Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 72

Л и т е р а т у р а . Иммунохимический  а н а -

лиз/Под, ред. Л. А. Зильбера.- М., 1968; Лабо-

раторная иммунология/Под ред. О. Б. Вязова.—

М., 1967; Резникова Л. С. Комплемент и его

значение в иммунологических реакциях.— М.,

1967; Бойд У. Основы иммунологии.— М.: Мир,

1969; Kabat E., Mayer М.  E x p e r i m e n t a l  I m m u -

nochemistry. 2 ed., 1964.

6.3.2. Антистрептолизин-О

Унифицированный метод определения в сы-

воротке крови.  П р и н ц и п . Если исследуемая

сыворотка содержит антитела к антигену стреп-

тококка — стрептолизину-О, то добавление по-

следнего к сыворотке способствует специфиче-
скому связыванию антител и отмене феномена

гемолиза эритроцитов, добавленных в качестве
индикатора реакции к той же сыворотке.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Термо-

стат на 37 °С. 2. Пробирки химические. 3. Шта-

тивы.

Р е а к т и в ы . 1. Препарат стрептолизина-О

(предприятие по производству бактериологи-

ческих препаратов Ленинградского научно-ис-

следовательского института вакцин и сыворо-
ток). 2. Фосфатный буфер рН 6,5—6,7. На 1 л

дистиллированной воды добавляют 7,4 г

NaH(PO4)

2

;3,17r KН2PO4; 1,81 г К

2

НРО

4

-2Н2О

и NaOH до рН 6,5—6,7. Хранить буфер в рефри-
жераторе при температуре от 3 до 8 °С. 3. Взвесь

эритроцитов: дефибринированную или взятую

с цитратом натрия кровь кролика или человека

(любой группы) наливают в центрифужные про-

бирки, отмечают уровень крови, центрифуги-

руют и удаляют надосадочную жидкость. Эри-

троциты троекратно промывают 0,85 % раство-
ром NaCl, добавляют до метки 0,85 % раствор

NaCI, взвесь тщательно размешивают и к 5 мл

такой взвеси добавляют 95 мл фосфатного буфе-

ра рН 6,5—6,7. Взвесь эритроцитов готовят

в день постановки опыта.

4. Сыворотка больных: кровь, взятую из

пальца или локтевой вены в количестве не менее
0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат при 37 °С,
а затем в холодильник. Через 2—24 ч стояния

при температуре от 3 до 8 °С сыворотку отде-

ляют от сгустка, прогревают при 56 °С в течение
30 мин и используют для титрования антител.
Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво-
ротки непригодны для титрования. При титро-

в а н и и антител можно использовать сыворотку
или кровь, смешанную с растворителем.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  1 . Разведением

сывороток. Сыворотки больных разводят фос-

фатным буфером рН 6,5—6,7. А. 1:50—0,1 мл

сыворотки плюс 4,9 мл буфера. Б. 1:250—0,5 мл
из разведения 1:50 плюс 2 мл буфера. В.

1:1000—0,5 мл из разведения 1:250 плюс 1,5 мл

буфера.

2 .  П р и г о т о в л е н и е  с т р е п т о л и з и -

н а - О . Высушенный лиофильным методом
стрептолизин-О непосредственно перед добавле-

нием в пробирки осторожно, не вспенивая, рас-

творяют в фосфатном буфере, рН 6,7—6,5, ис-

ходя из данных, указанных на этикетке. Разве-

денный таким образом препарат стрептоли-

зин-О должен содержать в объеме 0,3 мл одну

рабочую дозу, т. е. то количество стрептолизи-
на-О, которое почти полностью нейтрализуется

половиной международной единицы антистреп-

толизина-О стандарта ГИСК.

3 .  Т и т р о в а н и е  а н т и т е л . Разведен-

ную сыворотку или разведенную надосадочную

жидкость из крови в растворителе и другие

ингредиенты разливают по пробиркам, как это
указано в табл. 43.

Результаты титрования обозначают: плюс

(+) — положительная реакция — отсутствие

гемолиза, в осадке эритроциты; плюс-минус

(±) — сомнительная реакция — частичный ге-

молиз; минус ( —) — отрицательная реакция —
полный гемолиз.

При чтении реакции учитывают последнюю

пробирку, в которой сыворотка еще нейтрали-
зует рабочую дозу стрептолизина-О (0,3 мл).

Гемолиз эритроцитов в этой пробирке должен
отсутствовать. Титр сыворотки выражают чис-

лом единиц антистрептолизина-О в 1 мл.

AEST-O — интернациональная единица ан-

тистрептолизина-О — равна двум условным еди-

н и ц а м антистрептолизина-О, принятым ранее

в Советском Союзе.

В табл. 43 приведено число AEST-O в 1 мл

при нейтрализации стрептолизина-О различ-

ными разведениями сыворотки.

4.  К о н т р о л ь . Пробирки № 12 и 13 служат

. для контроля эритроцитов и стрептолизина-О.

Эритроциты не должны при учете реакции быть

гемолизированы. Стрептолизин-О в дозе 0,3 мл
рабочего разведения должен вызывать полный
гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов.

Унифицированный метод определения в ма-

лом объеме крови.  П р и н ц и п тот же.

Р е а к т и в ы . Растворитель крови: 2,05 г

глюкозы, 0,16 г цитрата натрия, 0,5 г хлорида

натрия, до 100 мл дистиллированной воды,
рН 6,1—6,3.

После автоклавирования к растворителю до-

бавляют мертиолат натрия до концентрации

1:20000, затем равномерно разливают в сте-

рильных условиях по пробиркам и сохраняют

в холодильнике (при температуре от 4 до 8 °С).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Кровь в количестве

0,3 мл, взятую из пальца, смешивают с 2,7 мл

растворителя (на 0,5 мл крови 4,5 мл раствори-

теля). После тщательного перемешивания раз-

веденную в растворителе кровь помещают в хо-

лодильник. На следующий день форменные эле-

менты крови (осадок) удаляют центрифугиро-

ванием, надосадочную жидкость пастеровской
пипеткой отсасывают в другую пробирку, про-

гревают при 56 °С в течение 30 мин, затем про-

бирки плотно закрывают резиновыми пробками

и сохраняют в холодильнике до проведения
опыта. Определение антител в малом объеме

крови может быть Произведено после длитель-

ного хранения (в течение 25 дней) крови, раз-
веденной в растворителе.

Разведение надосадочной жидкости, полу-

ченной из крови в растворителе. Все разведения

надосадочной жидкости, полученной из крови,

287

Т а б л и ц а 43. Схема титрования антистрептолизина-О в сыворотках

Разведение

сыворотки

Доза сыво-

ротки, мл

Фосфатный

буфер рН

6,5 — 6,7, мл

Стрептоли-

зин-О, мл

5 % взвесь

эритроци-

тов, мл

Число интер-

националь-

ных единиц

в 1 мл

1:50

1:250

1:1000

№ пробирки

1

0,4

0,1

0,3

0,2

63

2

0,2

0,3

0,3

0,2

125

3

0,15

0,35

0,3

0,2

165

4

0,1

0,4

0,3

5

0,4

0,1

0,3

6

0,3

0,2

0,3

7

0,25

0,25

0,3

8

0,2

0,3

0,3

Термостат, 15 мин при 37 °С

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Термостат, 1 ч при 37 °С

250

313

413

500

625

9

0,1

0,4

0,3

0,2

1250

10

0,25

0,25

0,3

0,2

2000

11

0,15

0,35

0,3

0,2

3000

Контроль

эрит-

ро-

цитов

12

—

0,8

—

0,2

Кон-

троль

стреп-

толи-

зина-О

13

—

0,5

0,3

0,2

предварительно смешанной с растворителем, де-

лают на фосфатном буфере рН 6,5—6,7. Исход-

ное разведение крови в растворителе 1:10 соот-

ветствует разведению сыворотки 1:20. Исходя из

этого, из надосадочной жидкости готовят сле-

дующие разведения.

A. 1:50 — 1 мл надосадочной жидкости и

1,5 мл буфера.

Б. 1:250 — 0,5 мл надосадочной жидкости,

разведенной 1:50, и № мл буфера.

B. 1:1000 — 0,5 мл надосадочной жидкости,

разведенной 1 : 50, и 1 мл буфера.

Разведенную надосадочную жидкость из кро-

ви в растворителе и другие ингредиенты разли-

вают по пробиркам, как это указано в табл. 43.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Титр анти-

стрептолизина-О до 250 AEST-O в 1 мл обнару-

живается у практически здоровых лиц (титры

антистрептолизина-О приведены в интернацио-

нальных единицах). В связи с этим титр антител

до 250 в 1 мл следует считать в пределах нормы.

Повышенные титры антистрептолизина-О обна-

руживаются при ряде стрептококковых инфек-

ций (скарлатина, ангина, хронический тонзил-

лит, ревматизм, гломерулонефрит и др.). Повы-

шение титра этих антител является показателем

перенесенной стрептококковой инфекции. Осо-

бенно высоких титров достигают эти антитела

при ревматизме и нефрите. Характерной особен-

ностью этих двух заболеваний является обнару-

жение антистрептолизина-О в высоких титрах

(500 AEST-O и выше) с первых дней заболева-

ния, что может быть использовано с целью вспо-

могательного метода диагностики.

288

Определение антистрептолизина-О имеет

особенно большое значение при дифференциа-

ции ревматизма от ревматоидного артрита,

так как при последнем эти антитела, как пра-

вило, обнаруживаются в низких титрах.

Определение антистрептолизина-О может

быть использовано для выявления скрыто про-

текающих форм ревматизма, а также для оценки

степени активности ревматического процесса.

Определение антистрептолизина-О у больных

с целью диагностики ревматизма рекомендуется

производить параллельно определению титра

антигиалуронидазы. Обычно у больных ревма-

тизмом антигиалуронидаза обнаруживается в

высоких титрах (1000 единиц и больше) чаще,

чем высокие титры антистрептолизина-О. Одна-

ко в некоторых редких случаях, при низких

титрах антигиалуронидазы, обнаруживаются

высокие титры антистрептолизина-О.

Л и т е р а т у р а . Анохин В. Н., Черкасо-

ва В. Л.— Лаб. дело, 1964, № 7, с. 406; Лям-

перт И. М. Серологические методы исследова-

ния.— М., 1962: МРТУ-42-139-66. Наставление

по применению сухого препарата стрептолизи-

на-О для определения антистрептолизина-О в

сыворотках больных.— М., 1973.

6.3.3. Антигиалуронидаза

Унифицированный метод определения в сы-

воротке крови.  П р и н ц и п . Специфические

антитела сыворотки больного вступают в реак-

цию с вносимым в нее антигеном — ферментом

гиалуронидазой и ингибируют ее активность,
что проявляется в сохранении сгустка муцина,

образованного гиалуроновой кислотой в кислой
среде.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Термо-

стат на 37 "С. 2. Пробирки химические. 3. Шта-
тивы.

Р е а к т и в ы . 1. Препарат (лиофилизиро-

ванный) стрептококковый гиалуронидазы (про-

изводства Института эпидемиологии и микроби-

ологии им. Н. Ф.  Г а м а л е и АМН СССР).

2. Гиалуроновая кислота. Для приготовле-

ния гиалуроновой кислоты используют пупоч-
ные канатики новорожденных. Освобожденные

от сосудов канатики измельчают до кашицеоб-
разного состояния, взвешивают, заливают двой-

ным объемом дистиллированной воды и поме-

щают на 2—10 ч в холодильник при 3 °С. После

этого смесь нагревают, доводят до кипения,
фильтруют через стеклянную вату и сохраняют
при температуре 3 "С.

При титровании антигиалуронидазы в крови

больных рекомендуется использовать раствор

гиалуроновой кислоты с относительной вязко-

стью, равной 3. С этой целью сопоставляют

время истечения дистиллированной воды и рас-

твора гиалуроновой кислоты при температуре

36—37 °С в вискозиметре Оствальда. Расчет
относительной вязкости раствора гиалуроновой

кислоты производят следующим образом. На-

пример, время истечения гиалуроновой кислоты

равно 27 с, а время истечения воды — 9с, следо-

вательно, относительная вязкость раствора гиа-

луроновой кислоты равна 3 (27:9). В том слу-

чае, если эта величина больше 3, следует рас-
твор развести дистиллированной водой до нуж-

ной вязкости и в качестве рабочей дозы взять

0,3 мл.

При отсутствии вискозиметра Оствальда за

рабочую дозу гиалуроновой кислоты принимают

ту дозу, которая при подкислении жидкости

уксусной кислотой образует отчетливый сгусток
при полном просветлении среды. Рабочая доза

гиалуроновой кислоты обычно равна 0,3 мл.

В том случае, если рабочая доза гиалуроновой
кислоты больше 0,3 мл, она не может быть  п р и -

менена для титрования гиалуронидазы. Опреде-

ление рабочей дозы гиалуроновой кислоты сле-

дует производить перед каждым титрованием

гиалуронидазы. При использовании гиалуроно-

вой кислоты, вязкость которой неизвестна, необ-
ходимо в каждом опыте в качестве контроля

титровать сыворотку с известным титром анти-

гиалуронидазы.

Приготовление 15 % раствора уксусной ки-

слоты: 15 мл ледяной уксусной кислоты х. ч.

прибавляют к 85 мл дистиллированной воды.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Обработка сыво-

ротки больных и крови с растворителем. При

титровании антител можно использовать сыво-
ротку или кровь, смешанную с растворителем.

А. Сыворотка больных: кровь, взятую из

пальца или из локтевой вены в количестве не ме-
нее 0,5 мл, ставят на 15 мин в термостат, а затем

в холодильник. Через 2—4 ч стояния при темпе-
ратуре от 3 до 8 °С сыворотку отделяют от сгуст-

ка, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и ис-
пользуют для титрования антител. Хилезные,

гемолизированные и проросшие сыворотки не-

пригодны для титрования.

Разведение сывороток. Сыворотки больных

разводят 0,85 % раствором хлорида натрия:

1) 1:50—0,1 мл сыворотки и 4,9 мл 0,85 % хло-

рида натрия; 2) 1:250—0,5 мл сыворотки, разве-

денной 1:50, и 2 мл 0,85% хлорида натрия;
3) 1:1000—0,5 мл сыворотки, разведенной 1:250,

и 1,5 мл 0,85 % хлорида натрия.

Б. Кровь с растворителем: для приготовле-

ния растворителя крови к 100 мл дистиллиро-

ванной воды добавляют 2,05 г глюкозы, 0,16 г
нитрата натрия и 0,5 г хлорида натрия рН 6,1 —

6,3. После автоклавирования к растворителю

крови добавляют мертиолат до концентрации

1:20 000, з'атем равномерно в стерильных услови-

ях разливают по пробиркам и сохраняют в холо-
дильнике при температуре от 4 до 10 "С.

Кровь в количестве 0,3 мл, взятую из пальца,

смешивают с 2,7 мл растворителя (на 0,5 мл
крови 4,5 мл растворителя). После тщательного

перемешивания разведенную растворителем
кровь помещают в холодильник. На следующий

день форменные элементы крови (осадок) уда-
ляют центрифугированием, надосадочную жид-

кость пастеровской пипеткой отсасывают в дру-

гую пробирку, прогревают при 56 °С в течение

30 мин, затем пробирки плотно закрывают рези-

новыми пробками и сохраняют в холодильнике

до проведения опыта. Определение антител в ма-

лом объеме крови может быть произведено после

длительного хранения (в течение 25 дней) крови,

разведенной растворителем.

Разведения надосадочной жидкости, полу-

ченной из крови с растворителем. Все разведе-
ния надосадочной жидкости, полученной из кро-

ви, предварительно смешанной с растворителем,

делают на 0,85 % растворе хлорида натрия.

Исходное разведение крови в растворителе 1:10

соответствует разведению сыворотки 1:20.

Исходя из этого, из надосадочной жидкости

готовят следующие разведения:

а) 1:50—1 мл надосадочной жидкости и

1,5 мл 0,85 % хлорида натрия;

б) 1:250—0,5 мл надосадочной жидкости,

разведенной 1:50, и 2 мл 0,85 % хлорида натрия;

в) 1:1000—0,5 мл надосадочной жидкости,

разведенной 1:250, и 1,5 мл 0,85% хлорида
натрия.

Приготовление раствора стрептококковой ги-

алуронидазы: высушенный лиофильным мето-

дом препарат стрептококковой гиалуронидазы

перед добавлением в пробирки растворяют в
изотоническом растворе натрия хлорида, как это

указано на этикетке. Разведенный таким обра-

зом препарат должен содержать в объеме 0,2 мл

одну опытную дозу, т. е. то количество гиалуро-

нидазы, которое нейтрализуется одной единицей

рабочего стандарта антигиалуронидазы ГКИ.

Т и т р о в а н и е  а н т и т е л . Разведенную

сыворотку или разведенную надосадочную жид-

кость из крови в растворителе и другие ингреди-

енты разливают по пробиркам (табл. 44).

П р и м е ч а н и е . Общий объем ингредиен-

тов в пробирке равен 1 мл, он слагается из

10 п/р В. В. Меньшикова

289

Таблица 44. Схема титрования антигиалуронидазы в сыворотках или в надосадочной жидкости

количества сыворотки больного, гиалурони-

дазы, гиалуроновой кислоты и 0,85 % рас-

твора NaCl.

Результаты титрования обозначают: плюс

( + ) —положительная реакция — сгусток и

просветление среды; плюс и минус (±) — сом-

нительная реакция — хлопья и нити; минус

( —) — отрицательная реакция — мутная среда

без сгустка.

Титр сыворотки выражают числом единиц

антигиалуронидазы (AEHyS) в 1 мл сыворотки.

За 1 AEHyS принимают то минимальное ко-

личество сыворотки, которое нейтрализует одну

опытную дозу гиалуронидазы.

В табл. 44 приведено число AEHyS в 1 мл при

нейтрализации стрептококковой гиалуронидазы

различными разведениями сыворотки.

К о н т р о л ь . 1. Пробирки № 12, 13 служат

для контроля гиалуроновой кислоты и гиалуро-

нидазы. Гиалуроновая кислота при учете реак-

ции при подкислении уксусной кислотой должна

образовать полный сгусток. Гиалуронидаза дол-

жна разрушать гиалуроновую кислоту, которая

при этом 'теряет способность образовывать

сгусток при добавлении уксусной кислоты.

2. Для контроля условий опыта используют

эталон стрептококковой антигиалуронидазы,

2 ампулы которой вложены в коробку со стреп-

тококковой гиалуронидазой.

Содержимое ампулы с эталоном разводят

1:50, растворяя его в 10 мл изотонического рас-

твора, и титруют одновременно с сыворотками

больных (см. табл. 44). Результаты титрования

сывороток могут быть учтены, если титр эталона

соответствует указанному на этикетке или откло-

няется на ± одно разведение. В последующих

опытах при отсутствии эталона для контроля

можно использовать одну из сывороток боль-

ных, титр которой был установлен по эта-

лону.

Унифицированный метод определения в ма-

лом объеме крови.  П р и н ц и п тот же.

Р е а к т и в ы . Растворитель (модифициро-

ванный раствор Олсвера — Эйнсли): глюко-

за— 2,05 г, нитрат натрия — 0,16 г, хлорид

натрия — 0,5 г, дистиллированная вода —

100 мл, рН 6,1. Раствор автоклавируют, добав-

ляют мертиолат (1:20000) и разливают в про-

бирки.

О б р а б о т к а  к р о в и  б о л ь н ы х . Опре-

деленный объем цельной крови больных, взятой

из пальца пипеткой, смешивают с растворите-

лем (на 0,1 мл крови 0,9 мл растворителя).

После тщательного перемешивания смесь поме-

щают в холодильник при 5—10 °С. На следую-

щий день ее центрифугируют и удаляют осадок.

Надосадочную жидкость прогревают при 56 °С

в течение 30 мин.

Исходное разведение крови в растворителе

1:10 соответствует разведению сыворотки 1:20.

Дальнейшее разведение сыворотки делают на

изотоническом растворе хлорида натрия (см.

раздел «Разведение сывороток»).

Определение антигиалуронидазы — см.

табл. 44.

О ц е н к а  п о л у ч е н н ы х  р е з у л ь т а -

т о в . Титр антигиалуронидазы до 300 единиц

(AEHyS) обнаруживают у практически здоро-

вых людей. Активность фермента, не превы-

шающая эти цифры, считается нормой.

290