Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 74

Т а б л и ц а 46. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке здоровых людей в зависимости

от возраста, мг/100 мл

Имму-

ногло-

булин

IgG

IgM

IgA

Колебание

показателей

Верхний предел

Среднее геометри-
ческое

Нижний предел

Верхний предел

Среднее геометри-

ческое

Нижний предел

Верхний предел

Среднее геометри-

ческое

Нижний предел

1 — 15

сут

1268

852

572

94

11

1

16

сут —

3 мес

656

390

232

69

23

8

107

49

22

4-6

мес

693

392

222

151

71

33

150

85

49

7—12

мес

1199

638

339

161

77

37

157

95

58

13—

24

 мес

1250

789

498

205

85

35

188

92

47

24—

36

 мес

1185

822

570

207

124.

74

128

80

49

4-5

лет

1418

883

550

280

143

73

138

84

51

6-8

лет

1432

967

653

313

182

106

164

102

63

9—11

лет

4746

945

625

461

218

103

143

93

61

12—

16

 лет

1432

944

604

469

258

142

160

91

51

Взрос-

лые

1637

1086

720

538

321

192

182

106

61

Выпускаемые стандарты следует использо-

вать как референс-препараты для калибровки

собственного рабочего стандарта, в качестве

которого может быть использована любая смесь

свежих сывороток от здоровых доноров. Рабочий

стандарт следует сохранять при низкой темпе-

ратуре (— 20 °С и ниже) либо в лиофилизиро-

ванном состоянии.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Относи-

тельная простота исполнения, доступность реак-

тивов способствовали широкому внедрению ме-

тода в клиническую практику. Однако данные

литературы и наш собственный опыт работы

этим методом с сыворотками самых различных

больных в течение более 10 лет позволяют реко-

мендовать ограничение применения этого мето-

да довольно узким спектром нозологических
форм. В первую очередь речь идет о диагности-

ке заболеваний, сопровождающихся синтезом

моноклоновых парапротеинов. Метод радиаль-

ной иммунодиффузии выступает в данной ситу-

ации скрининговым методом, представляющим

патологическую сыворотку для детального ана-

лиза в иммуноэлектрофорезе и др. Высока диаг-

ностическая информативность метода в оценке

первичных и вторичных иммунодефицитов, про-

являющихся блокированием синтеза или врож-

денным отсутствием отдельных классов иммуно-

глобулинов или их всех — тип Брютона. Высо-

кое содержание сывороточных иммуноглобули-

нов А, М, G наблюдается при системной красной

волчанке, болезни Шегрена, хроническом актив-

ном гепатите, ювенильном ревматоидном артри-

те. Причину повышения уровня иммуноглобу-

линов отдельных классов в каждом конкретном

случае необходимо анализировать отдельно и

редко можно связать с определенным заболева-

нием; например, повышение уровня IgA патогно-

монично для особой формы геморрагического

нефрита, при поражениях печени алкогольной

природы, неспецифическом язвенном колите.

Высокие значения IgM характерны для ревма-

тоидного артрита, особенно в начальном, труд-

ном для диагностики, периоде заболевания, при

обострении системной красной волчанки.

При некоторых заболеваниях повышение

уровня IgM сопутствует хронизации процесса.

Уровень сывороточного IgG колеблется в очень

широких пределах при разных заболеваниях.

Повышение его чаще сопутствует активности

процесса. В клинической практике интерпрета-

ция результатов исследования иммуноглобули-
нов должна осуществляться в комплексе с кли-

ническими данными, результатами других имму-

нологических показателей.

Определение иммуноглобулинов в других, не-

жели сыворотка, биологических жидкостях име-

ет большую диагностическую информативность.

Уровень иммуноглобулинов мочи позволяет быть

более объективным в оценке активности почеч-

ного процесса и глубины поражения клубочко-

вого аппарата. Появление IgM в моче крайне

редко и наблюдалось только в тяжелых случаях

волчаночной нефропатии и при амилоидозе. Со-

держание иммуноглобулинов в бронхоальвео-

лярной жидкости при фиброзирующем альвео-

лите коррелирует с глубиной морфологических

изменений альвеолярной мембраны. Уровень

IgG в желчи позволяет дифференцировать

воспалительные заболевания желчевыводящих

путей. Большую роль в диагностике заболеваний

женской половой сферы, изучении причин бес-

плодия играет характеристика иммуноглобули-

нов в шеечном секрете (шеечный фактор).

Л и т е р а т у р а . Малкина Л. А., Шахани-

на К. Л.— Журн. микробиол., 1975, № 3, с. 33;

Стефани Д. В. Иммунология детского возра-

ста.— м., 1981; Чернохвостова Е. В. Количест-
венное определение иммуноглобулинов методом

радиальной иммунодиффузии в геле: Методи-

ческие рекомендации.— М., 1975; Fahey 1.,

McKelvey E. J.  I m m u n o l o g y , 1965,  v o l . 94, p. 84—

102.

6.4.4. Альфа-фетопротеин

Двухмерная иммунодиффузия в геле.

П р и н ц и п и  в о з м о ж н о с т и  м е т о д а .

Исследуемые объекты, содержащие антигены и ан-

295

Рис. 10. Схема постановки метода двойной диффузии в геле для определения а-фетопротеина.

a  с х е м а  с т а н д а р т н о г о  ш т а м п а : диаметр периферических лунок 4 мм. радиус центральной  л у н к и 9 мм; б —

т и п ы  р е а к ц и й ; R  - - с х е м а постановки опыта; AT — кроличья моноспенифическая антисыворотка против

а-фетопротеина человека; АГ — а-фетонротеин; 1,2,3,4 — испытуемые сыворотки; ИР — изотонический

раствор хлорида натрия.

титела, помещенные в гель, диффундируют в его
толще и, взаимодействуя друг с другом, обра-

зуют в зоне эквивалентных количественных со-

отношений  п р е ц и п и т а т ы (рис. 10).

Метод обладает высокой специфичностью,

чувствительностью и разрешающей способно-
стью. Простота исполнения метода позволяет

воспроизвести его в любых лабораториях. Двух-
мерная иммунодиффузия в геле позволяет не

только и (учить композицию биологических мате-

риалов, ни и  к а ч е с т в е н н о и количественно оха-

рактеризовать примеси в высокоочищенных

(с химической точки зрения) препаратах. Ис-

пользуя возможности качественного анализа ме-

тода, можно выявить  м и н и м а л ь н ы е антигенные

различия двух сравниваемых систем (например,
появление в сыворотке или экскретах больных

белков с  и з м е н е н н ы м и антигенными свойст-
вами). Характеризуя количественные сторо-

ны компонентов системы, метод позволяет про-
извести расчеты эквивалентных соотношений

антигена и антител, без чего невозможен

квалифицированный анализ специфически

взаимодействующих белковых компонентов во

всех методах, в основе которых лежит фено-
мен преципитации: от одномерной диффузии

в геле до радиоиммунологического ана-

лиза.

Определение антигена первичного рака пе-

чени и тератобластом в сыворотке и асцити-
ческой жидкости.  П р и н ц и п . Моноспецифи-

ческая антисыворотка, помещенная в лунку

агарового геля, диффундирует в нем. При нали-
чии в исследуемой сыворотке или асцитической

ж и с к о с т и специфического эмбрионального анти-
гена альфа-фетопротеина АФ11 — маркера пер-

вичного (но не вторичного или метастатичес-

кого) рака печени или тератобластомы, он (ан-

г и г е и ) образует в зоне эквивалентных коли-

честв четкий преципитат с антителами антисы-

воротки.

П р и б о р ы и  о б о р у д о в а н и е . Стан-

дартный набор иммунодиапюстикума (ИЭМ им.
Н. Ф. Гамалеи, Москва) в комплекте со штампом

для пробивания лунок.

Р е а к т и в ы . 1. Агар (очищенный и гото-

вый к употреблению). 2. 0,85 % раствор хлорида
натрия, забуференный вероналовым буфером

( н а 85 мл изотонического раствора хлорида

натрия 15 мл буфера, рН 8,4—8,6) -до рН 7,0—
7,2 с консервантом (мертиолат 1:10000).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Подготовка имму-

нодиагностикума: содержимое ампул растворя-

ют в изотоническом растворе хлорида натрия

(объем растворителя указан на этикетке ампу-

л ы ) . Получают слегка опалесцирующий рас-

твор.

П о с т а н о в к а и  у ч е т  р е а к ц и и . Чи-

стую стеклянную камеру подсушивают, проведя
ее несколько раз над пламенем горелки, и поме-

щают на горизонтальную поверхность. В камеру
заливают 23 мл расплавленного 1 % прозрач-

ного агара Дифко на изотоническом растворе
хлорида  н а т р и я рН 7,0—7,2, с мертиолатом

1:10 000 и закрывают покровным стеклом. Через

30—40 мин в застывшем агаре просекают кон-

туры лунок стандартным штампом. Агаровые

пробки отсасывают с помощью трубки, диаметр

которой на 2,5—3 мм меньше диаметра трубок

штампа, и получают  л у н к и с ровными краями.
В каждой камере можно отштамповать 6 фигур

и провести анализ 12 испытуемых сывороток.

В центральную лунку фигуры заливают AT,

а в две периферические, противоположные друг

другу, лунки — AT иммунодиагностикума. Ос-
тавшиеся четыре боковые  л у н к и заливают испы-

туемыми сыворотками и изотоническим раство-
ром хлорида натрия. Реагенты вносят капил-

л я р а м и в  л у н к и вровень с поверхностью агара.

После заполнения лунок реагентами плекси-

гласовую поверхность камеры смазывают тон-

к и м слоем технического вазелина, камеру закры-

вают стеклянной пластинкой и оставляют при
комнатной температуре на 24—48 ч. Перед

регистрацией результатов открытую камеру ре-
комендуется поместить на 1 ч в 10 % раствор

N a C l . Такая обработка способствует исчезно-

в е н и ю непрозрачных ореолов вокруг лунок с ис-

пытуемыми сыворотками, затрудняющих учет

результатов.

296

Р е з у л ь т а т ы  р е а к ц и и оценивают  п о

плюсовой шкале. Реакцию считают положитель-

ной, если  л и н и я преципитации иммунодиагнос-

тикума сливается с линией преципитации, обра-

зованной антигеном испытуемой сыворотки и ан-

тителами иммунодиагностикума. В зависимости

от места слияния полос реакцию считают: слабо-

положительной ( + ). если слияние полос наблю-

дается у  л у н к и с испытуемой сывороткой. Со-

держание альфа-фетопротеина в сыворотке

больного меньше 50 мкг/мл; положительной

( + +), если  л и н и и преципитации иммунодиаг-

ностикума и испытуемой сыворотки находятся

на одинаковом расстоянии от центральной лун-

ки. Содержание альфа-фетопротеина в сыво-

ротке больного 50 мкг/мл; резко положитель-

ной (+ + +), если линия преципитации испы-

туемой сыворотки диффузна и сдвинута в сто-

рону центральной лунки, а линия преципита-

ции иммунодиагностикума резко загибается

в месте  с л и я н и я с линией преципитации сыворот-

ки больного. В некоторых случаях, когда реак-

ция идет в сильном избытке антигена, содержа-

щегося в испытуемой сыворотке, линия преци-

питации этого антигена с антисывороткой не об-

разуется, а  л и н и я преципитации иммунодиагно-

стикума резко обрывается. При таком типе реак-

ции содержание альфа-фетопротеина в сыво-

ротке больного больше 50 мкг/Мл. В этих слу-

чаях необходимо повторно поставить реакцию

с разведенной испытуемой сывороткой и уста-

новить идентичность выявляемого антигена
альфа-фетопротеину иммунодиагностикума; от-

рицательной (—), если  л и н и я преципитации

иммунодиагностикума достигает своими кон-

ц а м и лунок с испытуемыми сыворотками, так

же как и лунок с изотоническим раствором
хлорида натрия.

Диагностическими считают все три описан-

ных типа положительных реакций.

В редких случаях сыворотки больных дают

неспецифическую реакцию с компонентами  и м -

мунодиагностикума. Как правило, это широкий

диффузный преципитат, который образуется при

взаимодействии испытуемой сыворотки как с ан-

тисывороткой, так и с антигеном иммунодиаг-

ностикума. Принципиальное отличие неспецифи-

ческой реакции от специфической заключается

в том, что образующийся преципитат никак не

связан со специфической  л и н и е й преципитации

иммунодиагностикума: он либо пересекает спе-

цифическую  л и н и ю преципитации, либо образу-

ется независимо от нее. При обработке 10 %

раствором NaCI неспецифический преципитат

исчезает совсем или заметно ослабляется.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Выявление

альфа-фетопротеина — высокоинформативный

тест в диагностике гепатом. Он позволяет также

дифференцировать первичные и вторичные гепа-

томы, установить этиологическую причину опу-

холи яичка. Однако в определенных ситуациях

антиген может появляться в сыворотке или

других биологических жидкостях вне связи с ге-

патомой или тератобластомой. АФП нередко

и в высоких  т и т р а х может быть обнаружен

при остром гепатите А. Но при этом заболевании

повторные исследования выявляют нарастание

и последующее снижение (!) уровня антигена

в отличие от гепатомы, когда происходит неук-

лонное нарастание титров. В редких случаях

острого алкогольного гепатита можно выявить

антиген. В подобных ситуациях нарастание тит-

ров АФП отражает, по всей вероятности, актив-

ность процессов регенерации печеночной парен-

химы.  И н ы м и словами, АФП выступает здесь

как косвенный признак цирротической перест-

ройки органа. Наличие антигена в околоплод-

ных водах беременных — достоверный признак

тяжелого врожденного уродства плода, позво-

ляющий рекомендовать прерывание беремен-

ности. Появление альфа-фетопротеина в сыво-

ротке беременных женщин во II и  I I I триме-

стре — физиологическое явление: проникнове-

ние эмбрионального антигена в кровоток бе-

ременной.

Приведенные факты свидетельствуют о необ-

ходимости повторных исследований материала

при выявлении АФП.

Л и т е р а т у р а . Абелев Г. И. и соавт.—

Биохимия, 1963, т. 28, № 4, с. 625—634; Абе-

лев Г. И. и соавт.— Бюл. экспер. биол. мед.,

1971, № 76, с. 475; Наставление по применению

иммунодиагностикума для первичного рака пе-

чени (ПРП) и тератобластом (ТБ).—М., 1977;

Татаринов Ю. С.— Вопр. мед. химии, 1964, т. 10,

№ I, с. 90—91.

6.4.5. Парапротеины

Иммуноэлектрофоретический анализ.

П р и н ц и п . Белки исследуемой биологической

среды, предварительно разделенные в электри-

ческом поле в соответствии с электрическим

зарядом и подвижностью, зависящей от величи-

ны заряда, градиента потенциала и свойств

среды-носителя, проявляются в реакции преци-

питации с антисывороткой, содержащей специ-
фические антитела к исследуемым антигенам.

Метод обладает высокой разрешающей спо-

собностью, несложен в исполнении. Он позво-

ляет получить представление об относительной

концентрации компонентов в системе, опреде-

лить индивидуальный антиген, не выделяя его

из смеси. Изменение физических свойств одного

из компонентов, ведущих к отклонениям в имму-

нологической специфичности, как это наблюда-

ется при гаммапатиях, четко выявляется при

использовании иммуноэлектрофоретического

анализа.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Прибор

для электрофореза ПЭФ-3, выпускаемый заво-

дом «Физприбор» в г. Фрунзе, или для иммуно-

электрофореза УЭФ, выпускаемый эксперимен-

тальными мастерскими Института физиологии

и м . А. Богомольца в г. Киеве. 2. Стекла 9Х 12 см.

3. Пробойник лунок диаметром 1,5 мм. 4. Нож

для прорезания траншей в агаре. 5. Водяная

баня. 6. Эксикатор. 7. Бачки для окрашивания

стекол с агаром и для последующего отмывания.

Р е а к т и в ы . 1. Агар-агар. 2. Вероналовый

буфер 0,05 М, рН 8,6, ионная сила 0,1 (0,05 М

раствор веронала натрия, 0,01 М раствор диэ-

тилбарбитуровой кислоты и 0,05 М раствор

297

ацетата натрия). 3. Краситель (амидо-черный

или кислотный сине-черный). Антисыворотки:

а) поливалентная к сывороточным белкам чело-

века; б) моноспецифические антисыворотки к

различным классам иммуноглобулинов; в) анти-

сыворотки к легким цепям типа каппа (х) и

ламбда (А.). Все перечисленные сыворотки вы-

пускаются в СССР.

Х о д  и с с л е д о в а н и я .  I .  П р и г о т о в -

л е н и е  а г а р а : предпочтительнее использо-

вать готовый к употреблению очищенный и лио-

филизированный бактоагар фирмы «Дифко»

(США) или «Серва» (ФРГ). Если таковых

нет, можно с успехом применять дальневосточ-

ный агар-агар (зарубежные авторы рекомен-

дуют аналогичный дальневосточному японский

агар-агар) после предварительной обработки.

Предлагаем несколько способов очистки

агара.

Способ Клаузена [Clausen, 1970].  А г а р

предварительно отмывают в проточной водопро-

водной воде. После этого набухший агар, отжа-

тый от излишков воды, растворяют при 90 °С

в дистиллированной воде, добавленной из рас-

чета 10 % (по массе или объему) раствора.

К раствору добавляют безводный хлорид каль-

ция из расчета 10 г на 100 г агара для осаждения

примесей. Горячий агар фильтруют через капро-

новое сито или фильтр со стекловатой. После

застывания его режут на маленькие блоки и по-

мещают в широкий сосуд, закрытый капроновой

сеткой, и ставят на 3 дня под проточную водо-

проводную воду, а затем в течение 2 дней промы-

вают дистиллированной водой, 5 раз меняя воду,

взятую в 1000-кратном объеме к объему блоков.

После этого агар вновь расплавляют и фильт-

руют через капроновое сито. Растворы очищен-

ного агара в буфере с добавлением мертиолата

1:100000 готовят из расчета первоначальной

(взятой в обработку) массы или объема агара-

сырца. Готовый агар разливают в маленькие

флаконы, объем которых достаточен для разо-

вого использования, и хранят в холодильнике

при температуре от 4 до 6 °С.

Специальный метод очистки агара [Гра-

бар П., Буртэн П., 1963]. В большой сосуд

(вместимостью 25 л) помещают около 500 г

сухого волокнистого агара и промывают не ме-

нее 1 ч проточной водой при 50 °С и столько же

времени дистиллированной водой при той же

температуре. Затем агар быстро расплавляют

на водяной бане так, чтобы получился 3 % рас-

твор в дистиллированной воде. К этому раствору

добавляют активированный уголь (1 г на 1 л)

и центрифугируют 5 мин при 60 °С. Полученной

прозрачной жидкости дают застыть. Гель разре-

зают на мелкие кусочки и оставляют при — 10 °С

до полного замерзания. После оттаивания гель

отжимают в марле. Волокнистый отжим отмы-

вают дистиллированной водой и снова отжи-

мают, затем расплавляют и смешивают с равным

исходным объемом 0,85 % раствора хлорида

натрия. К охлажденному до 65 °С раствору по-

степенно добавляют горячий спирт до появления
осадка (обычно бывает достаточно 1,1 объема

спирта). Этот первый осадок после центрифуги-

рования при той же температуре отбрасывают.

298

Добавляя к надосадочной жидкости 0,2—0,3

объема горячего спирта, получают белый хло-

пьевидный осадок, хорошо формирующийся при

стоянии при 37 °С. Большую часть опалесциру-

ющей надосадочной жидкости удаляют водо-

струйным насосом, а остаток — центрифуги-

рованием. Осадок промывают абсолютным спир-

том, сушат при 37 °С и растирают. Получают

белый порошок, который хорошо сохраняется

в закрытых банках. Подобный порошок очень

удобен для приготовления любых концентра-

ций геля, прозрачен, пригоден для разделения

крупномолекулярных белков.

П .  З а л и в к а  п л а с т и н . Стеклянные

пластины 9 X 12 см (можно использовать фото-

графические стекла), тщательно вымытые и

обезжиренные, заливают 1 % раствором агара

на вероналовом буфере при 45 °С. Стекла пред-

варительно укладывают на столик с горизон-

тальным уровнем. Для образования слоя агара

толщиной 1 мм на пластину достаточно 10 мл

раствора агара. Для разливки агара удобно

использовать мерную пипетку вместимостью

10 мл, предварительно прогретую. Для образо-

вания ровного слоя геля, избежания неравно-

мерного его подсыхания и засорения поверх-

ности стекла с агаром необходимо закрыть ко-

нической крышкой (чтобы образующийся кон-

денсат не стекал на агар).

I I I .  П о д г о т о в к а  а г а р о в о й  п л а -

с т и н ы  д л я  п р о в е д е н и я  и м м у н о -

э л е к т р о ф о р е т и ч е с к о г о  а н а л и з а .

Исследуемый материал (сыворотка, моча, ла-

важная жидкость, околоплодные воды и т. д.)

помещают в лунки и подвергают электрофорети-

ческому разделению. По окончании электрофо-

реза вырезают траншею, куда вносят соответст-

вующую целям исследования антисыворотку.

Для исследования парапротеинов в сыворот-

ке больных применяют лунки диаметром 2 мм
на расстоянии 3 мм от траншеи, ширина которой

составляет 2 мм и длина 60 мм. Однако необхо-

димо помнить, что в зависимости от концентра-

ции антигена и титра антител антисыворотки

расстояние лунки от траншей может изменять-

ся, его подбирают опытным путем (пробивают

ряд лунок от минимального приближения к

траншее 1 мм, до максимального удаления —

10 мм). Выбирают то расстояние, которое обес-

печило наиболее «контрастный» преципитат.

Лунки пробивают пробойником соответству-

ющего диаметра, а затем агаровую пробу уда-

ляют при помощи водоструйного насоса. Иссле-

дуемую сыворотку вносят в лунку пастеровской

пипеткой. Наполнение лунки контролируют по

исчезновении блика (не переливать!). Заполне-

ние лунки требует определенного навыка. Нали-

чие автоматической пипетки значительно упро-

щает технику внесения образца и повышает

стандартизацию исследования.

Лунки наносят по вертикальной оси стекла,

желательно по трафарету, стабилизирующему

их положение на стекле относительно полюсов

и пробиваемых после проведения электрофореза

траншей. Число лунок определяется количеством