Главная Учебники - Медицина Лабораторные методы исследования в клинике: справочник (Меньшиков В.В.) - 1987 год
поиск по сайту правообладателям
|
|
|
содержание .. 63 64 65 66 ..
можно использовать серотонинкреатинсульфат, 2,312 мг которого эквивалентны 1 мг серотонина основания. Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут в про- бирку, содержащую 1,34 % раствор оксалата натрия в количестве, составляющем 1/10 от предполагаемого количества крови. К 1 мл крови приливают 1 мл воды и 1 мл н. хлорной кислоты, перемешивают и через 30 мин центрифугируют. К 2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 5 н. NaOH, 1 г порошка хлорида натрия и 4 мл бутанол-хлороформенной смеси, встряхивают 3 мин, а затем центрифугируют для разделения слоев. Водную фазу удаляют, а к органической добавляют 2 мл 0,1 н. NaOH, насыщенного хло- ридом натрия, встряхивают и центрифугируют, 3,5 мл органической фазы переносят в другие пробирки, где экстрагируют 2,5 мл 0,1 н. НС1. После разделения фаз из кислотной (верхней) фазы отбирают порции по 1 мл, которые исполь- зуют для определения гистамина и серотонина. Д л я о п р е д е л е н и я г и с т а м и н а к 1 мл кислотной фазы добавляют 0,2 мл 1 н. NaOH и 0,1 мл раствора ортофталевого альде- гида в метаноле. Через 4 мин приливают 0,1 мл 1,5 М фосфорной кислоты, доводят объем до 5 мл и измеряют флюоресценцию при длине волны 470 нм при возбуждении светом с длиной волны 360—365 нм. Д л я о п р е д е л е н и я с е р о т о н и н а к 1 мл кислотной фазы добавляют 1 мл фосфат- ного буфера рН 8,0 (при этом в растворе должен установиться рН 7,0) и 0,2 мл 0,1 М раствора нингидрина. Смесь инкубируют 30 мин при 75 "С, затем еще 1 ч выдерживают при комнат- ной температуре, доводят объем до 5 мл и изме- ряют флюоресценцию в области 490 нм при возбуждении светом с длиной волны 365 нм. Для калибровки берут пробы, содержащие по 0,05 и 0,1 мкг серотонина и гистамина соответ- ственно, доводят водой до объема 1,5 мл и при- ливают 0,5 мл 1 н. хлорной кислоты. В холостой опыт берут 1,5 мл воды и 0,5 мл 1 н. хлорной кис- лоты. Калибровочные и холостую пробы экстра- гируют бутанол-хлороформенной смесью после добавления 0,2 мл 5 н. NaOH и обрабатывают так же, как и опытные пробы. Свечение холостой пробы вычитают из результатов, полученных для опытных и калибровочных проб. Р а с ч е т проводят по калибровочному гра- фику, по данным которого рассчитывают содер- жание гистамина или серотонина в пробе. Чтобы узнать содержание в 1 мл цельной крови, полу- ченные результаты умножают на 3/2, так как в опыт взято 2 мл хлорного экстракта крови из общего объема 3 мл. Определение гистамина в цельной крови, унифицированный метод по реакции с ортофта- левым альдегидом. П р и н ц и п . Гистамин содержится главным образом в лейкоцитах, поэтому определение выполняется в цельной крови, а не в сыворотке или плазме. Белки осаж- дают хлорной кислотой, добавлением едкого натра устанавливают щелочную реакцию, кото- рая необходима для экстракции смесью бута- нола и хлороформа. После промывания экст- ракта гистамин реэкстрагируют кислотой и опре- деляют в кислой фазе флюорометрическим мето- дом после конденсации с ортофталевым альдеги- дом. Р е а к т и в ы . 1. Натрия оксалат, раствор 13,5 г/л. Растворяют 1,35 г натрия оксалата в 100 мл воды. 2. Кислота хлорная, 1 моль/л, имеет концентрацию 1 н. или 10 %. 3. Натр едкий, растворы 1 н. и 5 н. Готовят, растворяя соответственно 4 или 20 г NaOH в воде, объем доводят до 100 мл. 4. Натрия хлорид в виде сухого порошка. 5. НС1 0,1 н. 6. Натр едкий, 0,1 н раствор, насыщенный поваренной солью. Добав- ляют кристаллический NaCl в 0,1 н. NaOH в таком количестве, чтобы на дне флакона все время был осадок нерастворившейся соли. 7. Бутиловый спирт нормальный (н-бутанол). 8. Хлороформ, лучше использовать марки «для наркоза». 9. Бутанол-хлороформенная смесь: смешивают 150 мл н-бутанола и 100 мл хлоро- форма. 10. Метиловый спирт (метанол), не содержащий воды. 11. Ортофталевый альдегид, раствор 1 г/л в абсолютном метаноле. Жела- тельно использовать ампулированный препарат, в случае необходимости ортофталевый альдегид можно очистить перекристаллизацией из лиг- роина. Для приготовления реактива используют абсолютный (не содержащий воды) метиловый спирт. 12. Ортофосфорная кислота, раствор 1,5 моль/л. 17,3 мл изготовляемой пром.ышлен- ностью 85 % фосфорной кислоты (Н 3 РО 4 ) плот- ности 1,65 доводят водой до объема 100 мл. 13. Калибровочные растворы готовят на 0,4 н. хлорной кислоте, растворяя 1,63 мг крис- таллического гистаминхлорида или 1 мг гиста- мина основания в 100 мл 0,4 н. НС1О4. И в том, и в другом случае получается раствор, содержа- щий 10 мг/л. Хранят в замороженном состоянии в полиэтиленовом (стеклянный может лопнуть!) флаконе. Из него готовят рабочий калибровоч- ный раствор с концентрацией 1 мкг/мл в 0,4 н. хлорной кислоте. Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь берут в про- бирку, содержащую раствор натрия оксалата в количестве 1/10 от предполагаемого количе- ства крови. К 4 мл оксалатной крови добавляют равный объем 1 н. хлорной кислоты, перемеши- вают и через 10 мин центрифугируют. К 4 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл 5 н. NaOH, 1,5 г сухого порошка поваренной соли и хорошо перемешивают, затем приливают 10 мл смеси бутанол — хлороформ, встряхивают 5 мин, центрифугируют и водную фазу удаляют. К органической фазе добавляют 5 мл 0,1 н. NaOH, насыщенного хлоридом натрия, встряхивают, центрифугируют и водную фазу удаляют. Точно 8 мл органической фазы переносят в пробирку, содержащую 3 мл 0,1 н. НС1, и встряхивают 3 мин, при этом гистамин переходит в кислотную фазу, которую и используют для дальнейшего анализа. К 2 мл кислотной фазы добавляют 0,4 мл 1 н. NaOH и 0,12 мл 0,1 % раствора ортофтале- вого альдегида в метаноле, а через 4 мин еще 0,2 мл 1,5 М ортофосфорной кислоты. После этого измеряют флюоресценцию при длине вол- ны 460 нм при возбуждении светом с длиной волны 360 нм. Из показателя опытной пробы 259 |