.Л.Зильман   (1980   г.)   разработала   несколько

модификаций   реакции   со  свежей   кровью,   взятой   из   пальца.

Она   показала   высокую   чувствительность   и   специфичность

реакции   и   рекомендовала   использовать   ее   как   отборочный

тест на трихомониаз.

Антиген для реакции готовят следующим образом.

Для   обеспечения   его   большинством   серотипов

влагалищной трихомонады берут до 20 штаммов трихомонад в

виде чистых культур и засевают их на любую жидкую среду

для   этого   простейшего.   Выращивают   при   35-37   °С,   затем

центрифугируют   20   мин   при   1.000   об/мин,   надосадочную

жидкость   сливают,   к   осадку   добавляют   0,9   %-ный

изотонический раствор хлорида натрия, который смешивают с

осадком,   вновь   центрифугируют,   таким   образом   отмывая

трихомонады от среды. К осадку добавляют 10 %-ный раствор

нейтрального   формалина,   выдерживают   30   мин,   центри-

фугируют,   двукратно   отмывают   изотоническим   раствором

хлорида натрия. Полученный осадок разводят им до густоты

взвеси   10-15   трихомонад   в   поле   зрения   микроскопа   и

применяют ее в качестве антигена, который можно хранить в

холодильнике при 4 °С 6 месяцев.

Кровь для реакции получают путем прокола пальца. С

помощью микропипетки набирают 0,1 мл крови, которую поме-

щают   в   пробирку   с   0,9   мл   дистиллированной   воды,   т.е.

получают   гемолизированную   кровь   в   разведении   1:10,

удобном для дальнейших манипуляций. После размешивания

крови в воде ее хранят в морозильной камере холодильника

до постановки реакции, но не более 7 суток.

С   целью   повышения   чувствительности   и

специфичности реакции С.Л.Зильман предложила новую для

диагностики   трихо-мониаза   модификацию   реакции

иммунофлюоресценции - РИФ-абс с разведением крови в 40

раз и использованием в качестве сорбента неспецифических

антител   МПБ   из   говяжьего   мяса,  методика   приготовления

которого изложена ниже.

К   500   г   пропущенного   через   мясорубку   свежего

говяжьего мяса добавляют 1 л холодной водопроводной воды

и   ставят   на   18-20   часов   в   холодное   место   для

экстрагирования.   Затем   эту   смесь   кипятят   в   закрытой

эмалированной   посуде   30   мин,   фильтруют   через   1   слой

марли, к фильтрату добавляют 15, % пептона и снова кипятят

20   мин,   доводят   рН   до   7,0,   разливают   по   пробиркам   и

стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин. Приготовленный

таким образом бульон отличается от обычно применяемого в

бактериологической   практике   повышенным   содержанием

пептона   и   отсутствием   хлорида   натрия.   Такой   сорбент

сохраняют   в   стерильном   виде   в   холодильнике   при   4   °С   до

использования.