Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 71

Т а б л и ц а 42. Схема реакции

Разведение 1

Сыворотка 1:5, мл

Фосфатно-солевой буфер, мл

№ пробирки

1

5

0,2

—

2

10

0,2

0,2

3

20

—

0,2

4

40

—

0,2

5

80

—

0,2

6

160

—

0,2

7

320

—

0,2

8

640

—

0,2

9

1280

—

0,2

10

2560

—

0,2

—

0,2

0,2

Из каждой пробирки, начиная со 2-й, последовательно переносят по 0,2 мл в следующую

пробирку; из 10-й пробирки 0,2 мл выливают

О с н о в н о й  о п ы т  ( т и т р о в а н и е

и с с л е д у е м ы х  с ы в о р о т о к ) .  1 . Готовят

последовательные двойные разведения исследу-

емой сыворотки фосфатно-солевым буфером в

объеме 0,2 мл, учитывая исходное разведение

1,5.

2. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл 0,5 %

сенсибилизированных бараньих эритроцитов.

Разведения, схему реакции см. в табл. 42.

3. Таким же образом для контроля ставят

реакцию с сывороткой клинически здорового че-

ловека и с сывороткой больного с известным

высоким титром.

4. Пробирки встряхивают и помещают в

холодильник при 4 °С на 18 ч. На другой день

оставляют их на полчаса при комнатной темпе-

ратуре и макроскопически учитывают наличие

агглютинации. Для обозначения интенсивности

агглютинации пользуются системой четырех

плюсов. В реакции гемагглютинации определя-

ется конечное разведение исследуемой сыворот-

ки, дающее положительный результат агглюти-

нации на 1 +.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Наличие

агглютинации до титра 1:20 считается нормой.

Реакция с титром 1:40 и выше—положитель-

ная.

И с т о ч н и к и  о ш и б о к .  1 . Плохая кон-

сервация эритроцитов барана.

2. Несоблюдение правил при сенсибилиза-

ции эритроцитов.

3. Неполная инактивация исследуемой сы-

воротки.

Л и т е р а т у р а . Иммунохиминеский ана-

лиз. Под ред. Л. А. Зильбера.— М., 1968;

Методические указания по применению унифи-

цированных клинических лабораторных методов

исследований.—М., 1973, с. 149—153.

Унифицированный метод определения ревма-

тоидного фактора в сыворотке крови капельной

латекс-глобулиновой пробой (латекс-тест в мо-

дификации Сперанского).  П р и н ц и п . Ревма-

тоидный фактор, находящийся в сыворотке

больных, обладает свойством вступать в реак-

цию преципитации с инактивированным челове-

ческим гамма-глобулином, адсорбированным на

нейтральных частицах латекса.

Р е а к т и в ы 1. Латекс СКИ-3 — полисти-

роловые частицы величиной 0,8 мкм. Срок хра-

нения 1 год. Диагностикум латексовый для об-

наружения ревматоидного фактора (каунасское

предприятие бактерийных препаратов). 2. Гам-

ма-глобулин (готовый препарат 10 % гамма-

глобулина). Хранить при 2—8 °С. 3. Глициново-

боратный буфер: борная кислота — 3,1 г, гли-

цин — 7 г, хлорид натрия — 8,5 г, дистиллиро-

ванная вода — до 1 л; рН 8,2. Хранить в холо-

дильнике при 2—8 °С. Срок хранения 1 мес,

Х о д  о п р е д е л е н и я . Постановке основ-

ного опыта предшествует подготовительная ра-

бота.

1. Приготовление латекс-глобулинового

реагента: 10 % готовый препарат гамма-глобу-

лина инактивируют при 60 °С 15 мин или при

56 °С 30 мин. Затем разводят изотоническим

раствором натрия хлорида до 1 % концентрации

(1 мл 10% гамма-глобулина и 9 мл изотони-

ческого раствора).

Латекс разводят в дистиллированной воде из

расчета 1:30 (1 мл латекса и 29 мл дистиллиро-

ванной воды). Полученную взвесь тщательно

взбалтывают. К 30 мл суспензии латекса

добавляют 24 мл прогретого и разведенного

1 % гамма-глобулина (5 мл латекса и 4 мл

гамма-глобулина).

Суспензию латекса и гамма-глобулина

тщательно смешивают перевертыванием пробир-

ки и оставляют в термостате при температуре

37 °С в течение 30 мин, периодически перемеши-

вая. Затем добавляют 3 мл раствора челове-

ческого альбумина (100 мг сухого альбумина

растворяют в 10 мл изотонического раствора

хлорида натрия), оставляют на 30 мин при ком-

натной температуре и на 18 ч в холодильнике,

после чего смесь фильтруют через тонкий слой

гигроскопической ваты и суспензия готова.

2. Обработка исследуемой сыворотки: кровь,

взятую из пальца или из локтевой вены больных

в количестве не менее 1 мл, ставят на 1 ч в термо-

стат. Затем сыворотку отделяют от сгустка,

центрифугируют 20  м и н при 1000 об/мин, осто-

рожно отсасывают сыворотку и инактивируют

ее на водяной бане 56 °С в течение 30 мин.

Хилезные, гемолизированные и проросшие сыво-

ротки непригодны для использования.

283

Х о д  о п р е д е л е н и я . Сыворотку иссле-

дуемого больного разводят в 20 раз глициново-

боратным буфером (0,1 мл цельной сыво-

ротки и 1,9 мл буфера). 0,2 мл разведенной

сыворотки наносят на предметное стекло и до-

бавляют пастеровской пипеткой 1 каплю латекс -

глобулинового реагента (сенсибилизированной

суспензией латекса). После тщательного пере-

мешивания стеклянной палочкой смесь оставляют

на 3 мин, затем осторожно покачивают стекло

в течение 10—15 с. Окончательный результат

учитывают через 5—6 мин в проходящем свете

от настольной лампы.

Параллельно проводят исследование суспен-

зии латекса со стандартной положительной

и отрицательной сыворотками для контроля

годности реагентов.

При количественной постановке пробы гото-

вят различные разведения сыворотки— 1:20,

1:40, 1:80 и далее. Пробу ставят указанным

выше способом.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в  р е а к ц и и .

Реакцию считают положительной, если наблю-

дается агглютинация частиц латекса. Величину

реакции учитывают в плюсах: 4 плюса — все

частицы агглютинированы, раствор прозрачен;

3 плюса — 1/4 частиц агглютинированы, рас-

твор прозрачен по краю; 2 плюса — 1/2 час-

тиц агглютинирована, раствор мутноватый;

1 плюс — слабая агглютинация, раствор мут-

ный.

Н о р м а . Проба положительная при титре

1:20. При положительном результате в более вы-

соких титрах оценка производится согласно

титру.

И с т о ч н и к и  о ш и б о к .  1 . Потеря пре-

ципитирующей способности частиц при длитель-

ном их хранении. 2. Испортившаяся при долгом

или неправильном хранении контрольная сыво-

ротка. 3. Грязная, плохо обезжиренная посуда.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Ревма-

тоидный фактор выявляется часто при ревмато-

идном артрите. Величина титра коррелирует

с активностью процесса. В то же время отсут-

ствие ревматоидного фактора в сыворотке не мо-

жет служить основанием для изменения клини-

ческого предположения. Существуют сероне-

гативные формы ревматоидного артрита. «Рев-

матоидная активность» фактора может быть

секвестрирована в иммунных комплексах и быть

выявлена после их диссоциации.

Ревматоидный фактор (факторы) может

быть выявлен и при других заболеваниях.

В высоких титрах он встречается при хрони-

ческом активном гепатите, болезни Шегрена,

в 30 % случаев подострого бактериального

эндокардита, при системных заболеваниях

соединительной ткани. Наличие ревматоидного

фактора даже в низких титрах может быть

информативным при диагностике латентных

форм ревматического процесса.

Л и т е р а т у р а . Механизмы иммунопато-

логии/Под ред. С. Колна, П. А. Уорда,

Р. Т. Мак-Класки.— М.: Медицина, 1983;

Сперанский А. И.— В кн.: Материалы докладов

на научной сессии, посвященной десятилетию

Института ревматизма АМН СССР. М., 1968,

с. 75; Цончев В., Попов П., Коларов С., Карака-

шов А. Лабораторная диагностика ревмати-

ческих заболеваний.— София, 1964.

6.3. РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА

6.3.1. Гемолитическая активность

комплемента

Унифицированный метод определения гемо-

литической активности комплемента по 50 % ге-

молизу.  П р и н ц и п . Комплемент, содержа-

щийся в исследуемой сыворотке, вызывает ге-

молиз сенсибилизированных бараньих эрит-

роцитов в присутствии сыворотки кролика,

иммунизированного бараньими эритроцитами

(гемолитическая сыворотка).

Активность комплемента выражают в гемо-

литических единицах. За одну 50 % гемолити-
ческую единицу комплемента (С

Н 5 0

) принимают

такое его количество, которое вызывает гемолиз

50 % 0,5 мл стандартной суспензии сенсибили-

зированных эритроцитов при 37 °С за 45 мин.

Эта единица условная, величина ее зависит от

Изначально гемолитическая активность

комплемента определялась минимальным коли-

чеством сыворотки, вызывающим лизис 100 %

определенного количества стандартных эритро-

цитов. Однако изучение литической активности

концентрации бараньих эритроцитов, коли-

чества антител, использованных для сенсиби-

лизации, величины рН, ионной силы системы.

В связи с тем что присоединение к иммунному

комплексу первого компонента комплемента

не происходит в отсутствие Са

 + +

 , а для при-

соединения 4-го компонента (следующего за

активацией C1) необходимо наличие Mg

+ +

,

важно строго соблюдать концентрацию этих

веществ в буферных растворах. Необходимо

стандартизировать время реакции, температуру.

Р е а к т и в ы . 1. Гемолитическая сыворотка

(гемолизин). Выпускаются стандартные серии

препарата в ампулах с титром гемолитической

сыворотки, указанным на этикетке. Такие сыво-

ротки имеют длительный срок годности при

комплемента в зависимости от его количества

выявило сигмовидный характер кривой

корреляции, причем полный гемолиз наступает

в широкой зоне верхней части кривой, когда

сенсибилизированные эритроциты малочувстви-

тельны к количественному возрастанию компле-

мента.

284

хранении при температуре 2—8 °С. 2. Эритроци-

ты барана. 3. Веронал-мединаловый буфер.

Состав буфера (в  г р а м м а х ) : 85 — NaCl;

5,75 — веронал; 3,75 — мединал; 0,22—
СаС1

2

-2Н

2

О; 1 — Mg

5

Cl

2

-6H

2

O; pH 7,3—7,8

(6,75 г веронала растворяют в 500 мл горячей

дистиллированной воды, смесь охлаждают до

+ 20 °С, добавляют другие компоненты и дово-

дят дистиллированной водой до объема 2 л.

Буфер хранят при температуре 3—5 °С).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Постановке основ-

ного опыта предшествует подготовительная

работа.

1. Приготовление буфера: в день постановки

опыта к одной части буферного раствора доба-

вить 4 части дистиллированной воды. Разведен-

ный буферный раствор пригоден в течение 12 ч.

2. Обработка исследуемой сыворотки боль-

ного: кровь, взятую из вены больного в коли-

честве 2—3 мл, оставляют на 2 ч при комнатной

температуре, затем центрифугируют 10—15 мин

при 1500 об/мин. Сыворотку осторожно отса-

сывают и исследование проводят в тот же день.

П р и г о т о в л е н и е  г е м о л и т и ч е с -

к о й  с и с т е м ы . Приготовление 3 % взвеси

бараньих эритроцитов: дефибринированную

кровь барана отмывают 3 раза 5—10-кратными

объемами изотонического раствора хлорида нат-

рия, который после третьего отмывания должен

быть бесцветным. Из плотного осадка эритро-

цитов готовят 3 % (по объему) взвесь в изото-

ническом растворе.

С т а н д а р т и з а ц и я  в з в е с и  э р и т -

р о ц и т о в  б а р а н а . Густота взвеси эритро-

цитов барана оказывает значительное влияние

на титр комплемента и поэтому имеет существен-

ное значение. Наиболее точным методом стан-

дартизации эритроцитов является фотометриро-

вание. Используют для этой цели ФЭК М-56.

М е т о д и к а . За 15—20  м и н до начала

исследования включают ФЭК и устанавливают

зеленый светофильтр; 1 мл 3 % взвеси отмытых

бараньих эритроцитов добавляют в пробирку

к 9 мл дистиллированной воды, полученную

лизированную кровь вливают в 10-миллиметро-

вую кювету, в другие две кюветы (такого же

объема) наливают растворитель, т. е. смесь из

1 мл изотонического раствора и 9 мл дистиллиро-

ванной воды.

В левый кюветдержатель ставят кювету с

растворителем, в правый — кювету с лизирован-

ной кровью. Величину оптической плотности

раствора отсчитывают по правой части бара-

бана. Определенной концентрации эритроцитов

соответствует определенный показатель шкалы

оптической плотности. Если 3 % взвесь ба-

раньих эритроцитов приготовлена правильно,

то шкала оптической плотности показывает 0,4.

Если показатель оптической плотности менее

0,4, то к приготовленной взвеси следует добавить

соответствующее графику количество эритроци-

тов. Если же показатель оптической плотности

выше 0,4, то к приготовленной взвеси бараньих

эритроцитов следует прибавить соответству-

ющее количество изотонического раствора хло-

рида натрия (рис. 9).

После приготовления 3 % взвеси эритроци-

тов готовят гемолитическую сыворотку.

Р а з в е д е н и е  г е м о л и т и ч е с к о й

с ы в о р о т к и . Перед опытом ампулу вскры-

вают, содержащийся в ней лиофильный пре-

парат разводят стерильным изотоническим рас-

твором хлорида натрия согласно инструкции.

Гемолитическую сыворотку берут в разведении,

которое в 3 раза превышает ее исходную кон-

центрацию. Так, если титр гемолитической сы-

воротки равен 1:1200, готовят разведение 1:400.

Исходя из необходимого для постановки реак-

ции объема гемолитической системы, отмери-

вают нужное количество гемолитической сыво-

ротки. После этого ампулу запаивают и остаток

гемолитической сыворотки сохраняют до следу-

ющего опыта в холодильнике при 4—8 °С. Толь-

ко после приготовления 3 % взвеси бараньих

эритроцитов и разведения по титру гемолити-

ческой сыворотки можно приступить к приго-

товлению гемолитической системы.

Г е м о л и т и ч е с к а я  с и с т е м а — это

смесь равных объемов разведенной по трое-

кратному титру гемолитической сыворотки и

3 % взвеси бараньих эритроцитов от объема

плотного осадка (100 мл 3 % взвеси и 100 мл

разведенной гемолитической сыворотки: 0,1 мл

гемолитической сыворотки и 99,9 мл изотони-

ческого раствора хлорида натрия).

Смешивание гемолитической сыворотки

(0,1 мл и 99,9 мл изотонического раствора нат-

рия хлорида) с эритроцитами производят по

возможности быстро, причем гемолитическую

сыворотку примешивают к взвеси эритроцитов,

а не наоборот. Смесь выдерживают при 37 °С

в термостате 30 мин для сенсибилизации эрит-

роцитов.

Т и т р о в а н и е  к о м п л е м е н т а . Иссле-

дуемую сыворотку, разведенную 1:10 буферным

раствором, разливают в 2 пробирки: 0,1 и

0,25 мл. Разлитую сыворотку  ( 1 : 1 0 ) доводят

веронал-мединаловым буфером до объема

1,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют

1,5 мл стандартизированной гемолитической

системы.

Одновременно с опытными пробирками ста-

вят контроль на отсутствие гемолиза сенсибили-

зированных эритроцитов: 1,5 мл гемолитической

системы и 1,5 мл веронал-мединалового буфера.

Пробирки встряхивают и помещают в термо-

стат при 37 °С на 45 мин. После инкубации их

охлаждают в рефрижераторе при 2—4 °С в тече-

ние 18—19 ч. На следующий день проводят

фотометрирование надосадочной жидкости из

каждой пробирки (против изотонического рас-

твора хлорида натрия или дистиллированной

воды в контрольной кювете колориметра).

Д л я  у ч е т а степени гемолиза необходимо

использовать шкалу стандартных разведений

лизированных эритроцитов по А. П. Конникову,

которую готовят для каждой партии эритроци-

тов и гемолитической сыворотки, как указано

на с. 286.

Для вычисления 50 % единицы гемолиза

строят калибровочную кривую. Контролем слу-

жит оптическая плотность пробирки № 4 из

шкалы Конникова, которая соответствует 50 %

285

Рис. 9. Кривая стандартиза-

ции взвеси бараньих эритро-

цитов по ФЭК-М. Кювета

10 мл. Светофильтр зеленый.

1 — взвесь бараньих эритроци-

тов (%); II — бараньи эритро-

циты (мл), которые нужно доба-

вить к 100 мл взвеси, чтобы

получить 3 % взвесь; III — изо-

тонический раствор хлорида нат-

рия (мл), который нужно доба-

вить к 100 мл взвеси, чтобы полу-

чить 3 % взвесь.

гемолизу. На оси ординат откладывают вели-

чину оптической плотности, измеренной на

ФЭКе, как контроля, так и исследуемого матери-

ала, и проводят горизонталь, параллельную оси

абсцисс, до пересечения с перпендикулярами,

восстановленными на оси абсцисс в соответ-

ствующих 0,1 и 0,25 разведениях сыворотки.

П р и м е р : пробирка из шкалы Конникова

№ 4, отражающая 50 % гемолиза, соответст-

вует показаниям ФЭК-13.

Результаты исследования: фотометрирова-

ние первой пробирки, которая содержит 0,1 мл

сыворотки, показывает 0,07; второй пробирки,

содержащей 0,25 мл,—0,12. Соединяют эти две

точки и линию соединения продолжают до пере-

сечения с линией 50 % гемолиза. Из точки пере-

сечения опускают перпендикуляр на линию аб-

сцисс, где отмечены показания разведения сыво-

ротки (например 0,25).

Р а с ч е т ведут по формуле: 0,25 мл (1:10):

С

Н 5 0

=1 мл:х.

Гемологическая

система разведе-

ния вдвое, мл

Дистиллирован-

ная вода, мл

Гемолиз, %

№ пробирки

1

0,2

0,8

20

2

0,3

0,7

30

3

0,4

0,6

40

4

0,5

0,5

50

5

0,6

0,4

60

6

0,7

0,3

70

В связи с тем что 0,25 мл — это испытуемая

сыворотка, разведенная 1:10, результат надо ум-

ножить на 10, т. е. в 1 мл исследуемой сыворотки

будет 40 С

Н50

. В сыворотках здоровых доноров

обычно содержится 20—40 гемолитических еди-

ниц комплемента. Уровень комплемента у жен-

щин ниже, чем у мужчин, в пределах 10 %.

286