Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 60

0,2 моль/л: готовят из 0,5 моль/л, смешивая

40 мл реактива Г и 60 мл воды. 3. Трихлор-

уксусная кислота, 400 г/л (40%); хранят в

холодильнике. 4. Натрия хлорид, 9 г/л (изото-

нический раствор). 5. Тиобарбитуровая кислота,

50 ммоль/л: растворяют 0,72 г тиобарбитуровой

кислоты примерно в 80 мл воды, доводят рН до

6,0, добавляя 1 н. едкий натр; переливают в мер-

ную колбу и доводят объем водой до 100 мл.

6. Реактивы, необходимые для определения

гемоглобина в гемолизате . 7. Калибровочный

раствор 5-оксиметилфурфурола: 126мг неокра-

шенного препарата растворяют в 100 мл

0,25 моль/л раствора щавелевой кислоты; полу-

чается раствор, содержащий 10 ммоль/л. Его

разводят в 100 раз тем же раствором щавелевой

кислоты; получается раствор с концентрацией

100 мкмоль/л. Из него путем соответствующего

разведения 0,25 моль/л щавелевой кислотой

готовят серию калибровочных растворов с кон-

центрациями 12,5—100 мкмоль/л. Хранят в

замороженном состоянии при —20 °С. Вместо

калибровочного раствора 5-оксиметилфурфуро-

ла можно использовать растворы фруктозы,

которые готовят точно так же, только для исход-

ного раствора с концентрацией 10 ммоль/л

берут 180 мг фруктозы, которые растворяют

в 100 мл раствора щавелевой кислоты

0,25 моль/л.

Х о д о п р е д е л е н и я . Кровь для исследо-

вания берут, используя в качестве антикоагу-

лянта этилендиаминтетрауксусную кислоту или

ее соли. В 10 мл изотонического раствора хлори-

да натрия выливают 0,3—0,5 мл цельной крови,

перемешивают и центрифугируют. Надосадоч-

ную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов

снова добавляют 10 мл изотонического раствора

хлорида натрия, перемешивают и снова центри-

фугируют. Отмытые эритроциты могут хранить-

ся в ожидании анализа при —4 °С до 15 дней.

Взвесь плотноупакованных эритроцитов в

количестве  0 , 1 м л переносят в  1 , 4 м л воды

и перемешивают, в растворе определяют гемо-

глобин любым методом. При этом надо иметь

в виду, что концентрация гемоглобина в раство-

ре примерно в 7 раз меньше, чем в цельной крови,

т. е. около 20 г/л. Результаты выражают в мо-

лях на

 1 л.

К 1 мл гемолизата добавляют 0,5 мл щаве-

левой кислоты 0,5 моль/л и закрывают пробирку

плотной резиновой пробкой, в которую вставле-

на тонкая игла для инъекций. Закрытую пробкой

пробирку ставят на кипящую водяную баню и

через 10 мин вынимают иглу, а плотно закрытую

пробирку продолжают нагревать при 100 °С

еще 5 ч. После этого охлаждают в ледяной воде

и добавляют I мл охлажденной на льду трихлор-

уксусной кислоты. Тщательно перемешивают и

осадок отделяют центрифугированием в течение

10 мин при l000g. К 1,5мл надосадочной жид-

кости добавляют 0,5 мл раствора тиобарбитуро-

вой кислоты и помещают на 30 мин в водяную

баню при 40 °С, после этого фотометрируют

в кювете с длиной оптического пути 1 см при

длине волны 443 нм против холостого опыта,

окраска стабильна на протяжении по крайней

мере 2 ч.

На всю серию определений ставят один

холостой опыт. Для этого смешивают остатки

нескольких гемолизатов и из верхнего слоя

отбирают 1 мл, в нем проводят гидролиз и

осаждение белков трихлоруксусной кислотой;

так же как и в опыте, отбирают 1,5 мл надоса-

дочной жидкости, но к ней добавляют вместо

раствора тиобарбитуровой кислоты 0,5 мл воды.

Смесь инкубируют вместе с пробами 30 мин при

40 °С.

Для построения калибровочного графика к

1 мл калибровочного раствора, содержащего

5-оксиметилфурфурол в концентрации 12,5—

100 мкмоль/л, добавляют 0,5 мл воды и 1 мл

раствора трихлоруксусной кислоты, из пробы

отбирают 1,5мл, к которым добавляют 0,5мл

раствора тиобарбитуровой кислоты и ставят

цветную реакцию,  и н к у б и р у я на водяной бане

при 40 °С в течение 30 мин, так же как и в основ-

ном опыте. Калибровочные пробы фотометри-

руют против холостой калибровочной пробы,

в которую вместо калибровочного раствора

5-оксиметилфурфурола берут 1 мл раствора ща-

велевой кислоты 0,25 моль/л.

Для выполнения расчета сначала вычисляют

содержание гликозилированного гемоглобина в

1 л эритроцитов, для этого содержание 5-окси-

метилфурфурола, вычисленное по калибровоч-

ному графику, умножают на 15 (разведение

при получении гемолизата). Затем вычисляют

содержание гемоглобина в той же эритроцитяр-

ной массе, умножая содержание его в гемолиза-

те на 15; чтобы перевести полученный результат

в ммоль/л, его делят на 64. Чтобы количество

гликозилированного гемоглобина выразить в

молярных процентах, его содержание в эритро-

цитарной массе, выраженное в ммоль/л, делят

на содержание гемоглобина в тех же единицах

и умножают на 100. Для расчета можно вос-

пользоваться формулой:

См. с. 107.

где Е

443

 — оптическая плотность при длине

волны 443 нм.

239

где Гли-НЬ — содержание оксиметилфурфурола

в гемолизате (ммоль/л); НЬ — содержание

гемоглобина в гемолизате (г/л).

П р и м е ч а н и е . В данном методе после

гидролиза и осаждения белков трихлоруксус-

ной кислотой раствор оказывается слегка окра-

шенным, поэтому вводят специальную холо-

стую пробу. Ее оптическая плотность очень

мало варьирует от одного гемолизата к дру-

гому, поэтому можно ставить только одну

пробу на всю серию.

'Согласно данным автора метода, содержание

5-оксиметилфурфурола в калибровочном растворе

может быть рассчитано по формуле:

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Содержа-

ние гликозилированного гемоглобина, опреде-

ленное этим методом, 4,5—6,1 молярных %,

коэффициент  в а р и а ц и и методики, по данным

авторов, 5,7 %.

Л и т е р а т у р а . Standefer J. С., Eaton R. Р.

Evolution of colorimetric method for  d e t e r m i n a -

tion of glycosilated hemoglobin.— Clin. Chem.,

1983, № 1, vol. 29, p. 135—137.

К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е . Количество

гликозилированного гемоглобина — важный по-

казатель эффективности лечения диабета. Чем

ближе к норме его содержание, тем лучше

подобрана терапия.

5.5.7. Молочная кислота

Метод по реакции с параоксидифенилом.

П р и н ц и п . Из молочной кислоты в присут-

ствии серной, фосфорной кислот и солей меди

образуется уксусный альдегид, который, реаги-

руя с параоксидифенилом (С

6

Н

5

С

6

Н

4

ОН), дает

фиолетово-окрашенные продукты. Реакция

очень чувствительна, поэтому надо строго вы-

держивать все условия выполнения исследова-

ния.

Р е а к т и в ы .  1 . Концентрированная серная

кислота, выдерживающая пробу Саваля. От ее

качества зависит возможность выполнения

анализа, иногда качество кислоты можно улуч-

шить, нагревая ее и по каплям добавляя в

нагретую кислоту перекись водорода. 2. Смесь

из 3 г медного купороса (CuSO

4

-5H

2

O) и 9 мл

ортофосфорной кислоты. Должен образоваться

гомогенный раствор, на что уходит некоторое

время. 3. 1,5 % раствор параоксидифенила

(С

6

Н

5

С

6

Н

4

ОН) в диметилформамиде. Раство-

ряют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диметил-

формамида. 4. 5 % трихлоруксусная кислота

(0,3 н.).

Х о д  о п р е д е л е н и я . 0,02  м л крови выли-

вают в 1 мл 5 % трихлоруксусной кислоты, через

несколько минут центрифугируют. К 0,2 мл

безбелкового фильтрата прибавляют 0,1 мл

смеси медного купороса и фосфорной кислоты

и 2,5 мл концентрированной серной кислоты.

Энергично встряхивают и точно через 3 мин ста-

вят ровно на 3 мин в кипящую водяную баню,

затем еще 3 мин охлаждают в ледяной воде.

Добавляют 1 каплю раствора параоксидифени-

ла в диметилформамиде, эта капля должна

сразу попасть в центр пробирки; встряхивают

и оставляют стоять 10 мин при комнатной темпе-

ратуре. После этого нагревают на кипящей

водяной бане  1 ' / 2 М и н , охлаждают в воде и

фотометрируют при длине волны 565 нм.

Одновременно ставят холостой опыт, в кото-

рый вместо безбелкового фильтрата берут 5 %

раствор трихлоруксусной кислоты, и калибро-

вочные опыты, в которые берут растворы три-

хлоруксусной кислоты, содержащие в 0,2 мл

2—20 нмоль молочной кислоты или молочно-

кислого лития; их обрабатывают так же, как

опытные. Окраска калибровочной пробы, в кото-

рую взято 2 нмоля молочной кислоты, соответ-

ствует пробе с содержанием 0,5 ммоль/л; соот-

ветственно окраска пробы, содержащей 20 нмоль,

соответствует концентрации 5 ммоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В хорошо

артериализованной крови содержание молочной

кислоты должно быть ниже 1 ммоль/л.

Л и т е р а т у р а . Балаховский И. С., Нато-

чин Ю. В. Проблема космической биологии.—

М.: Наука, 1973, т.  X X I I , с. 32.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Любая

форма гипоксии — при наркозе, физической

нагрузке, местном нарушении кровообраще-

ния — приводит к увеличению содержания мо-

лочной кислоты в крови.

5.6. ЛИПИДЫ

Липиды нерастворимы в воде, поэтому

в плазме крови они присутствуют только в

составе липопротеидов, которые образуют устой-

чивые коллоидные растворы и по многим свой-

ствам близки к белкам. Для каждого липопро-

теида специфична его белковая часть — апо-

протеид, которая и определяет свойства ком-

плекса в целом и его клинико-физиологическое

значение. Липидная часть менее специфична,

так как разные липопротеиды содержат одни

и те же липидные вещества, но в разных соотно-

шениях. Исследовав липидный состав плазмы,

можно лишь приблизительно оценить ее лиио-

протеидный состав.

Различают три группы, или семейства, липо-

протеидов. Наиболее крупные частицы у хило-

микронов и липопротеидов очень низкой плот-

ности (VLDL), они богаты триглицеридами,

содержат апопротеиды, обозначаемые латин-

ской буквой С. Менее крупные частицы у липо-

протеидов низкой плотности (LDL), которые

содержат апопротеиды группы В, при электро-

форезе попадают главным образом в (3-полосу.

Самые мелкие частицы у липопротеидов высо-

кой плотности (HDL), в состав которых входят

апопротеиды А, при электрофорезе они попада-

ют в а-полосу.

Поскольку современная лабораторная диаг-

ностика не располагает простыми и надежными

методами количественного определения индиви-

дуальных липопротеидов по их апопротеидам,

приходится использовать косвенные методы;

электрофоретическое исследование, осаждение

гепарином и определение содержания отдельных

липидов.

В плазме крови человека присутствуют

четыре основных класса липидов: 1) холестерин

и его эфиры; 2) триглицериды; 3) фосфолипиды;

4) неэтерифицированные жирные кислоты

(НЭЖК). Первые три класса веществ образуют

240

комплексы с апопротеидами и входят в состав

липопротеидов, НЭЖК главным образом адсор-

бированы на альбумине. Наибольшее клини-

ческое значение имеет определение холестерина

и триглицеридов — клиническое значение НЭЖК

значительно скромнее; фосфолипидам крови

сейчас также не придают большого клиниче-

ского значения.

Для определения холестерина используются

обычно характерные для него цветные реакции,

триглицериды определяют по количеству входя-

щего в их состав глицерина, НЭЖК — титро-

метрическим методом, а фосфолипиды — по

входящему в их состав фосфору. В настоящем

разделе рассматриваются лишь методы опреде-

ления холестерина, триглицеридов и НЭЖК;

определение фосфолипидов излагается вместе

с методами определения фосфорных соединений.

Перспективен метод инфракрасной спектроско-

пии, позволяющий одновременно определять

концентрацию нескольких различных липидов.

Сложноэфирная связь, соединяющая остат-

ки жирных кислот с глицерином в триглицери-

дах и фосфолипидах, а также участвующая

в образовании эфиров холестерина, очень

нестойка, она разрушается в щелочной среде,

а также под влиянием присутствующей в плаз-

ме диацилглицеролипазы, которая активируется

гепарином, вероятно, и под действием других

гидролитических ферментов. Поэтому кровь для

исследования липидов необходимо брать с со-

блюдением ряда предосторожностей: лучше

всего анализировать плазму, полученную с

ЭДТА (трилоном Б) в качестве антикоагулянта;

получение плазмы должно проводиться по

возможности на холоду, а хранение должно

быть ограниченным по времени.

5.6.1. Холестерин и его эфиры

Находящийся в тканях свободный (неэтери-

фицированный) холестерин входит в состав

клеточных мембран. Переходя в плазму крови, он

там этерифицируется, образуя сложные эфиры

с  ж и р н ы м и кислотами, источником которых слу-

жит фосфатидилхолин (лецитин). Реакция пере-
этерификации ускоряется плазмаспецифическим

ферментом фосфатидилхолинхолестеринацил-

трансферазой, которая вырабатывается пе-

ченью. При заболеваниях печени, когда нару-
шена выработка фермента, количество эфиров

холестерина в плазме крови уменьшается. Среди

жирных кислот, которые соединяются эфирной

связью с холестерином, больше всего линолевой

(18:2), олеиновой (18:1) и пальмитиновой (16:0)

кислот. В меньших количествах присутствуют

и другие жирные кислоты с 16—20 атомами угле-

рода; соотношение их может сильно варьировать

и зависит главным образом от состава поступаю-

щих с пищей жиров. Помимо холестерина, в

организме, в частности в плазме крови, присут-

ствуют в небольших количествах продукты его

неполного биосинтеза и распада, растительные

стероиды из пищи, сульфитированныо производ-
ные и т. д. Присутствие этих производных, хотя

и в небольших количествах, так же как и измен-

чивость остатков  ж и р н ы х кислот, образующих

эфиры, осложняет анализ.

В эритроцитах, так же как и в других клет-

ках, содержится  л и ш ь свободный холестерин,

количество которого значительно отличается от

содержания в плазме, поэтому, хотя и прослежи-

вается общий параллелизм между его содержа-

нием в плазме и цельной крови, практически для

исследования пригодна лишь плазма или сы-

воротка.

Методы определения.  С а м ы м точным мето-

дом определения холестерина считается фер-

ментативный, основанный на действии холесте-

риноксидазы, в результате чего образуются

холестенон и перекись водорода. Оба эти

вещества могут быть определены сравнительно

простыми методами: холестенон — по измене-

нию светопоглощения при длине волны 240 нм,

перекись водорода — теми методами, которые

используются при определении глюкозы. Слож-

ность ферментных методов определения холесте-

рина в первую очередь определяется дефицитом

соответствующих ферментов, которые трудно

очистить от каталазы, разрушающей перекись
водорода, а также тем, что фермент активен

лишь в отношении свободного холестерина,

поэтому эфирносвязанный холестерин должен

быть предварительно гидролизован. Преиму-

щество ферментного метода состоит в том, что он

может быть применен непосредственно к сыво-

ротке или плазме без предварительного разру-

шения липопротеидных комплексов. В условиях

лаборатории лечебного учреждения можно на-

ладить такое определение холестерина только

с помощью выпускаемых промышленностью

наборов реактивов, поэтому в справочнике эти

методы не приводятся.

При окислении холестерина, так же как и при

его дегидратировании, могут образовываться

самые разнообразные окрашенные или флюо-

ресцирующие продукты. На этом основано не-
сколько цветных реакций на холестерин. Из них

в аналитических целях широкое распростране-

ние получили две: Либермана — Бурхарда и

Златкиса—Зака. Первая из них заключается

в том, что в сильно кислой среде в присутствии

уксусного ангидрида от холестерина отщепляет-

ся вода и образуется окрашенное в зеленовато-

синий цвет соединение, содержащее несколько

сопряженных двойных связей, предположитель-

но бисхолестадиенилмоносульфоновую кислоту.

Реакция может протекать в самых разнообраз-

ных растворах, содержащих, помимо уксусного

ангидрида, уксусную и серную кислоты, а также

органические растворители, лишь бы среда была

абсолютно безводной. Протеканию реакции спо-

собствуют арилсульфоновые кислоты — сульфо-

салициловая, паратолуенсульфоновая, диметил-

бензолсульфоновая. Эфиры холестерина в этих

условиях расщепляются и окрашивание разви-

вается, но реакция идет медленнее, чем со сво-

бодным холестерином. Реакция ускоряется при

повышении температуры, яркий свет разрушает

окрашенные продукты. Помимо холестерина,

ряд других родственных продуктов дает такое

же окрашивание, но в связи с тем что в биологи-

ческих жидкостях их мало, реакция оказывается

241

достаточно специфичной для холестерина,

превосходя в этом отношении другие химические

реакции. Наиболее вероятная причина завышен-

ных результатов — присутствие билирубина или

гемоглобина.

Другая цветная реакция, получившая широ-

кое распространение в медицинской практике,

называется реакцией Златкиса—Зака. Она

основана на том, что при окислении холестерина

хлорным железом в концентрированной серной

кислоте развивается красно-фиолетовое окра-

шивание. Эта реакция в 4—5 раз чувствитель-

нее, чем реакция Либермана—Бурхарда, но

менее специфична, поскольку более широкий

круг веществ, в частности витамин А, дает такое

же окрашивание, как и холестерин. Как и в

случае реакции Либермана—Бурхарда, эфирно-

связанный холестерин дает окрашивание, но

медленнее, чем свободный.

Присутствующие в плазме крови эфиры

холестерина образуются непосредственно в

плазме в результате переноса остатков жирных

кислот фосфатидилхолинов (лецитина) на сво-

бодный холестерин. Эта реакция ускоряется

плазмаспецифическим ферментом ЛХАТ, кото-

рый вырабатывается печенью. При ее пораже-

нии синтез фермента нарушается и количество

эфиров холестерина уменьшается. Поэтому

степень этерификации холестерина имеет опре-

деленное клинико-диагностическое значение.

Для ее определения чаще всего используют

способность свободного холестерина образовы-

вать нерастворимые соединения с дигитонином,

томатином, пиридинсульфатом и другими веще-

ствами, по большей части гликозидами; исполь-

зуют также хроматографическое разделение

свободного и эфирносвязанного холестерина,

существуют и так называемые кинетические

методы, которые основываются на том, что сво-

бодный холестерин образует цветное окраши-

вание, значительно быстрее, чем его эфиры.

Для рядовых лабораторий, где работа выпол-

няется вручную, хроматографические методы

слишком громоздки, кинетические мало надеж-

ны, поэтому практически пригодны лишь методы

с осаждением дигитонином. При определении

эфиров холестерина всегда надо иметь в виду,

что эти соединения непрочные, легко гидроли-

зуются в щелочной среде.

Присутствующие в плазме крови белки и

пигменты мешают количественному определе-

нию холестерина посредством цветных реакций,

обуславливая дополнительное окрашивание или

мутность раствора, поэтому наиболее точные

методы предполагают выделение холестерина

путем экстракции различными комбинациями

смесей этилового и изопропилового спирта,

эфира, ацетона и т. д. и омыление (гидролиз)

эфиров щелочью. В последние годы, особенно

после появления автоанализаторов, разработа-

ны достаточно совершенные прямые методы, т. е.

без предварительного выделения холестерина

путем экстракции. Более старые, классические

методы определения холестерина предусматри-

вали использование в качестве экстрагентов

смесей спирт — эфир или спирт — петролейный

эфир, но оказалось, что экстракция изопропи-

242

ловым спиртом быстрее и эффективнее, поэтому

она рекомендована в унифицированных методах.

Поскольку холестерин обычно определяют в тех

же случаях, что и триглицериды, желательно

использовать реактив, одинаково хорошо

экстрагирующий оба вещества, например смесь

гексан—изопропиловый спирт—серная кислота.

В целом при ручной работе экстракционные

методы оказываются точнее и надежнее.

В некоторых случаях, например при проведе-

нии эпидемиологических исследований, жела-

тельно анализировать высушенный материал,

который удобно пересылать и хранить. Для

этого плазму крови высушивают на фильтро-

вальных бумажках; сложность анализа в этом

случае определяется тем, что прочность связи

холестерина с белками увеличивается и прихо-

дится предварительно обрабатывать белково-

липидный комплекс щелочью, которая гидроли-

зует большинство сложноэфирных связей.

Унификация методов. Учитывая разнообра-

зие как возможностей, так и потребностей лабо-

раторий различных лечебных учреждений,

унифицировано несколько методов определения

холестерина. Для небольших лабораторий не-

специализированных лечебных учреждений

подходит унифицированный в 1972 г. метод

определения общего холестерина по реакции

с уксусным ангидридом, а также унифициро-

ванный в 1972 г. прямой метод определения об-

щего и эфирносвязанного холестерина по реакции

с хлорным железом. Для более крупных лабора-

торий лечебных учреждений кардиологического

или эндокринологического профиля более подхо-

дит унифицированное в 1979 г. определение

общего и свободного холестерина по реакции

с хлорным железом после экстракции изопропа-

нололом.

Общий холестерин. Унифицированный метод

по реакции с уксусным ангидридом (метод

Илька).  П р и н ц и п . Присутствующий в плаз-

ме или сыворотке крови холестерин и его эфиры

дают цветное окрашивание при обработке

смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной

кислот.

Р е а к т и в ы . 1. Ледяная уксусная кислота.

2. Концентрированная серная кислота. 3. Уксус-

ный ангидрид. 4. Абсолютный этиловый спирт.

5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают

10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксус-

ного ангидрида, затем при постоянном переме-

шивании и охлаждении добавляют 10 мл кон-

центрированной серной кислоты. Смесь должна

быть бесцветной или слегка желтоватой, хра-

нить в холодильнике в темной склянке с притер-

той пробкой. 6. Калибровочный раствор:

232 мг холестерина растворяют в 2—3 мл хлоро-

форма и доводят до объема 100 мл абсолют-

ным этиловым спиртом. Приготовленный

раствор содержит холестерин в концентрации

6 ммоль/л.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 2 , 1  м л кислотной

смеси медленно по стенке пробирки добавляют

0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков

гемолиза, перемешивают встряхиванием и ста-

вят на 20 мин в термостат или водяную баню при

37 °С, затем фотометрируют в кювете с длиной