Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 69

меченных мест пластины соскабливают и элюи-

руют 3 мл 0,1 н. HCI. Определяют светопогло-

щение надосадочной жидкости при длине волны

260 нм.

При налаживании методики рекомендуется

провести определение в калибровочном раство-

ре, содержащем в 1 мл 30—60 нмоль (15—.

30 мкг) ампулированного препарата АТФ, кото-

рый непосредственно наносят на хроматографи-

ческую пластину так же, как и нейтрализован-

ный хлорный экстракт. Эти препараты обычно,

помимо АТФ, содержат также АДФ и АМФ.

Р а с ч е т проводят, исходя из молярных

коэффициентов экстинкции: для АТФ — 14 600,

для АДФ—15000, для  А М Ф — 14700. Если

для хроматографии было взято 0,1 мл нейтра-

лизованного экстракта и окончательный

объем после элюции был 3 мл, разведение

составляет 1:63, поэтому, для того чтобы выра-

зить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо вели-

чину умножить на 4315, для АДФ коэффициент

составляет 4200, для АМФ 4286. Если же для

хроматографии берут 0,05 мл нейтрализован-

ного экстракта, коэффициенты должны быть в

2 раза выше.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : содержа-

ние АТФ 726 + 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ

262±1,2 мкмоль/л, АМФ 4,1 ±1,3 мкмоль/л.

Л и т е р а т у р а . Захаров Н. В., Рубин В. И.

Тонкослойная хроматография нуклеотидов эрит-

роцитов на пластинках силуфол.— Лаб. дело,

1980, № 12, с. 735—738.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е  т о же, что

и в предыдущем методе.

5.8.9. Хлор

Хлор, как и натрий,— внеклеточный элемент,

поэтому их определение имеет аналогичное кли-

ническое значение с той разницей, что физиоло-

гические механизмы поддерживают концентра-

цию натрия в значительно более узких пределах.

Происходит это потому, что натрий — основной

катион внеклеточных жидкостей, на его долю

приходится 92—93 % всех положительных за-

рядов, в то время как главных анионов три:

хлор, бикарбонат и органические кислоты, при-

чем на долю хлора приходится лишь

  2

/з их об-

щего количества. Хотя сумма анионов также

постоянна, как и сумма катионов, но колебания

хлора относительно больше, чем натрия, так как

уравновешиваются изменениями других анио-

нов.

Определение натрия в биологических жид-

костях на пламенном фотометре просто и надеж-

но; для хлора аналогичного метода нет, поэтому

натрий определяют в биохимических лаборато-

риях значительно чаще, чем хлор. Однако в не-

которых случаях, если речь идет об анализе от-

дельных проб в небольших лабораториях, осо-

бенно при исследовании мочи, определение хло-

ра предпочтительнее, так как не требует почти

никакого оборудования. Одновременное опреде-

ление и хлора, и натрия вместе с другими неорга-

ническими ионами плазмы иногда используют

для того, чтобы вычислить содержание органи-

ческих кислот, которое соответствует разности

между суммами неорганических катионов и

анионов.

Хлор чаще всего определяют титрованием,

так как, подобно другим галоидам, Cl ~ образует

плохо растворимые соли с ионами серебра и

ртути. Основная методическая проблема — как

установить конец титрования, т. е. появление

избытка серебра или ртути. Для этого исполь-

зуются электрохимические методы или обратное

титрование, когда ионы хлора осаждаются иона-

ми серебра, а их избыток затем оттитровывает-

ся роданид-ионами, используя в качестве инди-

катора конца титрования соли железа. Однако

практичнее всего прямой метод, при котором

к исследуемому раствору добавляются соли рту-

ти и в осадок выпадает нерастворимая каломель.

Эти методы стали возможны потому, что появи-

лись эффективные индикаторы на ртуть —орга-

нические вещества, ртутные соли которых окра-

шены. Когда весь хлор удален из раствора,

новые порции титранта окрашивают его. На

этом основан унифицированный метод, в кото-

ром в качестве индикатора на ртуть использует-

ся дифенилкарбазон.

Самые перспективные методы определения

хлора аппаратурные, в которых используется

кулонометрическое титрование. Оно заключает-

ся в том, что измеряется количество электри-

чества, необходимое для того, чтобы удалить

весь хлор из раствора. Анализ сводится к тому,

что небольшое количество исследуемой жид-

кости (порядка 0,01—0,02 мл) —плазмы, сыво-

ротки, мочи или пота — разводится буферным

раствором, содержащим соли азотной кислоты.

В раствор погружены три электрода: рабочий,

индикаторный и индифферентный. К рабочему

(серебряному) электроду прилагается положи-

тельный электрический потенциал, в результате

чего через раствор течет ток, количество ко-

торого измеряется специальной электронной

схемой — кулонометром. Атомы серебра на ра-

бочем электроде превращаются в ионы Ag

 +

 , ко-

торые сразу же реагируют с ионами С1-,

в результате чего выпадает нерастворимое хлор-

ное серебро. Когда весь хлор удален из раство-

ра, концентрация в нем резко возрастает;

это улавливается индикаторным электродом,

сигнал с которого останавливает титрование.

Содержание хлора в пробе вычисляется по

формуле Фарадея, которая связывает коли-

чества электрического тока и выделившегося

серебра, потребовавшегося, чтобы связать весь

хлор.

Унифицированный меркуриметрический ме-

тод определения хлора.  П р и н ц и п . Иссле-

дуемая биологическая жидкость титруется

раствором азотнокислой ртути, образующаяся

каломель выпадает в осадок. Когда весь хлор

связан, избыток ионов ртути образует с индика-

тором дифенилкарбазоном темное, сине-лиловое

окрашивание, что служит признаком конца

титрования.

Р е а к т и в ы . 1. Ртуть азотнокислая, раст-

вор 6 ммоль/л. 2 г Hg (N0

3

)

2

-0,5 Н

2

О растворя-

ют в 200 мл воды, добавляют 20 мл 2 н. азотной

275

кислоты и доводят водой до 1 л. 2. Дифенил-

карбазон, спиртовой раствор: 100 мг дифенил-

карбазона растворяют в 100 мл 96 % этилово-

го спирта, хранят в посуде из темного стекла

в холодильнике. Стоек в течение месяца.

3. Азотная кислота, 2 н: 14 мл продажной

концентрированной азотной кислоты (плотность

1,4) разводят в 100 мл воды. 4. Калибровочный

раствор, 10 ммоль/л. Хлорид натрия (поварен-

ная соль) высушивают до постоянной массы

при 120 °С, 584 мг препарата растворяют в воде

и доводят объем до 1 мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Сначала устанав-

ливают величину фактора раствора для титрова-

ния (титранта). Для этого в маленький стакан-

чик или колбочку вносят 2 мл калибровочного

раствора и 4 капли (0,2 мл) раствора фенил-

карбазона, постоянно перемешивая, титруют

раствором азотнокислой ртути до появления

темного окрашивания. Фактор титранта вы-

числяют, разделив 20 (количество микромолей

хлорид-ионов в калибровочной пробе) на число

миллилитров, пошедших на титрование. Фактор

указывает, какому количеству микромолей

хлорид-ионов соответствует 1 мл титранта.

При исследовании опытной пробы поступают

аналогично: в маленький стаканчик или колбоч-

ку наливают 1,8 мл воды и вносят 0,2 мл иссле-

дуемой биологической жидкости, добавляют

4 капли (0,2 мл) раствора дифенилкарбазона и

титруют раствором азотнокислой ртути при

постоянном перемешивании до появления тем-

ной окраски. Удобнее всего перемешивать маг-

нитной мешалкой. На титрование сыворотки

должно пойти примерно 3 мл титранта.

П р и м е ч а н и я . 1. Раствор азотнокислой

ртути можно приготовить из красной окиси

ртути. Для этого 1,3 г HgO растворяют

в 11 мл концентрированной азотной кислоты

и доводят объем водой до 1 л. 2. Раствор

дифенилкарбазона должен быть красно-

оранжевого цвета; если окраска становится

желтой или вишнево-красной, реактив не-

пригоден.
Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : содержа-

ние в сыворотке или плазме 97—108 ммоль/л,

выведение с мочой 150—2500 ммоль/сутки.

Л и т е р а т у р а . Schales D., Schales S.

J. Biol. Chem., 1941, vol. 140, p. 879.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е определе-

ния хлора такое же, как и натрия. Его увеличе-

ние в плазме крови — признак выраженной

дегидратации, уменьшение — признак значи-

тельного избытка воды в организме. Выведение

с мочой увеличивается при спадении отеков,

уменьшается при их развитии.

Р а з д е л 6

МЕТОДЫ  К Л И Н И Ч Е С К О Й ИММУНОЛОГИИ

6.1. ОСОБЕННОСТИ МЕТОДОВ  К Л И Н И Ч Е С К О Й  И М М У Н О Л О Г И И

Широкое внедрение иммунологического

анализа в клинику внутренних болезней,

характеризующее последнее десятилетие, отра-

жает значительные успехи развития иммуно-

биологии. Фундаментальные исследования

функциональных клеточных взаимодействий

в процессе иммунного ответа, развитие концеп-

ции иммунологического надзора, генетических

механизмов детерминации и регулирования
иммунных реакций организма изменили пред-

ставление об иммунитете как о системе защиты,

расширив его роль в сложном механизме адапта-

ции к постоянно меняющимся внешним услови-

ям обитания, в охране генетического постоян-

ства внутренней среды организма. Осмыслива-

ние с этих позиций реакций иммунитета обусло-

вило активное внедрение в клиническую практи-

ку многих новых, в том числе клеточных,

реакций, заставило по-иному взглянуть на став-

шие уже рутинными «старые» методы, совер-

шенствовать их. Были разработаны методы

определения концентрации фракций компле-

мента. Описаны способы выявления прямого,

«классического» и альтернативного путей его

активации. Вновь усилилось внимание к фаго-

цитозу с позиций существующих представлений

о клеточных кооперациях в распознавании

антигена и реализации иммунного ответа, взаи-

модействия его с гуморальными компонентами.

Особый интерес представляют сывороточные

факторы регуляции, значение которых возраста-

ет с установлением их диагностической инфор-

мативности. Новое значение приобретают и не-

специфические факторы реактивности, сыво-
роточные бактериолитические и статические

факторы, система пропердина, лизоцима и т. д.

Число методов иммунологического анализа

очень быстро растет. И клиницисту, и сотрудни-

ку лабораторного подразделения все чаще

приходится останавливаться перед выбором,

решающую роль в котором играет диагности-

ческая информативность того или другого

теста. Такой своеобразно утилитарный подход,

отличающий клиническое использование лабо-

раторных исследований, значительно усложняет

условия проведения анализа и, самое главное,

его интерпретации. В отличие от экспери-

ментальных условий, когда исследователь сам

определяет время введения антигена, знает его
характеристики, строго контролирует условия

проведения реакции, врач-лаборант работает со

сложными биологическими композициями,

взаимосвязь компонентов которых ему недоста-

точно известна, чаще предполагается. Именно

поэтому в условиях клинико-лабораторной

практики должны использоваться высокока-

чественные диагностические сыворотки и препа-

раты. На решение этой проблемы направлено

постановление ЦК КПСС и Совета Министров

СССР о развитии биотехнологии.

Клиническая иммунология развивается на

лучших традициях теоретических исследований.

Однако далеко не всегда можно и нужно

экстраполировать результаты взаимодействия

чистых систем, полученных в условной среде

на таковые в сложных, мало еще изученных

средах целостного организма. Причинно-след-

ственные взаимоотношения, установленные в

эксперименте и прямо перенесенные на больно-

го, могут привести к возникновению серьез-

ных диагностических ошибок и как следствие

этого к неправильному лечению активными

препаратами — иммуномодуляторами, разви-

тию ятрогений.

Методы иммунологических исследований

широко используются специалистами практи-

чески всех клинических дисциплин. Опыт

централизованных клинико-иммунологических

лабораторий указывает, что наибольший удель-

ный вес в их работе занимают исследования

для клиник терапевтического профиля, в кото-

рых создаются отделения иммунопатологии,

иммунодефицитов. Эти патологические состоя-

ния, объединяемые чаще по синдромному приз-

наку, нередко не имеющие четких нозологи-

ческих границ, вызывают необходимость

проведения наибольшего числа иммунологи-

ческих тестов. Правильно подобранный комп-

лекс последних отражает изменение иммунной

реактивности, помогает выявить достаточно

точно характер и уровень этих изменений.

Иммунологические методы при этих заболева-

ниях определенно характеризуют активность

процесса, отражают эффективность применяе-

мой иммунодепрессантной или модулирующей

терапии, но диагностическая информативность

их далеко не равнозначна. При врожденных

(первичных) иммунодефицитных состояниях

значение иммунных показателей определяет

диагноз. При иммунокомплексных заболеваниях

типа системной красной волчанки они могут

подтверждать логику диагностического процес-

са, а при ряде других диффузных заболеваниях

соединительной ткани (системная склеродермия,

277

узелковый периартериит и др.) изменения

иммунных показателей сопровождают пораже-

ние органов и не имеют определенной диагно-

стической информативности. Можно выделить

группу заболеваний неинфекционной этиологии,

развитие которых специфически проявляется в

иммунных реакциях (I группа). Существуют

заболевания, в диагностике которых иммуноло-

гические тесты играют существенную, но не

определяющую роль  ( I I  г р у п п а ) .

Г р у п п а 1. 1. Первичные иммунные дефи-

циты.

2. Парапротеинемии.

3. Гепатома, тератобластома яичка (а-фето-

протеин).

4. Сывороточный НВ гепатит (НВs-антиген).

5. Рак желудочно-кишечного тракта (канце-

ро-эмбриоспецифический антиген).

6. Аутоиммунная гемолитическая анемия.

7. Тиреоидит Хашимото.

Г р у п п а  I I .  1 . Системные заболевания

соединительной ткани (ревматические болезни).

2. Хронический активный гепатит, болезнь

Шегрена.

3. Некоторые болезни почек (иммуно-

комплексный нефрит).

Таким образом, очевидно, что диагности-

ческая информативность иммунологического

анализа ограничена нешироким кругом заболе-

ваний. В то же время применение иммунных

методов позволяет специфически определять

и выделять биологически активные вещества,

играющие определенную роль в патогенезе за-

болеваний, устанавливать эффективность имму-

номодулирующей терапии, объективизировать

обоснованность ее назначения.

В основе иммунной реакции лежит специфи-

ческое взаимодействие антигена с антителом.

Именно оно обусловливает правильность

полученного ответа. Но необходимо строгое

выполнение всех требований к ингредиентам

реакции, технике ее постановки и учета.

Иммунный ответ целостного организма —

это сложная, взаимосвязанная, генетически де-

терминированная система последовательных

реакций. В лабораторной практике при изучении

составных компонентов этой системы истори-

чески сложилось и сохраняется сейчас условное

разделение на гуморальные и клеточные факто-

ры иммунитета. Поэтому в изложении материала

мы будем придерживаться этой  т р а д и ц и и .

6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ

ГУМОРАЛЬНОГО  И М М У Н И Т Е Т А  — Р Е А К Ц И Я  А Г Г Л Ю Т И Н А Ц И И

О б щ и е  п р и н ц и п ы . Агглютинация —

склеивание частиц — носителей  а н т и г е н н ы х де-

терминант антителами, находящимися в реак-

ционной смеси. В результате образуются конгло-

мераты частиц, которые в среде электролита вы-

падают в осадок и становятся видимыми для

глаза. Частицами — носителями антигена могут

быть естественные клетки: клетки крови — эри-

троциты, лейкоциты, реже тромбоциты, бакте-

риальные клетки, а также созданные искусствен-

но: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля

и т. д. Основные требования, предъявляемые

к этим носителям,— возможность прочно при-

соединять антигены и не давать спонтанной

агглютинации. Широкое распространение

(доступность, удобство использования, легкость

учета) в лабораторной практике получило

применение в качестве носителей специально

обработанных эритроцитов (человека или жи-
вотных).

Реакции агглютинации, в которых в качестве

субстрата использованы эритроциты, получили

название реакций гемагглютинации.

6.2.1. Антитела к эритроцитам

Реакция Кумбса.  П р и н ц и п . При наличии

неполных (блокирующих) антител на поверх-

ности эритроцитов исследуемого пациента про-

исходит агглютинация эритроцитов при инкуба-

ции их с антиглобулиновой сывороткой (прямой

тест Кумбса) или с разведениями сыворотки

пациента в реакции с предварительно сенсиби-

лизированными эритроцитами донора (непря-

мой тест).

П о с у д а . 1. Пробирки химические. 2. Па-

стеровские пипетки. 3. Мелкие белые тарелочки.

Р е а к т и в ы . 1. Раствор 5 % цитрата нат-

рия. 2. 0,9 % раствор хлорида натрия. 3. Анти-
глобулиновая сыворотка (сыворотка Кумб-

са) С титром преципитинов не ниже 1:256—

1 :512.

Прямая реакция Кумбса.  Х о д  о п р е д е -

л е н и я . 3 мл крови берут из локтевой вены

исследуемого в одну пробирку с предварительно

внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрия.

Эритроциты трижды отмывают в большом объе-

ме изотонического раствора натрия хлорида

путем центрифугирования при 1500 об/мин, в

течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов го-

товят 5 % взвесь на изотоническом растворе

(1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель

изотонического раствора). На сухую чистую

белую тарелку наносят каплю антиглобулиновой

сыворотки, к ней добавляют каплю 5 % взвеси

эритроцитов исследуемого. Сыворотку переме-

шивают с эритроцитами стеклянной палочкой.

Рядом ставят контроль, используя вместо сы-

воротки изотонический раствор. Каждую новую

серию антиглобулиновой сыворотки ставят ана-

логичным путем со стандартными сенсибилизи-

рованными эритроцитами и с интактными до-

норскими эритроцитами различной группы. Пе-

ремешанные эритроциты с сывороткой слегка

покачивают не более 10 мин.

278