Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 61

оптического пути 0,5см против реактива при

длине волны 625 нм.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о й

к р и в о й и  р а с ч е т . К 0,05—0,2 мл калибро-

вочного раствора добавляют такое количество

кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл,

перемешивают и выдерживают 20 мин при 37 "С,

так же как и опытные пробы, а затем фотомет-

рируют. Окраска калибровочной пробы, в кото-

рую взято 0,05 мл калибровочного раствора,

соответствует содержанию холестерина в плазме

3 ммоль/л, пробы, в которую взято 0,1 мл,—

содержанию 6 ммоль/л и т. д.

П р и м е ч а н и я .  1 . Попадание воды приво-

дит к помутнению раствора. 2. Следы гемо-

лиза или желтушность исследуемой плазмы

или сыворотки служат причиной завышенных

результатов. 3. Можно использовать для

фотометрии и кюветы с длиной оптического

пути 1 см, тогда количество кислотной смеси

удваивают, а количество исследуемого мате-

риала остается прежним.
Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы см. табл. 42.

Л и т е р а т у р а . Пса S. Zschr. ges.  i n n .

Med., 1962, В. 17, H. 2, S. 83.

Унифицированный метод по реакции с хлор-

ным железом (метод Златкис—Зака).  П р и н -

ц и п . Содержащийся в плазме или сыворотке

крови свободный и эфирносвязанный холесте-

рин окисляется хлорным железом в присутствии

уксусной, серной и фосфорной кислот с образо-

ванием ненасыщенных продуктов, окрашенных

в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота

повышает стойкость реактива, содержащего
хлорное железо.

Р е а к т и в ы . 1. Ледяная уксусная кислота.

Для проверки качества реактива к 2—4 мл

уксусной кислоты добавляют несколько кристал-

лов перманганата калия, перемешивают. На

протяжении 40 мин раствор не должен менять

окраски. Кислоту, которая не выдерживает

этого испытания, можно очистить, прокипятив

с хромовым ангидридом и затем подвергнув

перегонке. 2. Серная кислота концентрирован-

ная. 3. Железо хлорное FеСl

3

-6Н

2

О. 4. Орто-

фосфорная кислота; содержит 85% Н

3

РО

4

.

5. Раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного

железа растворяют в 80 мл ортофосфорной

кислоты, нагревая до полного растворения

препарата, затем охлаждают и доводят объем

до 100 мл ортофосфорной кислотой. 6. Цветной

реактив: к 8 мл раствора хлорного железа

добавляют серную кислоту так, чтобы суммар-

ный объем был 100 мл. 7. Калибровочный

раствор холестерина в уксусной кислоте:

116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной

уксусной кислоты. Раствор содержит холестерин

в концентрации 3 ммоль/л.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 1,3мл уксусной

кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы

или сыворотки без следов гемолиза, перемеши-

вают, а затем добавляют 1 мл цветного реакти-

ва, хорошо перемешивают встряхиванием и

оставляют на 30 мин при комнатной темпера-

туре, после чего фотометрируют при длине вол-

ны 530 нм в кювете с длиной оптического пути

1 см против холостого опыта, в который берут

1,3мл уксусной кислоты, 0,05мл исследуемой

сыворотки или плазмы и 1 мл концентрирован-

ной серной кислоты.

Для приготовления калибровочного графика

вместо исследуемого материала берут 0,05—

0,2 мл калибровочного раствора, к которому

добавляют уксусную кислоту до суммарного

объема 1,35мл, а затем добавляют 1 мл цвет-

ного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл

калибровочного реактива, по окраске соответст-

вует опытной пробе с содержанием холестерина

в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба,

в которую взяли 0,1 мл калибровочного раство-

ра, соответствует содержанию холестерина

6 ммоль/л и т. д. Расчет проводят по калибро-

вочному графику.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы см. табл.  4 2
Л и т е р а т у р а . Zlatkis A., Zak В.,

Boyle A. J. Lab.  C l i n . Med., 1957,  v o l . 50, №2,

p. 318; Rosenthal N. I. et al. J. Lab.  C l i n . Med.,

1953,  v o l . 41, p. 486.

5.6.2. Экстракционные методы

определения холестерина и его эфиров

Унифицированный метод по реакции с хлор-

ным железом после экстракции изопропанолом.

П р и н ц и п . Холестерин и его эфиры экстраги-

руют из плазмы или сыворотки изопропанолом.

Для определения общего содержания холестери-

на он весь окисляется хлорным железом в

растворе уксусной, серной и фосфорной кислот

с образованием ярко окрашенных красно-

фиолетовых продуктов. Для определения сво-

бодного холестерина он осаждается в виде

комплекса с дигитонином, осадок промывается

ацетоном и содержание холестерина опреде-

ляется по той же цветной реакции.

Р е а к т и в ы . 1. Изопропиловый спирт (изо-

пропанол). 2. Уксусная кислота ледяная.

3. Ортофосфорная кислота; содержит 85%

Н

3

РО

4

. 4. Серная кислота концентрированная.

5. Железо хлорное, раствор в фосфорной

кислоте: 2,5 г FeCI

3

-6H

2

O растворяют при

нагревании примерно в 80 мл ортофосфорной

кислоты, объем доводят ортофосфорной кисло-

той до 100мл. 6. Цветной реактив: к 8 мл

раствора хлорного железа осторожно при пере-

м е ш и в а н и и приливают серную кислоту до сум-

марного объема 100 мл. 7. Дигитонин, раствор

10 г/л: 1 г дигитонина растворяют при нагрева-

нии в 50 мл этилового спирта, добавляют 50 мл

воды и через некоторое время, после охлажде-

ния, фильтруют. 8. Ацетон. 9. Калибровочный

раствор: 38,7 мг холестерина растворяют в

100мл изопропанола, получают раствор, содер-

жащий 1 ммоль/л; его разводят в 5 раз изопро-

панолом, получая раствор, содержащий
200 мкмоль/л.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл исследуе-

мой плазмы или сыворотки добавляют при

постоянном встряхивании 4,8 мл изопропанола,

тщательно перемешивают и через 10 мин

243

центрифугируют 5 мин, отсасывают надосадоч-

ную жидкость (экстракт); 1 мл экстракта

используется для определения общего холесте-

рина, а 2 мл — для определения свободного

холестерина.

Для определения общего холестерина к 1 мл

экстракта добавляют 2 мл уксусной кислоты,

тщательно перемешивают, а затем добавляют

2 мл цветного реактива, опять перемешивают и

оставляют стоять 10—15 мин. Фотометрируют в

кювете с длиной оптического пути 0,5 см при

длине волны 560 нм против холостой пробы,

в которую берут вместо экстракта плазмы 1 мл

изопропанола.

Для определения свободного холестерина

к 2 мл экстракта добавляют 1 мл раствора

дигитонина, закрывают пробкой и оставляют

на 30 мин, после чего 10 мин центрифугируют.

Надосадочную жидкость осторожно удаляют

и выбрасывают, к осадку добавляют 3 мл аце-

тона, перемешивают и снова центрифугируют

5 мин. Надосадочную жидкость удаляют и

оставляют пробирки открытыми на несколько

минут для испарения остатков ацетона. К сухо-

му осадку добавляют 1 мл изопропанола и 2 мл

уксусной кислоты, перемешивают и затем добав-

ляют 2 мл цветного реактива, при этом осадок

должен полностью раствориться. Через 10 —

15 мин фотометрируют при длине волны 560 нм

в кюветах с длиной оптического пути 0,5см

против холостой пробы, в которую берут 1 мл

изопропанола, 2 мл уксусной кислоты и 2 мл

цветного реактива.

К а л и б р о в к а и р а с ч е т . Для калибров-

ки к 1 мл калибровочного раствора добавляют

2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл цветного

реактива и через 10—15 мин фотометрируют

в таких же условиях, как и опытные пробы.

При расчете количества общего холестерина

калибровочная проба соответствует содержанию

5 ммоль/л холестерина, а при расчете содержа-

ния свободного холестерина — 2,5 ммоль/л.

Л и т е р а т у р а . Сентебова Н. А. Предло-

жения по  у н и ф и к а ц и и методов определения

свободного и этерифицированного холестерина

в сыворотке крови.— Лаб. дело, 1976, № 6,

с. 375—380; Leffler H. Amer. J. Clin. Pathol.,

1959,  v o l . 31, p. 310—313.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Содержа-

ние общего холестерина составляет 3,9—

6,5 ммоль/л (150—250 мг в 100 мл), из них

70% этерифицированный, а 30% свободный.

Более подробная возрастная норма приведена
в табл. 40.

Т а б л и ц а 40. Верхние границы содержания холестерина в сыворотке здоровых мужчин в зависи-

мости от возраста (по данным Института кардиологии АМН СССР)

Содержание холестерина, ммоль/л

Триглицериды, ммоль/л

Возрастные группы (годы)

10—19

5,5

1,53

20—29

5,84

1,82

30—39

6,18

2,21

40—49

6,54

2,71

50—59

6,88

3,27

60 и более

7,22

3,94

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Повышение

содержания холестерина свидетельствует об

угрозе развития атеросклероза; чаще всего

холестерин увеличен при II типе гиперлипо-

протеидемии, повышается он также при диабете

и нефритах. Понижение

1

 содержания холестери-

на чаще всего бывает при гипертиреоидизме.

Определение холестерина в биологическом

материале, высушенном на бумаге.  П р и н -

ц и п . При проведении эпидемиологических

исследований возникает необходимость пересы-

лать пробы, собранные для исследования; в этом

случае удобно предварительно высушивать их

на бумаге, так как это не только упрощает

пересылку, но и обеспечивает консервацию.

Пробы биологического материала — кровь,

плазму, сыворотку — наносят на специально

отмытую фильтровальную бумагу и высушивают

на воздухе. Липопротеидный сгусток высушен-

ного материала растворяют в щелочи, затем

разделяют в смеси хлороформ—метанол на

липидную и водорастворимую фракции. Липид-

ную фракцию выпаривают и в сухом остатке

определяют холестерин по цветной реакции

с уксусным ангидридом. В процессе обработки

щелочью эфиры холестерина разрушаются.

Р е а к т и в ы . 1. Бумага для высушивания

крови. Используют хроматографическую бумагу

или беззольные фильтры. Если при постановке

холостого опыта выясняется, что в бумаге

содержатся вещества, дающие цветную реакцию

с уксусным ангидридом, ее обрабатывают в

аппарате Сокслета на протяжении 1—2 рабочих

дней метанолом и дихлорметаном. 2. 0,3 н.

раствор едкого натра (NaOH). 3. Смесь

дихлорметан-метанол 2:1. В день определения

смешивают 2 объема дихлорметана и 1 объем

метанола (метилового спирта), готовят в таком

количестве, которое будет израсходовано за

I рабочий день. Вместо дихлорметана можно

брать хлороформ. 4. Кислотная смесь: готовят

в день определения путем смешивания 2,5 мл

концентрированной серной кислоты, 25 мл уксус-

ного ангидрида и 50 мл хлороформа. 5. Кали-

бровочный раствор, 3 ммоль/л. Готовят, раство-

ряя 58 мг холестерина в 50 мл хлороформа.

Х о д о п р е д е л е н и я .  Н а сухую фильтро-

вальную бумагу наносят микропипеткой иссле-

дуемый материал так, чтобы определенный

участок бумажки был равномерно смочен, и

дают высохнуть на воздухе. На краю бумаги,

не смоченной плазмой, карандашом записы-

вают номер пробы, фамилию и другие паспорт-

244

ные данные. Проба высыхает на воздухе

обычно за 2—3 ч, после чего ее можно пересы-

лать по почте, упаковывать в конверт и т. д.

Ножницами аккуратно вырезают пятно высу-

шенного биологического материала, удаляя

поля, на которых сделаны записи, бумажку

разрезают на несколько кусочков и кладут в

колбочку или стаканчик, куда наливают также

1,5мл 0,3 н. NaOH и оставляют на несколько

часов, желательно на ночь. Если исследуют

кровь, полноту смывания легко контролировать

по виду бумажки; если исследуется сыворотка,

то конец растворения сгустка не виден,

поэтому лучше оставить ее стоять на большее

время. После этого добавляют 15 мл смеси

метанол—дихлорметан или метанол—хлоро-

форм, при этом образуется однородный раствор,

который перемешивается легкими покачивания-

ми. Для расслоения добавляют 3 мл воды и

слегка перемешивают стеклянной палочкой,

внизу оказывается бесцветная неводная фаза,

а наверху водная, которая может быть окрашен-

ной, если высушивалась кровь или гемолизиро-

ванная сыворотка. Нижнюю фазу отсасывают

тонкой пипеткой, выпаривают в токе воздуха,

к сухому остатку прибавляют 3 мл кислотной

смеси и оставляют в темноте на 30 мин, после

чего фотометрируют при длине волны 625 нм.

Одновременно ставят холостой опыт, в кото-

рый вместо высушенного материала берут кусоч-

ки той же самой фильтровальной бумаги, на

которой высушивали плазму; обычно исполь-

зуют обрезки от фильтров. Если холостой опыт
дает заметную величину порядка 0,05—0,1,

надо фотометрировать на трех длинах волн (525,

625 и 725 нм) и результаты рассчитывать по

формуле:

электрофоретической подвижностью в и пре-в

осаждаются гепарином в присутствии солей

марганца и удаляются центрифугированием,

при этом хиломикроны всплывают, образуя

пленку. В растворе остаются только а-липо-

протеиды, в которых содержание холестерина

определяют любым из описанных методов.

Р е а к т и в ы .  1 . Марганца хлористого

1 моль/л раствор: 197,90 г МnСl

2

-4Н

2

О раство-

ряют в воде и объем доводят в мерной колбе до

1 л. Препарат гигроскопичен, поэтому лучше

сразу приготовить большое количество раство-

ра, который разливают в несколько флаконов и

используют по мере надобности. 2. Гепарин —

фармакопейный раствор, содержащий 5000 ЕД

в 1 мл. Разные препараты несколько отличаются

по осаждающим свойствам, поэтому рекомен-

дуют сделать запас из одной партии и всегда

им пользоваться.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку, уста-

новленную в штативе на ледяной бане, поме-

щают сначала 1 мл исследуемой плазмы или

сыворотки, затем 0,04 мл препарата гепарина,

перемешивают, после чего добавляют 0,04 мл

1 М раствора марганца хлорида, снова тща-

тельно перемешивают и оставляют стоять на

льду еще на 30 мин. Центрифугируют 30  м и н

при 2500 об/мин желательно при температуре

4—6 °С. Пробирки из центрифуги надо выни-

мать осторожно, так как легко взмутить осадок.,

Нижний слой содержит осажденные в-липо-

протеиды, верхний — растворенные а-липопро-

теиды, над которым может плавать еще кольцо

хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком

осторожно отсасывается слой, содержащий

а-липопротеиды, который используют для опре-

деления холестерина любым из описанных выше

методов.

Если сыворотка хилезная, сверху может

быть большой слой хиломикронов, из-под кото-

рого трудно взять пробу. В этом случае реко-

мендуют повторить определение, взяв несколько

миллилитров сыворотки и соответственно увели-

чив другие реактивы, при этом прозрачный

слой оказывается больше и из него легче взять

пробу.

Калибровку проводят так же, как и в методе

определения холестерина, с той разницей, что

содержание холестерина а-липопротеидов зна-

чительно ниже, чем общего, поэтому калибровоч-

ный раствор должен соответствовать содержа-

нию 1—2 ммоля холестерина в 1 л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . 0,9—

1,9 ммоль/л.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Содержа-

ние холестерина а-липопротеидов в крови здоро-

вых людей мало меняется с возрастом и не

подвержено колебаниям вследствие различных

других причин. Величины ниже 0,9 ммоль/л

свидетельствуют о нарушении липидного обмена

и угрозе развития атеросклероза. Повышение

содержания холестерина а-липопротеидов, как

и .повышение общего холестерина в результате

увеличения этой фракции, является доброка-

чественным состоянием.

Л и т е р а т у р а . Титов В. Н., Брснер Е. Д.,

Задоя А. А. и др. Метол и  д и а г н о с т и ч е с к а я

245

В Противном случае достаточно фотометриро-

вать против холостого опыта.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о й

к р и в о й и р а с ч е т . Для построения калибро-

вочной кривой в три пробирки вносят 0,1; 0,2

и 0,3 мл калибровочного раствора, содержащего

3 ммоль холестерина в 1 л хлороформа, т. е.

в первую пробирку берут 0,3 мкмоля, во вторую

0,6 мкмоля, а в третью 0,9 мкмоля. Калибровоч-

ные растворы выпаривают и ставят цветную

реакцию так же, как и в опыте. По полученным

точкам строят калибровочную кривую, учиты-

вая, что первая точка соответствует содержа-

нию холестерина в крови 3 ммоль/л, вторая —

6 ммоль/л, а третья — 9 ммоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :

2,5—4 ммоль/л (100—160 мг в 100 мл) в цельной

крови.

Л и т е р а т у р а . Балаховский И. С., Нато-

чин Ю. В. Проблемы космической биологии.—

М.: Наука, 1973, т. 22, с. 36—56.

5.6.3. Холестерин а-липопротеидов

Определение после осаждения в-липопротеи-

дов гепарином в присутствии солей марганца.

П р и н ц и п . Липопротеиды, обладающие

значимость исследования содержания холесте-

рина в а-липопротеидах.— Лаб. дело, 1979,

№ 1, с. 36—41.

5.6.4. Триглицериды

Триглицериды или нейтральные жиры пред-

ставляют собой сложные эфиры глицерина и

трех остатков жирных кислот, чаще всего

с 16 или 18 атомами углерода. Точный состав

жирнокислотных остатков может колебаться

в определенных пределах и зависит главным

образом от характера питания. Поэтому говорят

о триглицериде не как об индивидуальном

химическом веществе, а как о группе родствен-

ных соединений. Это осложняет выражение

результатов анализа в весовых единицах, т. е.

в г/л или мг/100мл, так как существующие

аналитические методы позволяют определять

количество молекул триглицеридов, но молеку-

лярная масса в разных образцах может быть

несколько отличной. Другая аналитическая

сложность вызвана нестойкостью сложноэфир-

ной связи, которая легко распадается в щелоч-

ной среде, а также под действием ферментов

сыворотки или микроорганизмов.

Методы определения. Не существует хими-

ческих реакций, специфичных для молекулы

триглицерида в целом; их количество опреде-

ляют чаще всего по содержанию глицерина,

который образуется при щелочном или фермен-

тативном гидролизе. Этот путь связан с той труд-

ностью, что глицерин входит также в состав

фосфолипидов, поэтому определение должно

начинаться с выделения фракции нейтрального

жира, свободной от фосфолипидов, или нужно

проводить гидролиз очень специфическим фер-

ментом, который бы отщеплял глицерин только

от триглицеридов, но не от других соединений.

Очень точный и удобный ферментативный

метод заключается в том, что фосфоэнолпиро-

виноградная кислота в присутствии АДФ и

ферментов глицерокиназы и пируваткиназы фос-

форилирует глицерин, при этом освобождается

пировиноградная кислота, количество которой

определяют по ее способности окислять НАД-Н

в присутствии лактатдегидрогеназы, при этом

поглощение света с длиной волны 330—340 нм

падает. Для реализации этого метода необхо-

димы три фермента и три кофактора, поэтому

он может быть налажен только в тех лаборато-

риях, где имеются соответствующие наборы

реактивов заводского изготовления.

Химические методы основаны также на оп-

ределении глицерина, который окисляют йод-

ной кислотой до формальдегида, способного

давать темно фиолетовое окрашивание с хро-

мотроповой кислотой или желтое с ацетилаце-

тоном. Последняя реакция имеет то удобство,

что образующееся вещество можно определять

не только спектрофотометрически, но и флюоро-

метрически. Заслуживает внимания и весьма

перспективный метод, основанный на измере-

нии светопоглощения в инфракрасной области;

его преимущество — можно одновременно опре-

делять несколько липидных соединений.

246

Унификация методов. В 1974 г. был унифи-

цирован широко распространенный в то время,

но трудоемкий метод определения триглице-

ридов, предложенный Карлсоном. Трудоемкость

его была вызвана тем, что липидный экстракт,

содержащий Триглицериды, очищался адсорб-

цией на кремниевой кислоте от фосфолипидов,

а формальдегид, образовавшийся при окисле-

нии глицерина, определялся по реакции с хро-

мотроповой кислотой, которая идет только в

определенных условиях. Разработанные затем

методы избирательной экстракции триглицери-

дов позволяют за один этап получать доста-

точно чистый экстракт. Метод упростился так-

же благодаря использованию менее капризной

реакции на формальдегид с ацетилацетоном.

На этом основан метод, унифицированный

в 1979 г.

Условия взятия материала для исследова-

ния. В связи с тем что Триглицериды — нестой-

кие соединения, легко разрушающиеся под

влиянием сывороточных ферментов, исследова-

ние предпочтительнее делать в плазме, получен-

ной с использованием трилона, так как гепарин

тоже активирует липазу. Хранение пробы не-

сколько дней, особенно если туда попадут

микроорганизмы, также может быть причиной

заниженных результатов.

Унифицированный метод по реакции с аце-

тилацетоном после экстракции смесью гептана

и изопропилового спирта.  П р и н ц и п . Три-

глицериды экстрагируются смесью гептана и изо-

пропилового спирта, в которую переходят толь-

ко неполярные липиды, а более полярные

фосфолипиды остаются в водной фазе. Тригли-

цериды омыляются (гидролизуются) щелочью,

глицерин окисляется йодной кислотой до форм-

альдегида, который определяется по цветной

реакции с ацетилацетоном.

Р е а к т и в ы : 1. Гептан. 2. Изопропило-

вый спирт .(изопропанол) 3. 0,08 н. серная

кислота (примерно 2,2 мл концентрированной

H

2

SO

4

 на 1 л воды). 4. Едкое кали, 6,25 моль/л:

17,8 г K.ON растворяют в 50 мл, осторожно

добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и

перемешивая. 5. Уксусная кислота, 50 г/л.

6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO4-2H2O

(перйодная кислота) в 100 мл 5 % уксусной

кислоты. 7. Аммония ацетат 2 моль/л: раство-

ряют 154 г ацетата аммония во воде, объем

доводят до 1 л. 8. Ацетилацетоновый реактив:

1,5 мл ацетилацетона (СН

3

СОСН

2

СОСН

3

)

разводят раствором уксуснокислого аммония до

суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде

из темного стекла. 9. Калибровочный раствор

триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг три-

олеина в 100 мл изопропилового спирта. Мож-

но использовать и другие калибровочные раст-

воры, перечисленные в примечании.

П р и м е ч а н и е . Если использовать для

калибровки раствор триолеина в изопро-

пиловом спирте, то после экстракции и рас-

слоения объем верхней фазы в калибровоч-

ных пробах оказывается больше, чем в

опытных, что приводит к заниженным

результатам анализа. Чтобы избежать этой