Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 73

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Определе-

ние титра антигиалуронидазы широко исполь-

зуют в диагностике ревматического процесса.

Количественная характеристика антител — их

титр — служит критерием активности ревмати-

ческого процесса. Однако, оценивая этот пока-

затель, необходимо всегда помнить, что уровень

антител в крови пациента прямо указывает на

состояние иммунореактивных систем и косвен-

но — на активность патологического процесса.

У больных ревматизмом титры антигиалурони-

дазы достигают 1000 единиц и более. Данные

литературы, а также опыт работы лаборатории

иммунологии I ММИ им. Сеченова указывают,

что больные ревматизмом с высокими функцио-

н а л ь н ы м и показателями иммунокомпетентных

систем хорошо поддаются терапии. Высокие тит-

ры противострептококковых антител и в большей

степени антигиалуронидазы у больных ревма-

тизмом могут служить показанием к назначе-

нию умеренных доз стероидных гормонов.
В трудных дифференциально-диагностических

случаях, когда необходимо оценить характер

лихорадки у больных ревматизмом, значитель-

ное повышение титров антигиалуронидазы поз-

воляет врачу склониться в пользу активации

ревматизма и применить соответствующую тера-

певтическую тактику.

Л и т е р а т у р а . Иоффе В. И. Иммуноло-

гия ревматизма.— Л., 1962; Лямперт И. М.

Серологические методы исследования.— М.,

1962; МРТУ-42 № 136-66 на стрептококковую

гиалуронидазу. Наставление по применению

стрептококковой гиалуронидазы для определе-

ния антигиалуронидазы в сыворотках боль-

ных.— М., 1966; Сачков В. И., Кузнецова Н. И.,

Анохин В. Н., Токмачев Ю. К- Иммунологи-

ческие методы изучения реактивности при рев-

матизме.— В кн.: Вопросы ревматизма. М.:

Медгиз, 1961, с. 34—48.

6.4.  Р Е А К Ц И И  П Р Е Ц И П И Т А Ц И И

6.4.1. С-реактивный белок

Унифицированный метод кольцепреципита-

ции в капиллярах.  П р и н ц и п . Сыворотка кро-

ви, экссудат или асцитическая жидкость, содер-

жащие белок острой фазы — С-реактивный

протеин, образуют хлопьевидный преципитат

при взаимодействии со специфической преципи-

тирующей иммунной сывороткой к этому анти-

гену.

П р и б о р ы и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Стек-

лянные капилляры (комплектуются в наборе

с антисывороткой). 2. Штатив — брусок пласти-

лина.

Р е а к т и в ы . Антисыворотка к С-реактив-

ному белку (предприятие по производству бакте-

рийных препаратов Московского научно-иссле-

довательского института вакцин и сывороток

им. И. И. Мечникова).

И с с л е д у е м ы й  м а т е р и а л . Сыворот-

ку крови получают обычным путем из 0,5 мл

крови. Можно набирать в отдельный капилляр

из пальца или уха и отслоившуюся сыворотку

отламывать, отбрасывая оставшиеся в другом

конце капилляра форменные элементы. Подоб-

ный метод мы рекомендуем для получения сыво-

ротки из малых объемов крови при радиальной

иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезе, методе

Оухтерлони и других методах с необходимым

объемом исследуемого материала 2—5 мкл. Се-

розную цереброспинальную жидкость набирают

предварительно в пробирку, а из нее в капилляр.

Необходимо следить, чтобы жидкость была про-

зрачной, без примеси крови.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Постановка реак-

ции. Стеклянный капилляр берут посередине

двумя пальцами и, держа под углом 40—45 °,

опускают концом во флакон с антисывороткой,

набирая ее на '/з длины капилляра (3 см).

Капилляр протирают ватой и опускают тем же

концом в исследуемую сыворотку или серозную

жидкость (последние набирают также на

'/з длины капилляра — 3 см).

Капилляр протирают ватой (при заполне-

нии капилляра не должно быть воздуха между

реагентами). Затем капилляр, заполненный на

/з длины, покачивают, перемещая жидкость от

одного его конца к другому, вследствие чего

реагенты перемешиваются (необходимо произ-

вести 10—12 таких перемещений жидкости).

Перед установлением капилляра в штатив

следует наклонить его с тем, чтобы конец, через

который набирали сыворотку, был свободен на

15 мм. Затем этот конец капилляра погружают

в пластилин так, чтобы уровень жидкости в нем

был выше поверхности пластилина на 10 мм

(сыворотка находится на воздушном столбике).

Чтобы не вылить содержимое капилляра при

фиксации, его следует держать горизонтально,

а штатив вертикально. Реакция проходит при

комнатной температуре. Предварительный учет

результата реакции производят через 4 ч, после

чего капилляр со штативом оставляют на сутки

при комнатной температуре или ставят на то же

время в холодильный шкаф (температура от
2 до 8 °С).

Через 24 ч производят окончательный учет

результата реакции. Выпадение преципитата

(хлопья, осадок) в капилляре указывает на на-

личие С-реактивного белка в исследуемой сыво-

ротке или серозной жидкости.

Оценка реакции. Наличие преципитата в ка-

пилляре высотой 1 мм оценивают одним ( + )

крестом — реакция слабоположительная; пре-

ципитат высотой 2 и 3 мм оценивают соответ-
ственно двумя (++) и тремя (+ + +) кре-

стами — реакция положительная; преципитат

высотой 4 мм и более оценивают четырьмя

( + + + +) крестами — реакция резко поло-

жительная (количество преципитата учитывают
по всему капилляру).

291

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Белок ост-

рой фазы неспецифичен для какого-либо опре-

деленного заболевания, но характерен для ост-

рого воспалительного процесса и может служить

признаком активности.

6.4.2. Циркулирующие

иммунные комплексы

Метод преципитации с 3,5 % раствором по-

лиэтиленгликоля ПЭГ-тест ОП280.  П р и н ц и п .

Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен

осаждать из сыворотки агрегированные иммун-

ные глобулины и иммунные комплексы. Измене-

ние плотности раствора регистрируется на спек-

трофотометре при длине волны 250 нм.

Различные концентрации ПЭГ (2,5; 3,5; 7 и

даже 10 %) вызывают преципитацию различных

по молекулярной массе и размерам иммунных

комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаж-

дают комплексы крупных размеров, высокие

концентрации вызывают преципитацию низко-

молекулярных соединений. 3,5 % ПЭГ флокку-

лирует наиболее распространенные «промежу-

точные» комплексы средних размеров.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Про-

бирки химические и центрифужные. 2. Пипетки.

3. Центрифуга высокооборотная с ускорением

не менее 2000 g. 4. Спектрофотометр.

Р е а к т и в ы . 1. Буфер боратный 0,1 М,

рН 8,4. 2. Полиэтиленгликоль (мол. м. 6000).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Готовят 7 % рас-

твор полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном

буфере рН 8,4. 200 мкл исследуемой сыворотки

смешивают с 5 мл боратного буфера указанной

концентрации; 4 мл этой смеси приливают к 4 мл

7 % раствора полиэтиленгликоля (конечная

концентрация 3,5 %). Пробирку ставят в холо-

дильник при 4 "С на 18—20 ч. После инкубации

смесь центрифугируют при 2000 g 10 мин. Надо-

садочную жидкость удаляют. Преципитат два-

жды отмывают 3,5 % раствором ПЭГ и раст-

воряют затем в 5 мл 0,1 н. раствора едкого

натра.

Уровень циркулирующих иммунных комплек-

сов (ЦИК) измеряют на спектрофотометре при

280 нм и выражают в единицах оптической

плотности.

Учитывают только те показатели, которые

превышают величину X + 2S здоровых лиц.

6.4.3. Иммунные глобулины

Одномерная радиальная иммунодиффузия в

агаровом геле для определения иммуноглобу-

линов.  П р и н ц и п . Антиген, внесенный в лунку

агарового слоя, содержащего специфические

антитела, диффундируя в агаре, образует коль-

цо  п р е ц и п и т а ц и и . Диаметр колец увеличивается

до тех пор, пока весь внесенный в лунку антиген

не будет связан содержащимися в геле анти-

толами. Величина преципитата отражает коли-

чество антител в геле, эквивалентное концентра-

ции антигена, внесенного в лунку. Площадь

преципитата, или квадрат диаметра кольца,  п р я -

мо пропорциональна количеству внесенного в

лунку антигена и обратно пропорциональна кон-

центрации антител в агаре. При этом между

концентрацией испытуемого антигена и пло-

щадью преципитата имеется линейная зависи-

мость. Как показали исследования  M a n c i n i

и соавт.,  п р я м а я пропорциональность между

площадью преципитата (или квадратом диа-

метра) и концентрацией антигена устанавлива-

ется лишь после прекращения роста колец. Это

время различно для разных антигенов и зависит

от их молекулярной массы. Так, при одной и той

же концентрации рост колец преципитации пре-

кращается для белков Бенс-Джонса через 24 ч,

IgG — через неделю, a IgM — через 10 дней.

Уже через 1 ч после начала диффузии можно

получить линейную зависимость между диамет-

ром колец преципитации и логарифмом кон-

центрации. Fahey и McKelvey (1965) предло-

жили односуточную инкубацию. В этом случае

линейная зависимость устанавливается  л и ш ь

в небольшом диапазоне концентраций.

Однако использование односуточной инкуба-

ции более удобно в практической работе. Поэ-

тому все дальнейшее описание метода радиаль-

ной иммунодиффузии относится к этому вари-

анту.

П р и б о р ы и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Стек-

ла 9 X 12 см. 2. П-образная рамка  1 2 0 Х 9 0 Х

X 8 мм и толщиной 1 мм для облегчения заливки

стекла агаром (при определенном навыке агар

можно заливать непосредственно на стекло).

3. Водяная баня на 50—-60 °С. 4. Автомати-

ческая пипетка вместимостью 2 мкл или пасте-

ровские пипетки с оттянутым концом. 5. Влаж-

ная камера. 6. Измеритель. 7. Миллиметровая

линейка.

Р е а к т и в ы . 1. Моноспецифические сыво-

ротки к иммуноглобулинам А, М и G (выпускают

в СССР, ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, ИЭМ в

г. Горьком и Институте биологических препа-

ратов им. И. И. Мечникова, Москва). 2. 3 %

агар «Дифко» (США) или «Серва» (ФРГ),

дальневосточный агар, предварительно очищен-

ный ' в 0,2 М вероналовом буфере, рН 8,56.

Навеску 3 г сухого очищенного агара заливают

50 мл дистиллированной воды и ставят на не-

большой огонь, постоянно помешивая в течение

40 мин, затем добавляют 50 мл 0,2 М веронало-

вого буфера рН 8,56 и доводят на огне до пол-

ного растворения агара (не доводить до кипе-

н и я ! ) . Добавляют 2 мл 1 % раствора мертио-

лата. 3. Вероналовый буфер 0,2 М, рН 8,56

(5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистилли-

рованной воды, постоянно перемешивая при

нагревании, добавляют 35,04 г мединала; дис-

тиллированную воду добавляют до 1 л при ох-

лаждении раствора до 20 °С). 4. Окрашива-

ющая жидкость: амидо-черный — 1 г, ледяная

уксусная кислота — 100 мл, дистиллированная

вода — до 1000 мл. Профильтровать. 5. Отмыва-

ющая жидкость: ледяная уксусная кислота —

70 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл.

См. с. 298.

292

Х о д  о п р е д е л е н и я .  Т е х н и к а  п о -

с т а н о в к и  о п ы т а .  Т и т р о в а н и е  а н -

т и с ы в о р о т к и и  в ы б о р  р а б о ч е г о

р а з в е д е н и я . Берут две стеклянные пласти-

ны  9 X 1 2 см, одна из которых смазана гидро-

фобной жидкостью  ( н а п р и м е р , ГК.Ж-94), дру-

гая — тонким слоем агара (каплю горячего ага-

ра растирают на пластине пипеткой, а пластину

прогревают над пламенем). Между этими плас-

тинами устанавливают П-образную рамку тол-

щиной 1 мм и всю систему скрепляют зажи-

мами. Готовят ряд разведений антисывороток

на 0,1 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6.

Так, для исследования сывороточных иммуно-

глобулинов разведения выпускаемых в насто-

ящее время антисывороток могут колебаться

от

 1/10 до 1/60.

Пробирки, содержащие по I мл каждого

разведения антисыворотки, помещают в водя-

ную баню при 56 °С и добавляют в них по 1 мл

растопленного и охлажденного до 56 °С 3 % ага-

ра '. Смесь агара и антисыворотки хорошо пере-

мешивают и быстро выливают в пространство

между пластинами, держа последние под углом

так, чтобы в них не попали пузырьки воздуха.

Начинают с большего разведения антисыворот-

ки, добавляя каждое последующее разведение

после застывания предыдущего. На пластине

можно разместить 4 ряда смеси агара с анти-

сывороткой в объеме 2 мл каждое. После засты-

в а н и я последнего ряда агара снимают зажимы,

рамку и пластинку, смазанную гидрофобной

жидкостью. В каждом ряду, соответствующем

разведению антисыворотки, пробойником дела-

ют лунки, куда с помощью микрошприца до-

бавляют разведения стандартного препарата

в объеме 2 мкл. Через сутки  и н к у б а ц и и при

1 С, оценивают результаты. Рабочим разведе-

нием антисыворотки для каждой системы (для

исследования сывороток, секретов и др.) нужно

считать максимальное разведение антисыво-

ротки, дающее со стандартом четкие кольца

преципитации, интенсивность которых доста-

точна для их измерения.

К о л и ч е с т в е н н о е  о п р е д е л е н и е

и м м у н о г л о б у л и н о в в  и с п ы т у е м ы х

п р е п а р а т а х . Растопленный и нагретый до

56 °С 3 % агар в объеме 4 мл смешивают с рав-

н ы м объемом антисыворотки, разведенной веро-

нал-мединаловым буфером 0,1 М до '/2 рабочего

разведения. Эту смесь в объеме 8 мл заливают
в пространство между двумя пластинами, как

описано выше (см. «Титрование антисыворо-

ток»). Пластины с залитой смесью оставляют

на 10 мин при комнатной температуре. После

застывания смеси агара с антисывороткой сни-

мают зажимы,  р а м к у и пластину, смазанную

гидрофобной жидкостью. На каждой пластине

пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм

на расстоянии 15 мм друг от друга. Для того

чтобы предотвратить деформацию периферичес-

ких колец, особенно IgM, за счет подсыхания

агара и появления эндоосмотических потоков

делают по периметру агара дополнительные

лунки. Готовят разведения стандарта, меняя пи-

петки после каждого разведения. Для исследо-

вания сывороточных иммуноглобулинов исполь-

зуют стандартную сыворотку (см. ниже), нераз-

веденную и разведенную до 1:2—1:8. В лунки

микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разве-

дения и испытуемых препаратов. Пластины по-

мещают во влажную камеру и инкубируют сутки

при 4 °С. Через 24 ч (ровно!) пластины погру-

жают в забуференный изотонический раствор

натрия хлорида и отмывают от несвязавшихся

белков в течение 2 сут с троекратной сменой

буфера. Затем пластины сушат под фильтро-

вальной бумагой и окрашивают амидо-черным.

Учет результатов возможен в неокрашенных

пластинах на темном поле с косым освещением,

при этом используют для измерения препарато-

водитель с нониусом, позволяющим измерить

диаметр с точностью до 0,1 мм.

Определив диаметр колец преципитации

в стандартном препарате с известным уровнем

иммуноглобулинов, строят кривую на полулога-

рифмической бумаге, где на оси ординат откла-

дывают концентрацию иммуноглобулинов, а на

оси абсцисс — диаметр колец. Такую кривую-

строят для каждой пластины. Далее, измерив

диаметр колец в испытуемом препарате, опре-

деляют по стандартной кривой концентрацию

иммуноглобулинов в этом препарат.

Ч у в с т в и т е л ь н о с т ь  м е т о д а . Чув-

ствительность метода характеризуется тем мини-

мальным количеством антигена, который доста-

точен для образования измеримого диска пре-

ципитации. Это количество различно для разных

белков и зависит от молекулярной массы анти-

гена. По данным Манчини, для альбумина таким

пределом является 1,25 мкг/мл. По данным

Е. В. Чернохвостовой, при использовании вари-

анта с односуточной инкубацией предельной

концентрацией для IgQ и IgA является 40—

50 мкг/мл, для IgM — 150 мкг/мл. Вместе с тем

пределы чувствительности метода радиальной

иммунодиффузии в геле можно расширить,

увеличивая диаметр колец преципитации. С этой

целью можно пользоваться вместо агара 0,8 %

агарозой или ацетат-целлюлозой. Наиболее про-

стым и распространенным методом является

разведение антисыворотки, поскольку при разве-

дении антисыворотки увеличивается площадь

геля, содержащего антитела, которые необхо-

димы для связывания данного количества анти-

гена, т. е. увеличивается размер преципитата.

1

 Приведена концентрация, пригодная для

большинства серий агара. Для разных серий

необходимая концентрация агара устанавлива-

ется эмпирически.

293

Т а б л и ц а 45. Содержание иммуноглобулинов в стандартных препаратах ВОЗ

и Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР

ВОЗ (67/97)

Институт им. Га-

малея

 2

IgG

МЕ/мл

96,2

143,5

мг/мл

1

8,04

11,52

IgM

МЕ/мл

93,5

126,6

мг/мл'

1,42

1,8

IgA

МЕ/мл

96,2

144,0

мг/мл

1

0,85

1,2

1

 Уровень иммуноглобулинов в весовых единицах — средний уровень, полученный в 10 лабора-

ториях с разными реферанс-антигенами.

2

 Уровень иммуноглобулинов в стандарте Института им. Н. Ф. Гамалеи получен при сравне-

нии со стандартом ВОЗ.

Однако с разведением антисыворотки умень-

шается плотность преципитата и необходимы

дополнительные изменения методики для того,

чтобы этот преципитат можно было измерить.

Так, можно усилить интенсивность колец окра-

шиванием их амидо-черным или нигрозином

с ледяной уксусной кислотой. Плотность преци-

питата можно повысить также с помощью ряда

копреципитирующих факторов. Например, нор-

мальная кроличья сыворотка, используемая вме-

сто буфера для разведения антисыворотки, бу-

дет включаться в комплекс антиген — антитело,

усиливая плотность преципитата. Аналогичный

эффект оказывает дополнительная обработка

пластин антиглобулиновой сывороткой: пласти-

ны после инкубации и отмывки погружают

в раствор антисыворотки, содержащей антитела

к глобулину сыворотки, включенной в агар;

спустя сутки кольца преципитации можно уви-

деть в неокрашенных пластинах.

Наиболее эффективным способом повышения

чувствительности метода радиальной иммуно-

диффузии является использование меченной

 131

 1

антисыворотки. В этом случае агар можно

смешивать с антисывороткой, меченной

 131

 1 в та-

ком разведении, что кольца преципитации ви-

зуально не обнаруживаются, учет результатов

возможен лишь при авторадиографии. Возмож-

на и другая модификация этого метода — обыч-

ная постановка радиальной иммунодиффузии со

столь высокими разведениями антисыворотки,

что кольца преципитации визуально не выявля-

ются. Последующая обработка такой пластины,

меченной

 131

 1 антисывороткой к глобулину сы-

воротки, включенной в агар, и авторадиогра-

фия повышают чувствительность реакции в 32—
64 раза.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь  м е т о д а ра-

диальной иммунодиффузии определяется дли-

тельностью инкубации и наклоном стандартной

кривой. Если результаты учитывают после пре-

кращения роста колец, когда между всеми кон-

центрациями антигена и площадью соответст-

вующих им преципитатов устанавливается ли-

нейная зависимость, то ошибка метода состав-

ляет 2 %. При более короткой инкубации, когда

линейная зависимость между концентрацией ан-

тигена и диаметром колец устанавливается

лишь в небольшом диапазоне концентраций,

294

ошибка метода увеличивается до 10 %. При

этом в зависимости от природы антигена и кон-

центрации антисыворотки меняется наклон стан-

дартной кривой, что также отражается на вос-

производимости метода. При определении IgM,

дающего наименьшие кольца преципитации и

наиболее крутую стандартную кривую по срав-

нению с  д р у г и м и иммуноглобулинами, ошибка

определения составляет 13 %, а при определе-

нии IgG — 10 %.

С т а н д а р т и  т р е б о в а н и я к  н е м у .

Одним из важных условий количественного оп-

ределения иммуноглобулинов является правиль-

ный выбор стандарта, по которому строится

калибровочная кривая. Такой стандарт должен

быть единым, чтобы можно было сравнивать

результаты, полученные в разных лаборато-

риях.

Использование очищенных иммуноглобули-

нов в качестве такого референс-препарата неце-

лесообразно, во-первых, потому, что очищенные

белки менее стабильны при хранении и, во-вто-

рых, потому, что при выделении иммуноглобу-

линов возможны изменения их структуры (рас-

щепление, агрегирование и т. п.) и, следователь-

но, антигенных и диффузионных свойств. Неже-

лательно также использовать в качестве стан-

дарта сыворотки больных парапротеинемически-

ми ретикулезами, так как содержащиеся в  т а к и х

сыворотках IgG и IgM структурно отличаются

от нормальных иммуноглобулинов. Наиболее

целесообразно использовать в качестве стан-

дарта нормальную человеческую сыворотку или

плазму.

Отделение биологической стандартизации

Национального института по медицинским ис-

следованиям в Лондоне выпустило такой стан-

дарт. Он представляет собой плазму 465 здоро-

вых взрослых мужчин-доноров, проживающих

в Англии. Часть этого препарата была исполь-

зована ВОЗ как международный стандарт им-

муноглобулинов G, А, М человека.

В СССР стандартная сыворотка для коли-

чественного определения иммуноглобулинов ме-

тодом радиальной иммунодиффузии выпуска-

ется Институтом эпидемиологии и микробио-

логии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) и Горьков-

ским институтом эпидемиологии и микробиоло-

гии (табл. 45, 46).