Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 62

ошибки, рекомендуют калибровочный рас-

твор готовить по следующей прописи: 510 мг

триолеина растворяют в 100 мл изопро-

пилового спирта, получается исходный

калибровочный раствор с содержанием

6 ммоль/л, из которого готовят по мере не-

обходимости рабочий калибровочный рас-

твор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1

объем исходного калибровочного раствора
4 объемами воды.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,5 мл сыворот-

ки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл

изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н. серной

кислоты, перемешивают и через 5 мин центри-

фугируют. Из верхнего (гептанового) слоя от-

бирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового

спирта и 1 каплю 6,25 н. КОН. Перемешивают,

закрывают пробкой и нагревают на водяной
бане 10 мин при 70 °С. После охлаждения добав-

ляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл аце-

тилацетонового реактива, после перемешивания

снова закрывают пробкой и нагревают еще

10  м и н при 70 °С. Развивается желто-зеле-

ное окрашивание, интенсивность которого изме-

ряют, фотометрируя при длине волны 425 нм

в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см

против холостой пробы, которую ставят так же,

как и опытную, но вместо исследуемого мате-

риала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят так же, как и

опытную, но вместо сыворотки или плазмы бе-

рут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл

воды; развивающаяся окраска соответствует

окраске опытной пробы, в которую взята плаз-

ма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.

Расчет проводят по правилу пропорций или по

калибровочному графику. Если используется

калибровочный раствор, уже содержащий воду

(см. примечание), то при постановке калибро-

вочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибро-

вочного раствора, а воду не добавляют.

Л и т е р а т у р а . Gottfried S. P., Rosenberg

В.  C l i n . Chem. 1973. vol. 19, № 9, p. 1077—1078.

П р и м е ч а н и е . При отсутствии три-

олеина или трибутирина для калибровки

можно использовать растительное масло,

принимая, что образующие его триглицери-

ды имеют ту же молекулярную массу, что и

триолеин. Можно проводить калибровку, ис-

пользуя раствор глицерина в этаноле, в этом

случае его непосредственно добавляют к

щелочному раствору едкого кали.

Л и т е р а т у р а . Carlson L. A. Atheroscle-

rosis Research, I 1963, vol. 3, p. 334—336.— Лаб.

дело, 1976, № 6, с. 375—376.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В целом

нормальной величиной содержания триглицери-

дов в плазме крови считают 0,55—1,65 ммоль/л

(50—150 мг в 100 мл), но, так же как и для

холестерина, верхняя граница нормальных ве-

личин у мужчин зависит от возраста, особен-

ностей жизни и т. д. В качестве ориентира верх-

ней границы возрастной нормы для  м у ж ч и н

можно принять данные Института кардиоло-

гии АМН СССР (см. табл. 42).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Наиболь-

шее значение имеет определение триглицеридов

для типирования эссенциальных гиперлипиде-

м и й , II частности дифференцирования типа ПА

(изолированная гиперхолестеринсмия) и ПБ

(увеличение содержания и холестерина, и три-

глицеридов). Кроме того, повышение содержа-

ния триглицеридов бывает при нефротическом

синдроме, переломах костей, гипотиреозе и ал-

коголизме, но большого диагностического зна-

чения при этих заболеваниях не имеет. В прак-

тическом отношении надо всегда помнить о

существовании алиментарной гипертриглицери-

демии.

5.6.5. Инфракрасная

спектрофотометрия липидов

П р и н ц и п . Холестерин, его эфиры и

триглицериды экстрагируются из исследуемой

плазмы или сыворотки смесью гексан — изопро-

пиловый спирт — серная кислота, в которую

фосфолипиды не переходят. Растворитель вы-

паривают, а исследуемые вещества растворяют

в четыреххлористом углероде;  и н ф р а к р а с н ы й

спектр этого раствора снимается. Все липиды

имеют характерные пики поглощения в инфра-

красной области спектра, поэтому не требуется

проведения дополнительных  х и м и ч е с к и х реак-

ций. Пики поглощения триглицеридов и холе-

стерина пересекаются, поэтому расчет проводят

по эмпирически подобранным формулам, кото-

рые позволяют исключать взаимную интерфе-

ренцию определяемых веществ.

Р е а к т и в ы . 1. Гексан. 2. Изопропиловый

спирт (изопропанол). 3. Смесь гексан — изо-

пропиловый спирт — 0,1 н. серная кислота

6:9:1. Готовят в день определения, смешивая

6 объемов гексана, 9 объемов изопропилового

спирта и 1 объем 0,1 н. серной кислоты. 4. Че-

тыреххлористый углерод. 5. Натрия хлорид.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл иссле-

дуемой сыворотки или плазмы крови прибав-

ляют 2 мл экстрагирующей смеси и энергично

встряхивают. Добавляют в пробирку щепотку

натрия хлорида, при этом на дне образуется,

густая белая масса, над которой плавает про-

зрачная жидкость. Верхний слой осторожно

переливают в сухую пробирку, где выпаривают

в токе азота или воздуха. Сухой остаток может

храниться неограниченно долго. Его раство-

ряют в 1 мл четыреххлористого углерода и

снимают спектр поглощения в инфракрасной

области в кювете с длиной оптического пути

1 мм против аналогичной кюветы, заполненной

четыреххлористым углеродом. При работе на

приборе фирмы «К. Цейс-10» в диапазоне

1000—2000  с м ~ ' работают с призмой NaCL,

а в диапазоне 2000—3500  с м -

1

 с призмой LiF.

Расчет проводят по эмпирической формуле:

247

где ХОЛ и ТГ — концентрации холестерина и

триглицеридов (моль/л) в исследуемой плазме

или сыворотке, а Е — величины экстинкции при

соответствующих волновых числах, выражен-

ных в см (читается «обратные сантиметры»).

При работе на других  т и п а х приборов или

переюстировке прибора формулу для расчета

желательно проверить путем сопоставления

результатов вычисления по ней с результата-

ми химического определения холестерина и три-

глицеридов в гексан-изопропаноловом экстрак-

те.

5.6.6. Неэтерифицированные

жирные кислоты

Колориметрический метод определения мед-

ных солей.  П р и н ц и п . При нейтральных и

слабощелочных значениях рН медные соли

ж и р н ы х кислот экстрагируются из водных рас-

творов  р а з л и ч н ы м и неводными растворителями

(в данном случае смесью хлороформ — геп-

тан — метанол), в то же время в этих условиях

ионы меди остаются в водной фазе. Поэтому

количество меди, перешедшее в органическую

фазу, отражает содержание неэтерифицирован-

ных (свободных) жирных кислот (НЭЖК).

Медь определяют по цветной реакции с 1,5-ди-

фенил-карбазидом.

Р е а к т и в ы . 1. Хлороформ. 2. Гептан.

3. Метиловый спирт (метанол). 4. Экстракцион-

ная смесь. Смешивают 250 мл хлороформа,

250 мл гептана и 12 мл метилового спирта.

5. Меди нитрат 0,5 моль/л: готовят растворе-

нием 24, 16 г  С u ( N О

3

)

2

- З Н

2

О в 200 мл воды.

6. Триэтаноламин, 1 моль/л: готовят, растворяя

29,8 г триэтаноламина в воде (примерно 20,7

мл), объем доводят водой до 200 мл. 7. Едкий

натр, 1 н. раствор. 8. Натрия хлорид, насыщен-

ный водный раствор. 9. Медный реактив. В день

определения смешивают 10 мл раствора меди

нитрата, 10 мл раствора триэтаноламина и

6 мл 1 н. NaOH. Объем доводят до 100 мл насы-

щенным раствором хлорида натрия, после чего

устанавливают рН 8,0, добавляя нужное коли-

чество 1 н. NaOH. 10. Дифенилкарбазида спир-

товой раствор: 100 мг 1,5-дифенилкарбазида

растворяют в 25 мл этилового спирта, непосред-

о ценно перед употреблением добавляют 0,24 мл

триэтаноламина.  1 1 . Калибровочный раствор.

Для его приготовления можно использовать

различные жирные кислоты с длинной цепью,

но удобнее всего работать со стеариновой кис-

лотой, так как она при комнатной температуре

существует в твердом состоянии (температура

плавления 70 °С). Исходный раствор с концент-

рацией 10 ммоль/л готовят, растворяя 284,5 мг

в 100 мл хлороформа, из него готовят рабочие

калибровочные растворы, содержащие 400—

1000 мкмоль/л, путем разведения хлорофор-

мом.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,05 мл сыво-

ротки или пл.азмы добавляют 3 мл экстракцион-

ной смеси и 0,9 мл медного реактива, закры-

вают пробирку пробкой (лучше всего полиэти-

леновой) и встряхивают 3  м и н , после чего

центрифугируют. Отбирают 1,8 мл верхней фа-

зы и добавляют к ней 0,5 мл раствора дифенил-

карбазида, через 15 мин фотометрируют  п р и

длине волны 550 нм в кюветах с длиной опти-

ческого пути 1 см против холостого опыта, в

который берут 1,8 мл экстракционной смеси,

к которой добавлено 0,5 мл Дифенилкарбазида.

Расчет проводят по калибровочной кривой,

для построения которой используют рабочие

калибровочные растворы, содержащие 400—

1000 мкмоль жирной кислоты в 1 л хлорофор-

ма; 0,05 мл рабочего калибровочного раствора

обрабатывают так же, как и исследуемую плаз-

му или сыворотку.

П р и м е ч а н и е . Основной источник оши-

бок при определении неэтерифицированных

жирных кислот (НЭЖК), или, как их иногда

называют, свободных  ж и р н ы х кислот

(СЖК), связан с тем, что в процессе полу-

ч е н и я сыворотки или при ее хранении проис-

ходит гидролиз нейтральных жиров (тригли-

церидов) и фосфолипидов и появляется

дополнительное количество НЭЖК, ко-

торые неотличимы от уже существовавших

в плазме. Поэтому желательно исследовать

не сыворотку, а плазму, полученную на хо-

лоду без гепарина.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы неэтерифи-

цированных  ж и р н ы х кислот в плазме: 400—

800 мкмоль/л.

Л и т е р а т у р а . Прохоров М. Ю., Тиу-

нов М. П., Шакалис Д. А.—Лаб. дело, 1977,

№ 9, 535—536.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Увеличе-

ние количества НЭЖК обусловлено приемом

пищи, а также различными факторами, стиму-

л и р у ю щ и м и липолиз (гепарин, адреналин и

различные близкие ему по  х и м и ч е с к о й структу-

ре или физиологическому действию вещества).

Обычно если содержание глюкозы в  к р о п и

возрастает, содержание НЭЖК уменьшается.

Количество их возрастает при атеросклерозе,

после инфаркта миокарда.

5.6.7. Липопротеиды

Определение фракций методом дискэлектро-

фореза в полиакриламидном геле.  П р и н ц и п .

Предварительно окрашенные липопротеиды

сыворотки подвергают электрофорезу в на-

правлении сверху вниз в колонке, заполненной

четырьмя слоями полиакриламидного геля.

Н и ж н и й слой геля самый мелкопористый, верх-

ний самый крупнопористый. Липопротеиды в

зависимости от размера их молекул задержи-

ваются в разных участках геля.

Р е а к т и в ы . 1. ТРИС — трис(оксиметил)

аминометан. 2. Акриламид. 3. N, N'-метилен-

бисакриламид (МБА). 4. N, N, N', N' -тетраме-

тилэтилендиамин (ТЕМЕД). 5. Рибофлавин.

6. Сахароза. 7. Глицин (аминоуксусная кисло-

248

та, гликокол). 8. Судан черный — насыщенный

спиртовой раствор. Растворяют 100 мг в 5 мл
этилового спирта. 9.  А м м о н и я персульфат (ам-

м о н и й надсернокислый), 0,14 % раствор. Раст-
воряют 140 мг (NH

4

)

2

S

2

O

8

 в 100 мл воды. Го-

ден пря хранении в холодильнике в течение не-

дели. 10. Электродный трисглициновый буфер,

рН 8,3: в 1 л воды растворяют 0,6 г ТРИС и
2,88 г глицина; с помощью НС1 или едкого нат-
ра устанавливают рН 8,3.  1 1 . Трис-буфер рН

8,9 — раствор А: к 36,6 г ТРИС добавляют
около 40 мл воды, 48 мл 1 н. НС1 и 0,23 мл

ТЕМЕД; после растворения объем доводят до

100 мл водой и устанавливают рН 8,9. 12. Трис-

буфер рН 6,7, раствор В: к 5,98 г ТРИС добав-
ляют около 40 мл воды, 48 мл I н. HCI и 0,46 мл

ТЕМЕД, доводят объем до 100 мл и устанавли-

вают рН 6,7. 13. 28 % раствор  а к р и л а м и д а —

реактив С: 28 г  а к р и л а м и д а и 0,735 г МБА

растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.

14. 10 % раствор акриламида — реактив D:

10 г  а к р и л а м и д а и 2,5 г МБА растворяют в

воде и объем доводят до 100 мл. 15. Раствор

рибофлавина — реактив Е: 4 мг рибофлавина
растворяют в 100 мл воды. 16. 40 % раствор
сахарозы — реактив F: 40 г сахарозы раство-
ряют в воде и доводят объем до 100 мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Определение про-

водят в аппарате для вертикального электро-

фореза любой конструкции. Он представляет
собой пластмассовый штатив с вертикально

укрепленными стеклянными трубками длиной
70 мм и диаметром 6—7 мм, в которых собствен-

но и проводится электрофорез.  Н и ж н и е концы

трубок погружены в электродный буферный

раствор, соединенный с положительным элект-
родом источника тока, а верхний конец зали-

вают таким же раствором, подсоединенным к
отрицательному электроду.

Перед началом работы в трубках форми-

руются столбики четырехслойного геля, причем

в нижнем слое концентрация акриламида са-
мая высокая и условия полимеризации подо-

браны так, чтобы размер пор был наимень-

ш и м ; чем выше расположен слой геля, тем

больше размер его пор.  Н и ж н и е три слоя назы-

ваются разделяющими, в  н и х рН 8,9, самый

верхний слой геля концентрирующий, его рН

6,7. Для формирования столбика геля трубку
устанавливают вертикально,  н и ж н и й конец

герметично прижимают к резиновой пластине и
шприцем с длинной иглой последовательно

заливают растворы, подлежащие полимериза-

ции, которые готовят как указано справа.

После того как залит очередной раствор,

который должен полимеризоваться в гель, на

него сверху наносят несколько капель воды,

под слоем которой гель и полимеризуется. Это

обеспечивает горизонтальную поверхность. Два

н и ж н и х слоя полимеризуют в темноте при ком-
натной температуре, два верхних — при осве-
щении лампой дневного света на расстоянии
30—40 см.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,3 мл иссле-

дуемой сыворотки добавляют 0,15 мл раствора

Судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и
0,05 мл трис-буфера рН 6,7, после чего пере-

Расположение

слоя геля

Высота слоя

геля, мм

рН

К о н ц е н т р а ц и я

полиакрилами-

Да,

 %

Раствор А (ре-

актив 11) *

Раствор В (ре-

а к т и в 12)
Раствор С (ре-

а к т и в 13)

Раствор D (ре-

а к т и в 14)
Раствор Е (ре-

а к т и в 15)
Раствор F (ре-

а к т и в 16)
Раствор пер-

сульфата ам-

мония (реак-

тив 9)

Воды

Нижний

22

8,9

10

1

—

2,8

—

—

—

4

0,2

2-й

снизу

14

8,9

5

1

—

1,36

—

—

—

4

1,64

3-й

снизу

14

8,9

3

1

—

—

2

1

4

—

Верх-

ний

9

6,7

3

—

1

—

2

1

4

—

—

* Раствор для полимеризации готовят, смешивая

указанные количества объемов исходных растворов.

мешивают и оставляют на 1 ч в темноте. После
этого 0,03—0,05 мл осторожно наносят на по-

верхность уже сформированного в трубке геля
и дают впитаться в течение нескольких минут,

заполняют трубку доверху электродным буфе-

ром и проводят электрофорез в течение 1 ч в
затемненном помещении  п р и силе тока 4—5 мА

на трубку.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в .  Н а самом

верху трубки, на старте, расположена полоса
х и л о м и к р о н и остатки не прореагировавшей

с липидами краски. Медленнее всего в этой

системе движутся пре-в-ЛП, полоса которых

расположена в 3 % геле. На границе 3 % и

5 % гелей оказывается две полосы (Will, а на
границе 5 % и 10 % гелей — две полосы а-ЛП,

еще ниже расположен альбумин, на котором
адсорбированы неэтерифицированные жирные

кислоты, обычно отличающиеся по цвету от

липопротеидов.

Предложено много разных способов коли-

чественно выражать результаты электрофоре-

тического разделения липопротеидов в геле

акриламида, используя для этого различные

варианты денситометрии и элюции, но для

практической лаборатории, которая занимает-

ся фенотипированием гиперлипидемий, доста-

точно визуальной оценки; констатации увели-
чения количества хиломикрон, вi- или пре-в-

ф р а к ц и и .

Л и т е р а т у р а . Маграчева Е. Я. Разде-

ление липопротеидов сыворотки крови методом
дискового электрофореза в полиакриламидном

геле.— Вопр. мед.  х и м и и , 1973, т. 19, №. 6,
с. 652—655.

249

5.7. Гормоны

Определение гормонов в методическом отно-

шении наиболее сложный раздел клинической

биохимии, которым занимаются лишь специаль-

ные лаборатории или отделения больших клини-

ческих лабораторий, так как для выполнения

большинства гормональных методов необхо-

мы определенные условия, в том числе исполь-

зование радионуклидов. В справочнике, который
рассчитан на рядовые КДЛ лечебных учрежде-

ний, приводятся лишь некоторые, относительно

более простые, химические методы определе-

ния гормонов, их метаболитов и близких им

биологически активных веществ. Для специа-

лизированных лабораторий можно рекомендо-

вать вышедшее в 1980 г. справочное пособие

А. Г. Резникова «Методы определения гормо-

нов» (Киев, «Наукова думка»).

В клинической эндокринологии все боль-

шее распространение получает метод конку-

рентного связывания (так называемое радио-

•иммунное определение), область применения

которого, однако, значительно шире, чем опре-

деление гормонов, поэтому он вынесен в спе-

циальный раздел '.

5.7.1. Экстракция и очистка

растворителей

Многие методы определения гормонов вклю-

чают схожие способы экстракции и нуждаются

в растворителях примерно одинаковой степени

чистоты. Чтобы не повторяться при описании

каждого метода; ниже приводятся общие све-

дения по этим вопросам.

Экстракция. Для экстракции используют

не смешивающиеся с водой растворители, в

которые переходят экстрагируемые вещества.

В целом чем больше в экстрагируемом ве-

ществе полярных кетоновых, альдегидных и

спиртовьц групп, тем лучше оно переходит в

не смешивающиеся с водой полярные раство-

рители — высшие спирты, этилацетат и т. д.,

чем меньше полярных групп, тем больше подхо-

дят неполярные растворители (гексан, хлоро-

форм, дихлорметан); эфир занимает промежу-

точное положение. Эффективность экстракции

часто зависит также от рН водного раствора

и его ионной силы (содержание солей). Эффек-

тивнее всего экстракция происходит, если пер-

воначально образуется одна фаза, которая за-

тем разделяется на две добавлением избытка

одного из ингредиентов, на такие условия

удается подобрать не всегда, значительно чаще

просто встряхивают две несмешивающиеся

жидкости. Надо иметь в виду, что объемы

фаз после экстракции очень часто не соответ-

ствуют объемам взятых растворов или раство-
рителей, так как вместе с экстрагируемым ве-

ществом в другую фазу часто переходит и часть

См. с. 30.

растворителя и наоборот; это очень затрудняет

точный отбор аликвоты из какой-либо фазы.

Если вещество плохо экстрагируется, часто ис-

пользуют повторную экстракцию тем же раство-

рителем, а затем оба экстракта смешивают.

Очень важно проводить экстракцию так,

чтобы не образовалась стойкая эмульсия, кото-

рая препятствует разделению фаз. Часто это

зависит от не поддающихся учету примесей,

поэтому надо встряхивать очень осторожно, в

то же время достаточно энергично, чтобы насту-

пило равновесие; в этих случаях определить

нужную  г р а н и ц у помогает только опыт. Обра-

зованию эмульсии в какой-то мере препятствует

увеличение содержания соли в растворе,

эмульсию можно попытаться разделить центри-

фугированием, но это не всегда помогает.

Некоторые авторы рекомендуют проводить

экстракцию в делительных воронках, но в усло-

виях клинической практики, когда жизнь вы-

нуждает  м а к с и м а л ь н о экономить время и реак-

тивы, они неудобны. Лучше экстрагировать в

конических колбах или в пробирках с пришли-

фованными стеклянными или полиэтиленовыми

пробками. Если работают с колбами, надо

использовать мешалки, лучше всего магнит-

ные, в этом случае один лаборант может одно-

временно обрабатывать несколько проб, в то

же время удобно дозировать степень переме-

шивания. При работе с пробирками их встря-

хивают вручную или на встряхивающем (шют-

тель) аппарате, пробирки удобны тем, что если

образуется эмульсия, ее можно постараться

разрешить центрифугированием.

После экстракции один слой отделяют от

другого, обычно значительно легче отсосать

верхний слой и количественно перенести его в

чистую посуду, чем  н и ж н и й . Удобно отсасы-

вать пастеровской пипеткой с грушей, перенося

верхний слой небольшими порциями, при этом,

если по ошибке будет захвачена небольшая

порция нижнего слоя, ее легко вернуть на мес-

то. Работа с грушей требует определенной точ-

ности движений, которая вырабатывается со

временем;  н а ч и н а ю щ и м можно рекомендовать

укрепить пипетку в штативе строго вертикаль-

но и соединить верхний конец резиновой или

лучше хлорвиниловой трубкой со шприцем,

который укреплен на том же штативе. Надо не

забывать смазывать поршень шприца специаль-

ной смазкой или вазелином.

Если верхний слой для дальнейшей работы

не нужен, например при промывании хлоро-

формного экстракта, его иногда отсасывают

пастеровской пипеткой, подсоединенной к водо-

струйному насосу, при этом весь слой сразу же

удаляется в канализацию. Это ускоряет работу,

но имеет тот недостаток, что, если ошибочно

засосана порция нижней фазы, ее спасти уже

невозможно.

Очистка этанола. Абсолютный этанол гото-

вят из 90—96 % этилового спирта кипячением

с СаО или ВаО на водяной бане с электроподо-

гревом с обратным холодильником до тех пор,

пока точка кипения не станет 78,3 °С при нор-

мальном барометрическом давлении. Дла обна-

р у ж е н и я альдегидов к 5 мл этанола добавляют

250