Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 64

в 10 мл этой смеси. 4. 0,2 н. раствор натрия

карбоната. 5. Калибровочный раствор гидро-

кортизона, содержащий 0,5 мкг в 1 мл. Гото-

вят, растворяя 1 мг препарата в 5 мл метило-

вого или этилового спирта, и доводят объем

водой до 2 л.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Для анализа же-

лательно использовать гепаринизированную

плазму, полученную на холоду, но можно про-

водить определение и в сыворотке, полученной
обычным методом. Экстрагируют 5 мл плазмы

25 мл хлороформа, плазму удаляют, экстракт

промывают два раза порциями по 2,5 мл 0,2 н.

натрия карбоната, затем таким же количеством

воды. Отмытый экстракт упаривают при темпе-

ратуре не свыше 40 °С до объема 1 —1,5 мл,

который переносят в центрифужную пробир-

ку. Стенки посуды, где проводилось выпари-

вание, смывают еще 1 — 1,5 мл хлороформа, кото-

рый переносят в ту же центрифужную пробир-

ку. К суммарному экстракту добавляют 0,2 мл

фенилгидразинового реактива, экстрагируют

взбалтыванием и дают отстояться не менее

20—30 мин. После этого хлороформенный слой

(нижний) осторожно отсасывают, опасаясь

захватить фенилгидразиновый экстракт. Про-

бирку с кислотным экстрактом прогревают 30

мин при 60 °С, при этом остатки хлороформа

выпариваются. Прогретый реактив, приобрет-

ший желтоватую окраску, пастеровской пипет-

кой переносят в микрокювету и измеряют свето-

поглощение при длинах волн 370; 410 и 450 нм

против фенилгидразинового реактива, который

прогревают так же, как и опытную пробу.

Для калибровки аналогичным образом экс-

трагируют 25 мл хлороформа 1 мл калибровоч-

ного раствора (0,5 мкг гидрокортизона), экс-

тракт упаривают и реэкстрагируют фенилгидра-

зиновым реактивом так же, как и опытную

пробу.

Для проведения расчета сначала вычисляют

исправленную величину экстинкции (£„

гп

) по

формуле:

Е„

са

 = £410 — 0,5 • (£з?о + £450)

как для опытной, так и для калибровочной

проб. Содержание 17-ОКС в 5 мл плазмы кро-

ви рассчитывают по правилу пропорций,

сопоставляя Е

исп

 опытной и калибровочной

проб. В 1 л содержится в 200 раз больше

17-ОКС.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 140—550

нмоль/л (5—20 мкг в 100 мл).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Нестойкое

увеличение 17-ОКС бывает при нервно-эмо-

циональных напряжениях, тяжелой физической

работе у нетренированных людей, травмах,

хирургических операциях и т. д. Стойкое уве-

личение свидетельствует о развитии гиперкор-

тицизма (синдром Кушинга) чаще всего в

результате опухоли надпочечника, гипофиза и

эктопической АКТГ продуцирующей опухоли.

Снижение свидетельствует о гипокортицизме

вследствие поражения надпочечников (болезнь

Аддисона) или длительной стероидной терапии.

5.7.4. 11-Оксикортикостероиды

Унифицированный метод по флюоресцен-

ции в серно-спиртовом реактиве.  П р и н ц и п .

Кортикостероиды, имеющие гидроксилы в по-

ложениях 11 и 21 и кетогруппу в положении 3,

после обработки смесью серной кислоты и спир-

та флюоресцируют зеленым светом. Их опре-

делению мешают холестерин и другие липиды,

которые в этих условиях также образуют

флюоресцирующие соединения, поэтому их уда-

ляют предварительной экстракцией гексаном, в

который кортикостероиды не переходят.

Р е а к т и в ы . 1. Гексан. 2. Дихлорметан.

3. 0,2 н. раствор натрия карбоната. 4. Серно-

спиртовой реактив: смешивают 3 объема кон-

центрированной серной кислоты и 1 объем эти-

лового спирта, смесь охлаждают до комнатной

температуры, реактив годен только в день при-

готовления. Требования к качеству серной ки-

слоты и спирта те же '. 5. Калибровочные

растворы. Желательно, чтобы калибровочные

растворы содержали гидрокортизон и кортико-

стерон в тех же соотношениях, в которых они

присутствуют в крови человека, т.е. 4:1, но

можно обойтись и одним гидрокортизоном.

Основной калибровочный раствор содержит

200 мкг гидрокортизона и 50 мкг кортикосте-

рона в 1 мл; его готовят, растворяя кортикоиды

в 1 мл спирта и добавляют воду до нужного

объема. Ампулированные фармацевтические

препараты обычно содержат гемисукцинат и

для калибровки не годятся.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Исследуемую

плазму или сыворотку в количестве 1 мл экстра-

гируют 3 мл гексана, верхний (гексановый)

слой удаляют, остаток гексана упаривают под

вакуумом на водяной бане при 40 °С. Плазму

экстрагируют 10 мл дихлорметана, дают хоро-

шо отстояться (по крайней мере 20  м и н ) , дожи-

даясь полного просветления раствора, промы-

вают его 0,5 мл 0,2 н. раствора натрия карбо-

ната, затем 0,5 мл воды и 8 мл переносят в

чистую пробирку, куда добавляют 2,5 мл сер-

но-спиртового реактива, встряхивают и через

несколько минут удаляют дихлорметановый

слой (верхний). Через час измеряют флюорес-

ценцию серно-спиртового экстракта в диапазо-

не 540—550 нм при возбуждении светом с дли-

ной волны 475 нм.

Одновременно с опытными пробами обраба-

тывают и калибровочные с той разницей, что

экстракцию гексаном пропускают, а 1 мл кали-

бровочного раствора непосредственно экстра-

гируют 10 мл дихлорметана; дальнейшая обра-

ботка такая же, как и в опытных пробах.

Р а с ч е т проводят по формуле:

-=с„,

где Ф

оп

 и Ф

к

 — соответственно величины флюо-

ресценции опытной и калибровочной проб,

См. с. 253.

255

а С

к

 — содержание 11-ОКС в калибровочном

растворе. Результаты выражают в мкг/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 140—230

нмоль/л (5—8 мкг в 100 мл).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е такое же,

как и определения 17-ОКС.

5.7.5. Адреналин, норадреналин

Метод раздельного определения. П р и н-

ц и п. Адреналин и норадреналин выделяются

из мочи адсорбцией на окиси алюминия, как

и в других методах. Адреналин окисляется во

флюорофор феррицианидом при рН 4,2, нор-
адреналин при рН 6,2. Чтобы при рН 6,2 не

происходило образование флюорофоров из адре-

налина, в реакционную смесь добавляют тио-

гликолевую кислоту и формалин; гидросуль-

фит натрия, удаляя растворенный кислород,

способствует стабилизации флюорофоров, обра-

зовавшихся из норадреналина.

Р е а к т и в ы . 1. НС1, 6 моль/л. Готовят

разведением промышленно изготовляемой кон-

центрированной 10 н. НС1 до концентрации

6 н. 2. Этилендиаминтетрауксусная кислота или

ее соли (версен, трилон, хелатон, ЭДТА).

3. Гидрат окиси аммония (NH

4

OH), растворы

0,5 н. и 1 н. 4. Окись алюминия очищенная и

активированная по Брокману  I I . 5. Уксусная

кислота, 0,25 н. раствор. 6. Фосфатные буфер-

ные растворы рН 4,2 и 7,4, концентрация 1/15.

7. Калия феррицианид (железистосинеродистый
калий, красная кровяная соль, КзFе/СN/

6

),

растворы концентрации 5 и 2,5 г/л. Готовят

из препарата, очищенного перекристаллиза-

цией. 8. Аскорбиновая кислота, 3 г/л. В день

опыта растворяют 30 мг перекристаллизованно-

го препарата в 10 мл 5 н. NaOH. 9. Тиоглико-

левая кислота, раствор 0,58 моль/л: 5,34 г (что

составляет 4 мл) доводят водой до объема 100

мл. 10. Формальдегид, раствор 0,05 моль/л на

2,5 н. NaOH. На 100 мл 2,5 н. раствора едкого

натра берут 0,375 мл имеющегося в продаже

40% раствора формалина.  1 1 . Гидросуль-

фит натрия (натрий гидросернистокислый,

Na

2

S

2

O

4

), сухой препарат в виде порошка.

12. Калибровочные растворы адреналина и нор-

адреналина, содержащие по 100 нг основания

в 1 мл. Могут быть использованы как кристал-

лические, так и ампулированные фармацевти-

ческие препараты; если используются соли, то

надо пересчитать на чистое основание.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Моча, подкислен-

ная 6 н. НС1 до рН 3,0, может храниться в за-

мороженном состоянии без потерь в течение

месяца. Для анализа берут подкисленную мо-

чу, стоявшую по крайней мере одну ночь в хо-

лодильнике, за это время максимальное коли-

чество солей успевает выпасть в осадок. К 15 мл

отфильтрованной мочи добавляют 200 мг ЭДТА

и 1 н. раствором NaOH доводят рН до 8,2  п р и

тщательном перемешивании и под контролем

рН-метра. Колонки для хроматографии диа-

метром около 7 мм заполняют окисью алюми-

ния, для чего 1,2 г А1

2

О

3

 взбалтывают в 3 мл

воды и вносят в колонку,  н и ж н и й конец кото-

рой рыхло закрыт ватой, прокипяченной в воде

и высушенной. Остатки окиси алюминия пере-
носят в колонку еще 2—3 порциями воды. 15 мл

мочи наносят на колонку и дают стечь под

действием силы тяжести, затем промывают

10 мл воды, к которым добавлена 1 капля 0,5 н.

NH

4

OH; создавая вакуум водоструйным насо-

сом, катехоламины элюируют 6 мл 0,25 н. уксус-

ной кислоты. Время между промывкой колонки

подщелоченной водой и окончанием элюции не

должно превышать 30 мин.

В кислотных элюатах рН бывает в пределах

3,5—3,9, их можно хранить 2—3 дня до анализа.

Перед исследованием остатки взвеси окиси

алюминия удаляют центрифугированием. Для

определения адреналина к 1 мл холодного элюата

добавляют 1 мл холодного фосфатного буфер-

ного раствора рН 4,2, 1 каплю 0,5 н. NH

4

OH

(рН должен быть в пределах 4,1—4,3) и

0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида калия.

На этом этапе исследуемая проба и все реактивы

должны находиться в бане со льдом. Точно

через 2 мин окисление останавливают, добавля-

ют 0,2 мл 0,3 % раствора аскорбиновой кислоты

в 5 н. NaOH, а еще через 3 мин 1 мл воды, охлаж-

денной на льду, перемешивают и флюорометри-

руют, измеряя флюоресценцию в области 500—

550 нм при возбуждении светом с длиной волны

400 нм.

Для определения норадреналина, которое

также проводят при постоянном охлаждении

всех реагентов в бане с ледяной водой, к 1 мл

отцентрифугированного элюата добавляют

1 мл холодного фосфатного буфера рН 7,3 (при

этом рН смеси устанавливают в пределах

6,2—6,5) и 0,4 мл 0,5 % раствора феррицианида

калия. Перемешивают и точно через 2 мин

добавляют 1,2 мл смеси, которая приготовлена

за несколько минут до этого путем смешива-

ния 3 мл охлажденной тиогликолевой кислоты

и 8 мл охлажденного раствора едкого натра с

формалином, еще через 3 мин добавляют на

кончике стеклянной палочки 2—3 мг порошка

гидросульфата натрия, перемешивают и изме-

ряют флюоресценцию в тех же условиях, что

при определении адреналина.

Для калибровки анализируют в таких же

условиях пробы, содержащие 25—100 нг кате-

холамина, по этим данным строят калибро-

вочный график. При повседневной работе ка-

либровочные пробы не проводят через стадию

элюции, а обрабатывают их так же, как и

элюаты. Чтобы рассчитать концентрацию кате-

холамина в моче, его содержание в элюате

(нг/мл или нмоль/мл) умножают на 0,4, так

как 1 мл элюата соответствует 2,5 мл мочи.

П р и м е ч а н и я .  1 . Флюоресцирующие

продукты, образующиеся при определении

норадреналина, быстро окисляются кисло-

родом воздуха, поэтому свечение падает.

Гидросульфит натрия, поглощая кисло-

род воздуха, делает флюорофоры более

стойкими, слишком энергичное перемеши-

вание способствует аэрации раствора и

уничтожает защитное действие гидросуль-

фита. 2. Если при рН 6,2 проводить окисле-

ние так же, как и при рН 4,2, т. е. после до-

бавления фосфатного буфера к элюату доба-

256

вить 0,5 мл 0,25 % раствора феррицианида

и точно через 2 мин 0,2 мл 0,3 % раствора

аскорбиновой кислоты в 5 н. NaOH, то бу-

дет определена сумма адреналина и нор-

адреналина. 3. В целом определение адре-

налина более надежно, чем норадреналина;

основная ошибка анализа связана с гаше-

нием флюоресценции посторонними ве-

ществами, что проявляется в том, что до-

бавки адреналина или норадреналина к мо-

че определяются не полностью. Этот эффект

во многом зависит от качества окиси алю-

миния, поэтому при налаживании методики

>келательно проверить полноту открытия

добавок исследуемых веществ к моче.
Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Выведение

адреналина 30—80 нмоль/сут (5—15 мкг/сут),

норадреналина 20—240 нмоль/сут (7—

44 мкг/сут).

5.7.6. Ванилил-миндальная кислота

Метод тонкослойной хроматографии.

П р и н ц и п . Ванилил-миндальную кислоту

(ВМК) экстрагируют из мочи этилацетатом,

экстракт упаривают и подвергают тонкослой-

ной хроматографии на силикагеле. Для обна-

ружения на хроматограммах и количественно-

го определения используют цветную реакцию

с дйазотированным п-нитроанилином.

Р е а к т и в ы . 1. НС1 концентрированная,

примерно 10 н. 2. Этилацетат '. 3. Натрия суль-

фат безводный, порошок. 4. Натрия хлорид,

порошок. 5. Силикагель марки АСК или КСК,

порошок, размер зерен 150—175 меш. 6. Гипс

медицинский. 7. Дихлорметан (метиленхлорид).

8. Метиловый спирт. 9. Гидрат окиси аммония

(NH

4

OH), 17 % водный раствор, плотность

0,933. 10. Раствор для хроматографирования.

Смешивают 40 мл дихлорметана, 40 мл мети-

лового спирта и 2 мл 17 % раствора аммиака.

11. Раствор п-нитроанилина, 1 г/л. 12. Натрия

нитрит (NaNCb), раствор 2 г/л. 13. Калия кар-

бонат (поташ, К.2СО

3

), раствор 100 г/л. 14. Про-

являющий диазореактив. Непосредственно пе-

ред употреблением на холоду смешивают 1

часть раствора п-нитроанилина, 1 часть раство-

ра натрия нитрита и 10 частей раствора пота-

ша. Смесь годна к употреблению лишь несколь-

ко минут. 15. Усиливающий окраску диазореак-

тив. Непосредственно перед употреблением на

холоду смешивают равные объемы раствора

п-нитроанилина и натрия нитрита. Реактив го-

ден к употреблению лишь несколько минут.

16. Натрия карбонат (сода, Na

2

CO

3

), раствор

20 г/л. 17. Метанольная щелочь. В день опре-

деления смешивают 1 объем раствора натрия

карбоната и 2 объема метилового спирта.

18. Этиловый спирт. 19. Ацетатный буферный

раствор рН 1,96 (концентрация 0,1 М). 20. Ка-

либровочный раствор, содержащий ВМК в кон-

центрации 100 мг/л в 0,1 н. НС1.

Х о д  о п р е д е л е н и я . 2,5 г силикагеля

тщательно смешивают с 0,4 г гипса, желатель-

Очистку см. с. 251.

9 п/р В. В. Меньшикова

но перемешивать механической мешалкой в

течение часа. К этому количеству добавляется

9 мл воды до образования густой массы, кото-

рую после тщательного перемешивания с по-

мощью специального аппарата наносят на обез-

жиренную стеклянную пластину размером

8X18 см слоем толщиной 0,25 мм. Пластину

высушивают на воздухе в защищенном от пы-

ли месте на протяжении 2 ч, а затем прогре-

вают при 120 °С еще 2 ч. Хранят в плотно

закрытом эксикаторе над хлоридом кальция

(для предотвращения впитывания паров воды).

Свежесобранную суточную мочу подкисляют

НС1 до рН 1,0, ее можно хранить в холодиль-

нике несколько дней. К 1 мл подкисленной мо-

чи добавляют 300 мг порошка NaCI и дважды

экстрагируют ВМК порциями по 3 мл этила-

цетата. Этилацетатные экстракты (верхний

слой) отсасывают, объединяют, осушают без-

водным сульфатом натрия и выпаривают в

токе воздуха при 35—40 °С.

Сухой этилацетатный остаток растворяют в

0,1 мл этилового спирта и наносят на хрома-

тографическую пластинку небольшими порция-

ми; следующую порцию наносят на то же место

после того, как предыдущая уже высохла.

Повторно омывают пробирку 0,1 мл этилового

спирта и наносят на то же место хроматогра-

фической пластинки. Дважды проводят восхо-

дящее хроматографирование так, чтобы слой

растворителя поднимался на 12 см, после этого

пластину высушивают и проявляют. Тонкослой-

ное хроматографирование проводят в спе-

циальных плотно закрывающихся банках или

эксикаторах, воздух внутри которых предвари-

тельно насыщен парами растворителя.

Для проявления пластин их после высуши-

вания опрыскивают проявляющим диазореак-

тивом. При этом у самого финиша видно пят-

но гомованилиновой кислоты, пятно ВМК нахо-

дится примерно на 4 см выше  л и н и и старта

(R/ в среднем 0,16), оно окрашивается в ярко-

фиолетовый цвет. Пятна соскабливают в про-

бирки, куда добавляют по 2 мл метанольной

щелочи и 0,1 мл усиливающего диазореактива.

Тщательно перемешивают и через 20 мин

центрифугируют, надосадочную жидкость фото-

метрируют при трех длинах волн: 450; 520 и

590 нм против экстрактов из соскобов пластин

в участках, где нет ВМК.

Одновременно с опытными пробами через

всю процедуру анализа пропускают калибро-

вочные пробы, содержащие 4; 6 и 8 мкг ВМК.

Для этого 0,04—0,08 мл калибровочного раст-

вора, содержащего ВМК в концентрации 100

мкг/мл, выливают в порции по 1 мл ацетатно-

го буфера рН 1,96, затем экстрагируют этил-

ацетатом так же, как и опытные пробы и т. д.

Для расчета сначала вычисляют исправлен-

ную величину экстинкции с поправкой на не-

специфическое поглощение по формуле:

E = E

520

—1/2 • (Е

350

 +Е

590

)

как для опытных, так и для калибровочных

проб. По этим данным строят калибровочный

график, который служит для непосредствен-

257

Т а б л и ц а 41. Содержание гистамина, серотонина и 5-ОИУК

ного расчета содержания ВМК. в моче в микро-

граммах в 1 мл.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 2,5—38

мкмоль/сут (0,5—7 мг/сут).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Небольшое

проходящее повышение свидетельствует о повы-

шении функциональной активности симпатико-

адреналовой системы, стойкое повышение

бывает при феохромоцитоме.

5.7.7. Гистамин, серотонин

Биогенные амины — гистамин и серотонин

(окситриптамин, 5-ОТ) — содержатся главным

образом в клетках крови (табл. 41), гистамин

в базофильных лейкоцитах, а серотонин в тром-

боцитах, поэтому результаты их определения в

цельной крови в большей степени зависят от

количества соответствующих клеток. Имеются

данные, что и то, и другое вещество, будучи

добавлено к плазме, связывается с белками —

гистамино- и серотонинопексия.

Гистамин освобождается при анафилактиче-

ских и аллергических реакциях, но в целом

клиническое значение результатов его определе-

ния невелико. Серотонин образуется в клетках

желудочно-кишечного тракта и продуцируется

особым видом опухолей — карциноидом. Основ-

ной метаболит серотонина — 5-оксииндолилук-

сусная кислота — выводится с мочой в виде

парных соединений с серной и глюкуроновой

кислотами. Особенно информативно повышение

содержания серотонина в плазме и оксииндоли-

луксусной кислоты в моче при карциноидах

кишечника или легких, некоторое увеличение

может быть и при заболеваниях желудочно-

кишечного тракта.

Как гистамин, так и серотонин обычно опре-

деляют после разрушения клеток и осаждения

белков, но и при этом теряется до 40 % исход-

ного содержания биогенного амина; лучшие

результаты получаются при разрушении клеток

замораживанием — оттаиванием. Оба вещества

способны реагировать с о-фталевым альдегидом

с образованием флюорофоров, но для серото-

нина эта реакция идет в кислой среде, а для

гистамина — в щелочной. Кроме того, серото-

нин сам обладает флюоресценцией и может,

реагируя с нингидрином, также давать флюорес-

цирующие соединения.

Метод совместного определения гистамина и

серотонина.  П р и н ц и п . Гистамин содержится

главным образом в лейкоцитах, серотонин —

в тромбоцитах, поэтому оба вещества опреде-

ляют в цельной крови после осаждения белков

хлорной кислотой. Для очистки и выделения

используют способность этих соединений при

щелочных рН переходить в органическую фазу, а

при кислых в водную. Анализ завершается изме-

рением флюоресценции продуктов конденсации

гистамина с ортофталевым альдегидом, а серо-

тонина с нингидрином.

Р е а к т и в ы . 1. Калия оксалат, раствор

13,4 г/л. 2. Хлорная кислота (НСlO

4

), 1 н. рас-

твор. 3. Натр едкий, растворы 1 н. и 5 н. 4. Натр

едкий, 0,1 н. раствор, насыщенный поваренной

солью. К 0,1 н. NaOH добавляют кристаллы

поваренной соли в таком количестве, чтобы на

дне все время был осадок. 5. Натрия хлорид,

сухой порошок. 6. HCI, 0,1 н. раствор. 7. Фосфат-

ный буферный раствор рН 8,0, концентрации

1/15 моль/л. 8. Хлороформ. 9. Бутиловый спирт

нормальный (н-бутанол). 10. Бутанол-хлоро-

форменная смесь. Смешивают 150 мл н-бута-

нола и 100 мл хлороформа.  1 1 . Кислота фос-

форная, 1,5 моль/л: 17,3 мл имеющейся в про-

даже 85 % фосфорной кислоты доводят водой до

объема 100 мл. 12. Ортофталевый альдегид,

раствор 1 г/л в абсолютном метаноле '.13. Нин-

гидрин, раствор 100 ммоль/л. Растворяют 180 мг

нингидрина в 10 мл воды. 14. Калибровочные

растворы гистамина и нингидрина, содержащие

по 100 мг/л в 0,01 н. НС1. Для приготовления

См. с. 259.

258