Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 75

ныявляемых параметров: общая характеристика

иммунологической специфичности сывороточных

белков с поливалентной антисывороткой, с моно-

специфическими антисыворотками к иммуногло-

булинам А, М, G, к легким цепям каппа и ламб-

да (у.

 и Л).

П р о в е д е н и е  э л е к т р о ф о р е з а .

Электролитные ванны прибора заполняют бу-

ферным раствором (катодная и анодная ван-

ны — одинаковым количеством раствора). Перед

использованием необходимо проверить рН буфе-

ра. Учитывая, что в анодной ванне во время

электрофореза происходят интенсивные процессы

гидролиза, может меняться рН и ионная сила,

необходимо смешивать катодный и анодный ра-

створы по окончании процедуры.

Стекла с агаром и нанесенными образцами

соединяют с электродными кюветами при помо-

щи нескольких слоев фильтровальной бумаги.

Толщина слоя контактных полос, плотность при-

легания бумаги к плоскости агара могут изме-

нять величину силы тока. Наилучшее разделение

фракции получают при величине подаваемого

на агаровую пластину потенциала 9 В/см по оси

электрофореза (I = 40—50 мА) в течение 3—4 ч.

Контроль за скоростью миграции можно осу-

ществлять, наблюдая движение «тени» альбу-

мина при боковом освещении агаровой пластины

или используя «свидетель-краситель», скорость

движения которого равна скорости миграции

альбумина  ( п и р о н и н ) .

По окончании электрофореза в агаровой пла-

стине вырезают траншеи в соответствии с тра-

фаретом (размеры траншеи указаны выше) и

задачами исследования. Пластины с заполнен-

ными антисывороткой траншеями помещают во

влажную камеру, в качестве которой удобнее

всего использовать эксикатор с небольшим коли-

чеством воды. Появление полос преципитации

отмечается уже на вторые сутки. Полностью

взаимодействие белков, диффундирующих из

траншеи с антигенами, расположенными по оси

электрофореза, заканчивается на 4—5-е сутки.

Достаточно четкие полосы преципитации позво-

ляют анализировать нативные препараты. При

необходимости их можно окрасить. Для эффек-

тивного окрашивания все белки, не участвующие

в специфической реакции, удаляют, промывая

пластину в течение 2—3 дней изотоническим

раствором, который несколько раз меняют. По

окончании промывания гель накрывают смочен-

ной в дистиллированной воде фильтровальной

бумагой (можно положить небольшой груз) и

оставляют сохнуть при 37 °С или комнатной тем-

пературе. Когда гель высыхает и превращается

в присохшую к стеклу пленку, бумагу легко уда-

ляют с его поверхности. Высушенную пластину

помещают в кювету с красителем следующего

состава: амидо-черный В — 1 мл, уксусная кис-

лота — 450 мл, 0,1 М ацетат натрия — 450 мл,

глицерин — 100 мл. Окрашивание продолжают

в течение 3—4 ч. После этого пластины извле-

кают и помещают в кюветы с отмывающей жид-

костью — 2 % уксусной кислотой, содержащей

10—15 % глицерина. Обработанную подобным

образом агаровую пластину легко снимают со

стекла и переносят на отмытую рентгеновскую

Рис. 11. Определение типа парапротеинов и

белков Бенс-Джонса. Контроль специфичности

антисывороток после адсорбции.

В  т р а н ш е я х — антисыворотка к л-цепи; в  л у н к а х :

1 — нормальная человеческая сыворотка; 2 — моче-

вой концентрат, содержащий белок Бенс-Джонса

х-типа; 3 — мочевой концентрат, содержащий белок

Бенс-Джонса Я-типа; 4 — препарат очищенного

lgGx-типа в  к о н ц е н т р а ц и и 0,1 %; 5 —  п р е п а р а т очи-

щенного lgG?.-типа в  к о н ц е н т р а ц и и 1 %.

пленку. Высыхая, агар полностью сохраняет всю

картину преципитации, плотно прилипает к

пленке и может быть сфотографирован или со-

хранен как документ.

Анализ преципитационных дуг проводят в

соответствии со схемой постановки, т. е. учета

специфичности антисыворотки в траншеях и

взаимного их расположения с лунками, содер-

жащими антиген. Примерная схема расположе-

ния лунок и траншеи при исследовании парапро-

теина типа Бенс-Джонса представлена на

рис. 11.

При исследовании парапротеинов сыворотки

типа Q в лунку помещают цельную сыворотку.

В траншеи заливают антисыворотки к легкой

цепи, соответствующей типу исследуемого G-na-

299

Рис. 12. Различное расположение парапротеинов типа IgG по отношению дуги IgG

(по Fauvert et al., 1962, 1978).

рапротеина. Образуется так называемая мие-

мая  л и н и я преципитации («ложкообразный»

преципитат) с утолщением в одном ограничен-

ном участке, идентичная по форме линии, обра-

зующейся с антисывороткой к IgG. Моноклоно-

вость парапротеина и нередко высокая его кон-

центрация обусловливают плотность преципи-

тата и приближенность его к траншее. Чувстви-

тельность метода позволяет рано выявлять син-

тезируемый парапротеин. Низкие начальные

концентрации — «Disglobulinemie  m i n i m a »

[Greysel R. et al., 1958]— могут давать измене-

ние концевого фрагмента дуги в виде утолщения

или расщепления.

Схема различных типов преципитатов пара-

протеина представлена на рис. 12.

При иммуноэлектрофоретическом титрова-

нии парапротеинемий другого класса — A, D, Е

(которые встречаются крайне редко) — и моно-

клональных макроглобулинов необходимо иссле-

довать разведенные сыворотки, так как в про-

тивном случае линия нормального IgG мешает

титрованию.

Особого методического подхода требуют дру-

гие источники антигенов, подвергаемые имму-

ноэлектрофоретическому анализу. Все они, и

моча, и промывные воды бронхоальвеолярной

системы, и цереброспинальная жидкость и др.,

как правило (исключение составляет моча, со-

держащая в ряде случаев нефротичеекого синд-

рома большие количества белка), имеют низ-

кие концентрации антигенов. Поэтому иммуно-

электрофоретическому анализу должно пред-

шествовать предварительное концентрирование

белка в этих жидкостях. Необходимо избирать

наиболее щадящий режим концентрации, не

изменяющий структуры антигена. Наиболее

удобным и приемлемым для любых лабораторий

300

можно считать метод испарения под вентилято-
ром без нагревания. Быстро и эффективно про-
ходит концентрация через полупроницаемую

мембрану (диализный целлофан) в среде высо-
комолекулярного полиэтиленгликоля. При нали-

чии вакуум-насоса применим метод ультра-
фильтрации через миллипоровые фильтры или
диализный целлофан. Исчисление степени кон-

центрации можно вести по кратности объемов

(до и после концентрации). Однако более пра-

вильно будет измерение белка в конечном объе-
ме, так как это дает возможность произвести

предварительные расчеты разведений антисыво-
ротки в тест-системе. Последняя воспроизводит-

ся для каждого типа исследуемого объекта.

Так, концентрированная моча исследуется в той
же системе, что и сыворотка. Но для лаважной,

цереброспинальной жидкости, околоплодных

вод и т. д. необходимо в предварительных опы-

тах по раститровке антисыворотки выбрать наи-

более оптимальную концентрацию антител. Это
достигается при использовании метода двойной

иммунодиффузии по Оухтерлони.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Иммуно-

электрофоретический анализ позволяет рано вы-

явить низкие концентрации парапротеина и точ-

но их титровать. Выявление парапротеина по-

зволяет правильно и своевременно поставить
диагноз больным и назначить правильную те-

рапию. Титрование легких цепей парапротеинов

позволяет дифференцированно применять тера-

пию при амилоидозе, нередко сопутствующем

парапротеинемиям. Динамическое наблюдение

за концентрацией парапротеина — объективный

тест оценки эффективности применяемой стеро-

идной или цитостатической терапии.

Л и т е р а т у р а . Иммунохимический ана-

лиз / Под ред. Л. В. Зильбера.— М.: Медицина,

1968 г.— 300 с.; Ваппаров И., Иомтов М., Са-

вов С. и др. Диспротеинемия.— София, 1978;

Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофорети-

ческий анализ.— М., 1963.

6.4.6. Поверхностный антиген

гепатита В и антитела к нему

Метод встречного иммуноэлектроосмофореза.

П р и н ц и п . Метод основан на различной под-
вижности антигена и антител в гелевых носите-

лях под воздействием электрического поля. Дви-

жение антигена направлено к положительному
полюсу — к аноду, антител — к катоду. При

взаимодействии антигена и антител к нему по

фронту встречного движения образуется верти-
кальный преципитат.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . При-

бор для электрофореза ПЭФ-3. 2. Стекла 9Х

Х 1 2 см (очищенные фотопластинки). 3. Про-

бойники для лунок с внутренним диаметром

3 мм. 4. Водоструйный насос.

Р е а к т и в ы . 1. Агар (бактоагар «Дифко»,

США; «Серва», ФРГ, или дальневосточный
агар, очищенный по одному из способов, описан-
ных выше). 2. Иммунодиагностикум на антиген

вирусного гепатита В (HBsAg) и антител к нему

(HBsAt) производства ИЭМ им. Н. Ф. Гама-

леи. 3. Барбитал-натриевый буфер рН 8,1—8,4:
8,14 г барбитал-натрия (мединал), 6,48 г аце-

тата натрия, 90 мл 0,1 н. НС1, до 1 л дистиллиро-

ванной воды. Перед использованием буфера

необходимо строго контролировать рН и при

несоответствии указанным значениям (в зависи-
мости от отклонения) исправлять величину рН
0,1 н. НС1 или 0,1 н. NaOH.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Готовят 1 % агар

на барбитал-натриевом буферном растворе рН
8,1—8,4. Если применяют порошкообразный

очищенный агар, то его растворяют в буферном
растворе при постоянном помешивании, нагре-

вая до 90 °С (не доводя до  з а к и п а н и я ) . Гелизи-

рованный агар нагревают в стеклянной колбе на

водяной бане при тех же условиях. 15 мл гото-

вого агара, охлажденного до 45 °С, наливают
на подогретое тщательно обезжиренное стекло,

уложенное на горизонтальную поверхность. На-

крыв конической крышкой, дают застыть гелю.

Затем пробойником наносят 4 ряда лунок по

вертикальному размеру стекла. Расстояние

между лунками по вертикали в  п а р н ы х ря-

дах составляет 8 мм, по горизонтали —

8 мм. Расстояние между парными рядами

равно 15 мм.

Количество лунок в вертикальном ряду опре-

деляется числом сывороток, поступивших для

исследования. Для стандартизации постановок

удобно использовать трафарет, нанесенный на

миллиметровую бумагу и имеющий размеры

стекла. Накладывая стекло с агаром на трафа-
рет, можно быстро и точно пробить лунки в

агаре.

В первую и последнюю пару лунок капилля-

ром вровень с поверхностью агара вносят компо-
ненты иммунодиагностикума для контроля ре-
ж и м а опыта. АГ иммунодиагностикума и контро-

лируемые сыворотки вносят в лунки, располо-

женные на стороне катода. AT иммунодиагно-

стикума вносят в лунки, расположенные на сто-

роне анода. После заполнения лунок стекло по-
мещают в прибор для электрофореза. На два

противоположных края стекла со стороны анода

и катода кладут куски фильтровальной бумаги,
сложенные вдвое и смоченные в ацетат-барби-

таловом буфере. Фильтровальная бумага должна
закрывать 0,5—1 см поверхности агара и плотно

к нему прилегать.

Свободный конец бумаги опускают в элект-

родный сосуд, в который налит буфер. После
включения прибора устанавливают напряжение

120—160 В, а силу тока устанавливают 30 мА.

Через 1'/2—2 ч прибор отключают, бумажные

соединители убирают и учитывают результаты.
Вначале проверяют реакцию у контрольных лу-

нок. В связи с тем что антитела обладают боль-

шей подвижностью, они проходят большее рас-

стояние до взаимодействия с антигеном. По-
этому полоса приципитации расположена ближе

к лунке с антигеном. Этим она отличается от

других неспецифических полос, которые могут
образовываться при проведении реакции мето-
дом встречного иммуноэлектроосмофореза, так

как в сыворотке человека может присутствовать

несколько преципитирующих систем.

301

Рис. 13. Схема постановки метода двойной иммунодиффузии в геле для определения антигена

вирусного гепатита (HBsAg) и метода встречного иммуноэлектроосмофореза.

1 — схема стандартного штампа для пресечения контура лунок: радиус центральной лунки 8 мм, диаметр

периферических лунок — 3 мм; 2 — схема внесения контролируемой антисыворотки: ДП — донорская плазма,

АТх — истощенная кроличья антисыворотка; 3 — АГ и AT — антиген и антитела эталонного иммунодиагно-

с т и к у м а . АТх — контролируемая антисыворотка с разным титром AT; 4 — AT и АГ — компоненты эталонного

и м м у н о д и а г н о с т и к у м а , АТх, АГу, АТу,  А Г х — компоненты контролируемого иммунодиагностикума серий

«х» и «у»; 5 — АГ и AT — компоненты  и м м у н о д и а г н о с т и к у м а : ИС — исследуемая сыворотка, ИР — изотони-

ческий раствор натрия хлорида; 6 — схема встречного иммуноэлектроосмофореза: ДТ и АГ — компоненты

и м м у н о д и а г н о с т и к у м а , ИС|, ИС2, ИСз — исследуемые сыворотки; а,б,в,г,д —  р а з л и ч н ы е типы положительных

и отрицательных реакций на HBsAg.

Перед учетом результатов рекомендуется

пластинку с агаром поместить на 1 ч в 10 %

раствор NaCl.

Положительной на присутствие HBs-анти-

гена считается та сыворотка, которая с AT им-

мунодиагностикума образует полосу преципита-

ции, расположенную ближе к лунке с исследу-

емой сывороткой и находящуюся на одной пря-

мой с полосой преципитации контрольных лу-

нок (рис. 13).

При исследовании сывороток для обнаруже-

ния антител к HBs-антигену реакцию ставят по

той же схеме: в лунки, расположенные на сто-

роне катода, вносят АГ иммунодиагностикума,

в лунки, расположенные на стороне анода,—

контролируемые сыворотки. В верхнюю и ниж-

нюю пару лунок вносят компоненты иммуно-

диагностикума. Специфичность положительных

результатов по выявлению антигена и антител

в человеческих сыворотках, полученных методом

встречного иммуноэлектроосмофореза, следует

уточнять повторной постановкой в реакции пре-

ципитации в геле с иммунодиагностикумом на

антиген и антитела вирусного гепатита В.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Поверх-

ностный антиген гепатита В — HB

s

-Ag, назван-

ный после публикации работ Блайберга австра-

лийским, является маркером именно этого вида

гепатита, его этиологической причиной. Выяв-

ление его имеет диагностическое значение и спо-

собствует дифференцированию гепатита В от ге-

патита А, алкогольного гепатита. Учитывая воз-

можность носительства антигена, необходимо

провести исследование на HBs-антиген донор-

ской крови. Изучение путей передачи привело

многих передовых клиницистов к пониманию

необходимости обследования на HBs-антиген

всех пациентов стационаров, с тем чтобы во-

время исключить возможность «шприцевого»

гепатита. HBsAg является причиной вспышек

гепатита в отделениях хронического гемодиа-

лиза. Клинически обосновано исследование HBs-

антител в сыворотке. Наличие их при отсутствии

антигена указывает на возможность секвестри-

рования антигена в иммунных комплексах или

фиксации в тканях. Обосновано определение

HB

s

Ag не только при установлении этиологи-

ческой причины заболевания печени, но и при

системных васкулитах. Так, в 45—60 % случаев

узелкового периартериита реакция на HB,Ag

положительна. Находят этот антиген и при

некоторых формах иммунокомплексных

нефритов.

Выявление этого антигена представляется

важным именно потому, что современные методы

терапии позволяют элиминировать его и тем

самым удалить основную причину, вызывающую

развитие цепи взаимообусловленных патологи-

ческих изменений. HB

s

Ag может быть выявлен

в тканях, в экссудатах.

302