Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 67

этиловом спирте, индикатор с зоной перехода

рН 4,4—6,2. 4. 0,2 н. NaOH. 5. 1,5 н. NaOH.

6. 10 % раствор вольфрамово-кислого натрия:

10 г вольфрамата  н а т р и я  ( N a 2 W O 4 ) растворяют

в воде, объем доводят до 100 мл. 7. 0,67 н. серная

кислота. 8. Калибровочный раствор магния

сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния

(MgSO

4

-7H

2

O) растворяют в воде, объем дово-

дят в мерной колбе до 1 л.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 2  м л воды добав-

ляют 1 мл исследуемой сыворотки и 1 мл 10 %

вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н. серной

кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой,

а затем через 10—15 мин центрифугируют или

фильтруют. В градуированную пробирку или

мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают

2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют кап-

лю индикатора метилового красного и 0,2 н.

NaOH до установления желтой окраски. После

этого прибавляют 1 мл 2 % гидрохлорида гидро-

ксиламина, 1 мл 0,075 % титанового желтого

и 2 мл 1,5 н. NaOH и доводят объем водой до

10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной опти-

ческого пути 1 см при длине волны 500—560 нм

против холостого опыта, в который вместо сыво-

ротки крови берут 1 мл воды.

Для построения калибровочного графика в

серию пробирок вносят от 0,2 до 1 мл калибро-

вочного раствора 1 ммоль/л, доводят водой до

объема 6 мл, прибавляют по 1 мл 2 % гидрохло-

рида гидроксиламина, 0,075 % титанового жел-

того и 2 мл 1,5 н. NaOH. Окраска раствора, в

который добавлено 0,2 мл калибровочного раст-

вора, соответствует содержанию магния в плаз-

ме 0,4 ммоль/л, раствора, в который добавлено

0,5 мл, — концентрации 1 ммоль/л и т. д.

П р и м е ч а н и я . 1. При определении содер-

жания магния в эритроцитах 0,5 мл эритро-

цитарной взвеси, полученной так же, как и

при определении в клетках калия и натрия ',

вносят в 2,5 мл воды, через несколько минут,

когда взвесь просветлеет (станет лаковой),

что свидетельствует о завершении гемолиза,

добавляют вольфрамат натрия, серную кис-

лоту и т. д. аналогично определению в плаз-

ме. 2. Метод пригоден также для определения

м а г н и я в моче. В этом случае ее разводят

водой в 10 или 20 раз (так как концентрация

может сильно колебаться), к 0,5 мл прилива-

ют 5,5 мл воды, по 1 мл растворов гидрохло-

рида гидроксиламина и 0,075 % титанового

желтого, а также 2 мл 1,5 н. NaOH и фото-

метрируют.

Л и т е р а т у р а . Лаб. дело, 1977, № 5,

с. 303—304.

Определение магния по цветной реакции с

магоном.  П р и н ц и п . Магний дает с магоном

(ксилидиловый синий II) яркое окрашивание,

белки сыворотки не препятствуют его развитию.

В связи с тем что на интенсивности окраски ска-

зывается присутствие других катионов, исполь-

зуют комплексный калибровочный раствор.

1

 См. с. 261.

П р и м е ч а н и е . Чехословацкая фирма

«Лахема» выпускает набор реактивов для

работы этим методом.
Р е а к т и в ы . 1. Раствор магона, содер-

жащий 0,28 ммоль/л: 115,4 мг магона при

нагревании растворяют в 50 мл диметилфор-

мамида, объем доводят до 1л 96 % этило-

вым спиртом. 2. 0,02 М боратный буфер рН

9,5: примерно в 800 мл воды растворяют

7,63 г буры (Na

2

B

4

O

7

- 10H

2

O), прибавляют

79 мл 0,1 н. NaOH и проверяют рН, добав-

ляют столько щелочи, сколько необходимо,

чтобы рН был 9,5, после чего водой доводят
объем до 1 л. 3. Рабочий раствор магона. В день

определения смешивают равные части раствора

магона и боратного буфера. Реактив нестоек,

годен в течение одного рабочего дня. 4. Комп-

лексный калибровочный раствор: 200 мг метал-

лического магния в виде стружки промывают

разбавленной НС1, водой, спиртом и эфиром,

высушивают сначала в токе азота, затем под

вакуумом и растворяют в 15 мл концентриро-

ванной НС1, добавляют около 200 мл воды и

2,5 г кальция карбоната (СаСОз), 2,86 г ка-

лия хлорида (КС1) и 65,4 г натрия хлорида

(NaCl); после растворения всех ингредиен-

тов объем доводят водой до 1 л. Получается

раствор, содержащий 200 мг магния в 1 л,

перед употреблением его разводят водой в

10 раз, получается рабочий калибровочный

раствор, содержащий 0,823 ммоль/л магния

(2  м г % ) .

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 4 мл рабо-

чего раствора магона прибавляют 30 мкл

исследуемой сыворотки или спинномозговой

жидкости, перемешивают и фотометрируют в

кювете с длиной оптического пути 1 см при

длине волны 505 нм против холостого опыта,

в который вместо сыворотки берут воду.

Одновременно ставят калибровочный опыт, в

который вместо сыворотки берут 30 мкл рабо-

чего калибровочного раствора, содержащего

0,823 ммоль/л магния. Расчет ведут по пра-

вилу пропорций.

Л и т е р а т у р а . Chromy V., Svoboda V.,

Stepanova I. Biochem. Med., 1973, vol. 7, N 2,

p. 208—217.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : содержа-

ние магния в сыворотке 0,7—1,2 ммоль/л.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е определе-

ния магния в сыворотке ограничено. Повышение

его концентрации бывает при уремии, гипотирео-

зе и диабетическом ацидозе, понижение — при

нарушении всасывания, тиреотоксикозе, хрони-

ческом алкоголизме и альдостеронизме.

5.8.4. Железо

Подавляющая часть всего железа человече-

ского организма находится внутри эритроцитов

и входит в состав гемоглобина. Каждая его

молекула содержит 4 атома двухвалентного

железа, на долю которых приходится 0,334 %

267

ее массы, что при концентрации гемоглобина

в крови 140 г/л соответствует содержанию желе-

за 500 мг/л крови. Определение содержания

железа в цельной крови не имеет практического

значения, так как определять гемоглобин зна-

чительно проще. Иное дело плазма крови, содер-

жание железа в которой примерно в 300 раз

ниже и составляет около 1,5 мг/л. Его большая

часть находится в окисленном состоянии, т. е.

трехвалентна и связана с белком трансферрином

(сидерофилином); кроме того, в плазме имеются

геминовое железо, ферритин и внутрисосуди-

стый гемоглобин. Так называемое гемино-

вое железо входит в состав молекул,

содержащих только по одной порфирино-

вой группе. Это продукты неполного син-

теза или распада гемоглобина и дыхательных

ферментов, они связаны с транспортным сыворо-

точным белком гемопексином. Ферритин — са-

мый богатый железом сывороточный белок, в его

составе находится мицелла, содержащая до

4300 атомов окисленного железа. Молекулы

гемоглобина, образовавшиеся в результате

внутрисосудистого гемолиза, содержат 4 порфи-

риновых кольца, они связываются не с гемо-

пексином, а с гаптоглобином. Разрушение эри-

троцитов и увеличение содержания в плазме

свободного гемоглобина почти неизбежны при

взятии крови. Считается, что при соблюдении

всех предосторожностей (игла с широким про-

светом, свободное вытекание крови, осторожное

отслоение сгустка, центрифугирование в течение

45 мин при 2500 об/мин, отсасывание сыворотки

и повторное центрифугирование) удается умень-

шить количество свободного гемоглобина в

сыворотке лишь до уровня около 30 мг/л, что

соответствует содержанию железа 100 мкг/л или

примерно 1/15 всего железа сыворотки. Исполь-

зуемые при получении плазмы антикоагулянты

сами связывают железо, поэтому рекомендуется

исследовать содержание железа именно в сыво-

ротке.

Железо поступает в организм через желу-

дочно-кишечный тракт, а выводится почти

исключительное калом (конечно, если нет крово-

течения или гематурии), поэтому содержание

его в моче у здоровых очень мало — 0,7—

5,7 нмоль/сут (0,04—0,3 мкг), это количество не

может быть уловлено обычными методами.

После приема некоторых железосодержащих

препаратов или комплексообразователя десфе-

рала, который способствует опустошению депо,

выведение железа с мочой значительно увеличи-

вается и может быть измерено.

Состояние обмена железа лучше всего харак-

теризует количество негеминового сывороточ-

ного железа, т. е. железо трансферрина и фер-

ритина, так как это основной резерв, который

используется организмом в случае необходимо-

сти. Общее количество трансферрина, связан-

ного с железом и свободного, может быть опре-

делено также иммунологическими методами,

определяют и количество свободного трансфер-

рина по его способности связывать радиоактив-

ное железо. Для практических лабораторий,

использующих обычные биохимические методы,

наибольшее значение имеет определение негеми-

нового железа сыворотки, а также ее железо-

связывающей способности, т. е. того максималь-

ного количества трехвалентного железа, которое

может связаться с белками сыворотки.

Прочность комплекса трансферрин — желе-

зо максимальна при рН 7,0 и зависит от природы

буферного раствора. При увеличении кислотно-

сти, а также восстановлении железа комплекс

распадается. Другие соединения, например

гемоглобин, в этих условиях не разрушаются

или разрушаются лишь незначительно, поэтому

кислотноотщепляемое или негеминовое железо

лучше других компонентов плазмы характери-

зует резервы железа в организме. Существует

несколько вариантов методов определения

негеминового железа, в частности некоторые

рекомендуют проводить нагревание на водяной

бане для лучшего разрушения комплекса,

но при этом всегда существует угроза, что раз-

рушатся и другие железосодержащие соеди-

нения, поэтому результаты анализа будут завы-

шенными.

Известно много цветных реактивов как на

восстановленное (Fe

+ +

 ), так и на окисленное

(Fe

+ + +

 ) железо; лучшие результаты получа-

ются с батофенантролином, который образует

наиболее прочный и яркоокрашенный комплекс.

Но батофенантролин нерастворим в воде, поэто-

му его надо предварительно обработать хлор-

сульфоновой кислотой либо использовать спир-

товой раствор. При определении железа после

минерализации с серной кислотой надо всегда

иметь в виду, что почти неизбежно образующая-

ся в этих условиях пирофосфорная кислота,

связывая железо, мешает проведению цветной

реакции, поэтому ее надо разрушать, нагревая

на водяной бане слегка разбавленный минера-

лизат.

У с л о в и я  в з я т и я  м а т е р и а л а . Оп-

ределение сывороточного железа обычно прово-

дят для выявления железодефицитного состоя-

ния, поэтому, как правило, информативно умень-

шение его содержания. Обследуемые по крайней

мере 2 нед перед взятием крови не должны полу-

чать железосодержащих препаратов. Кровь

надо брать широкими иглами, по возможности

новыми. Сыворотка должна быть свободна от

видимых следов гемолиза.

Батофенантролиновый метод определения

железа унифицирован в 1974 г.

Определение железа по цветной реакции с

сульфонированным батофенантролином.

П р и н ц и п . Белки осаждают трихлоруксусной

кислотой, которая при прогревании разрушает

также комплекс железа с трансферрином. Для

установления оптимальной величины рН 4,8—

5,0 добавляют аммония ацетат, а для восстанов-

ления всего железа гидразин. Двухвалентное

железо образует окрашенный комплекс с бато-

фенантролином, который переведен в сульфати-

рованную форму добавлением хлорсульфоновой

кислоты.

Р е а к т и в ы . 1. Трихлоруксусная кислота,

20 %. 2. Аммония ацетат: 70 г ацетата аммония

(СНзСООNН

4

) растворяют в воде, объем дово-

дят до 100 мл. Препарат гигроскопичен. 3. Гид-

разина сульфат, насыщенный раствор, готовят,

268

заливая 2,5 г препарата 100 мл воды. 4. Раствор

сульфонированного батофенантролина: в про-

бирке к 100 мг батофенантролина (4,7-дифенил-

1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсуль-

фоновой кислоты, нагревают на кипящей водя-

ной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают

10 мл воды, после чего снова нагревают на

водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл воды.

Добавляя 5 н. NaOH, устанавливают рН 4,0 и

доводят объем водой до 200 мл. 5. Калибровоч-

ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л.

Сначала готовят раствор соли Мора (железо-

аммиачные квасцы, аммонийжелезо II сернокис-

лое), FeSO

4

- (NH

4

)SO

4

-6H

2

О, содержащий

3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н. НС1 и

доводя объем до 1 л водой, содержащей в 1 л

1 мл концентрированной серной кислоты. Этот

раствор разводят подкисленной водой в 100 раз;

получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л,

или 1,67 мкг/мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 2  м л исследуемой

сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл

20 % раствора трихлоруксусной кислоты, пере-

мешивают и ставят на 15 мин на водяную баню

температуры 90—95 °С. Затем центрифугируют

20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл про-

зрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл

70 % раствора аммония ацетата и 0,3 мл раство-

ра сульфата гидразина. Смесь фотометрируют

при длине волны 535 нм в кюветах с длиной опти-

ческого пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл ра-

створа сульфонированного батофенантролина,

оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при

той же длине волны. Обе фотометрии выполняют

против холостого опыта, в который берут вместо
исследуемой сыворотки 2 мл воды.

Калибровку проводят так же, как и основной

опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибро-

вочного раствора.

Р а с ч е т сывороточного железа (мкмоль/л)

выполняют по формуле:

результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 — содержание железа в калибровочном раст-

воре, мкмоль/л.

П р и м е ч а н и я . 1. Надо тщательно следить

за содержанием железа в дистиллированной

воде и реактивах, используя в случае необхо-

димости бидистиллированную воду, приго-

товленную в стеклянном перегонном аппа-

рате. 2. Если после удаления белков не уда-

ется набрать точно 4 мл надосадочной жид-

кости, можно взять меньшее ее количество

и сделать поправку при расчете или же взять

точно такое же количество калибровочного

раствора.

Л и т е р а т у р а . Лаб. дело, 1977, № 5,

с. 302—303.

Определение железа по цветной реакции со

спиртовым раствором батофенантролина.

П р и н ц и п . Сывороточное железо восстанав-

ливают тиогликолевой кислотой, белки осаж-

дают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате

устанавливают нужную величину рН, добавляя

ацетат натрия, и проводят цветную реакцию

с батофенантролином. В связи с тем что он в

воде нерастворим, используют спиртовой раст-

вор.

Р е а к т и в ы . 1. Кислота тиогликолевая.

2. Кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.

3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: в случае

необходимости его очищают от следов железа,

растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °С. К прозрач-

ной надосадочной жидкости добавляют раствор

батофенантролина из расчета 10 мл на 1 л и

этиловый спирт в количестве, равном количеству

надосадочной жидкости; на холоду выпадают

кристаллы СНзСООNа-ЗН2О. 4. Батофенантро-

лин, 40 мг в 100 мл этанола. 5. НС1 1 н. раствор.

6. Калибровочный раствор железа: 100 мг мяг-

кой железной проволоки растворяют в 4 мл кон-

центрированной НС1 и разводят до 1 л водой,

получается раствор, содержащий 100 мкг/мл.

Из него разведением в 60 раз получают раствор,

содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).

П р и м е ч а н и е . Учитывая, что метод опре-

деления очень чувствительный, необходимо

принять все меры, чтобы реактивы и посуда

не содержали железа, присутствие которого

выявляется при постановке холостых проб.

Посуду, в том числе пробирки для взятия

крови, необходимо обрабатывать разбавлен-
ной HCI; должна использоваться только

деионизированная или перегнанная в стек-

лянной посуде вода; реактивы очищаются

перекристаллизацией.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,7 мл сыворотки

прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты,

взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н. НС1,

опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раст-

вора трихлоруксусной кислоты. Энергично раз-

мешивают стеклянной палочкой в течение 45 с,

а затем центрифугируют при 2500 об/мин. В про-

бирку с притертой пробкой отбирают из надоса-

дочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют

0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата

и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска

развивается за 20—30 с. Фотометрируют в кюве-

те с длиной оптического пути 1 см при длине

волны 536 нм против холостой пробы, в которую

вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновре-

менно обрабатывают и калибровочную пробу, в

которой вместо сыворотки используют 0,7 мл

калибровочного раствора, содержащего

30 мкмоль железа в 1 л.

Р а с ч е т проводят по правилу пропорций.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Негемино-

вое железо плазмы 12—32 мкмоль/л (65—

175 мкг/100 мл), у женщин на 10—15 % ниже,

чем у мужчин.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Уменьше-

ние негеминового железа сыворотки свидетель-

ствует об истощении резервов и бывает при

железодефицитных состояниях. Железосвязы-

269

вающая способность сыворотки, т. е. общее

количество трансферрина, при этом возрастает.

Определение железосвязывающей способ-

ности сыворотки крови.  П р и н ц и п . Исследуе-

мую сыворотку выдерживают с раствором трех-

валентного железа, при этом весь трансферрин

насыщается. Избыток солей железа удаляют

адсорбцией на карбонате магния и определяют

содержание железа в надосадочной жидкости

одним из приведенных выше методов.

Р е а к т и в ы . 1. Железо хлорное, 5 мг/мл:

2,42 г FеС1

3

-6Н

2

О растворяют в 100 мл 0,005 н.

НС1. 2. Магния карбонат в порошке. 3. Все реак-

тивы, необходимые для определения сывороточ-

ного железа одним из описанных выше методов.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 2  м л исследуемой

сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного

железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин

прибавляют порошок магния карбоната в

объеме примерно 0,5 мл, встряхивают 10—15 с и

центрифугируют. В надосадочной жидкости

определяют железо одним из описанных выше

методов. Полученный результат умножают на 3

(разведение сыворотки).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Железо-

связывающая способность сыворотки 45—

75 мкмоль/л (250—400 мкг/100 мл), у женщин

на 10—15 % ниже, чем у мужчин.

Л и т е р а т у р а . Caraway W. Т. Clin.

Chem., 1963, vol. 9, N 2, p. 188—189.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Железо-

связывающая способность возрастает при желе-

зодефицитных состояниях.

Определение железа в моче по цветной реак-

ции с сульфонированным батофенантролином.

П р и н ц и п . Моча минерализуется с серной

кислотой, образовавшийся пирофосфат железа

разрушается гидролизом на кипящей водяной

бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммо-

ния, железо восстанавливается сульфатом гид-

разина и проводится цветная реакция с сульфо-

нированным батофенантролином.

Р е а к т и в ы . 1. Кислота серная концентри-

рованная. 2. Перекись водорода, 30 % раствор в

воде (пероксид). 3. Сульфат гидразина, насы-

щенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл

воды. 4. Аммония ацетат, насыщенный раствор:

к 148 г соли добавляют 100 мл воды. 5. Раствор

сульфонированного батофенантролина — см.

определение в сыворотке крови. 6. Калибровоч-

ный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л,

см. определение в сыворотке крови.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В колбу Кьельдаля

помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл кон-

центрированной серной кислоты и нагревают на

электрической плитке с закрытой спиралью или

на песчаной бане, не должно быть бурного кипе-

ния и образования пены, которая поднималась

бы в горлышко колбы, в конце сжигания должны

образовываться тяжелые белые пары, занимаю-

щие нижнюю часть колбы. Когда материал по-

темнеет и объем его уменьшится примерно напо-

ловину, добавляют несколько капель пергидро-

ля, что способствует просветлению пробы.

Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не

станет совсем светлым. После охлаждения доли-

270

вают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную

баню на 5—10 мин, после чего объем пробы до-

водят до 20 мл водой. Отбирают 4 мл, к которым

прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора суль-

фата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора

ацетата аммония, после чего фотометрируют при

длине волны 535 нм в кювете с длиной оптиче-

ского пути 1 см и прибавляют 0,5 мл раствора

сульфонированного батофенантролина и остав-

ляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех

же условиях.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В норме

этим методом железо в моче не определяется.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Железо в

моче определяется после приема железосодер-

жащих препаратов, а также при проведении

десфералевой терапии (удаление избытка желе-

за из организма с помощью комплексообразова-

телей).

5.8.5. Фосфор

и фосфорсодержащие вещества

Помимо неорганического фосфора, концент-

рация которого в плазме и эритроцитах практи-

чески одинакова, в крови различают еще фрак-

цию кислоторастворимого фосфора и липидного

фосфора. Кислоторастворимый фосфор весь

находится в клетках, липидный — ив эритроци-

тах, и в плазме.

Результаты определения неорганического

фосфора во многом зависят от используемого

метода (см. ниже). Концентрация его может

значительно уменьшаться, например при алко-

голизме, причем это реально не сказывается на

каких-то физиологических процессах. Клиниче-

ски падение неорганического фосфора наиболее

информативно у детей при рахите, когда оно

наступает из-за нарушения всасывания. Повы-

шение также нельзя трактовать всегда одина-

ково, поскольку оно может быть и признаком

высокой тренированности спортсмена, и насту-

пать при тяжелой уремии, когда почки не могут

выводить соли фосфорной кислоты, образую-

щиеся при окислении пищевых белков и фосфо-

липидов.

Кислоторастворимый фосфор — это низко-

молекулярные, органические соединения, кото-

рые остаются в надосадочной жидкости после

осаждения белков кислотами — трихлоруксус-

ной, хлорной и т. д. Это в основном промежуточ-

ные продукты гликолиза, моно- и динуклеотиды,

которые находятся в эритроцитах. Ядросодер-

жащие клетки, кроме того, богаты и поли-

нуклеотидами — ДНК и РНК, но этих клеток

в крови мало, поэтому суммарный их вклад

невелик. Примерно

  2

/з всего кислотораствори-

мого фосфора крови входят в состав молекул

дифосфоглицериновой кислоты эритроцитов —

2,3-ДФГ, количество которой увеличивается при

всех заболеваниях, сопровождающихся хрони-

ческой гипоксией; остальное — это главным

образом фосфор АТФ и АДФ. Фосфорилирован-

ных Сахаров — гексозо- и пентозофосфатов —

относительно немного. Поэтому клиническое