Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 63

0,2 мл раствора калия перманганата, содер-

жащего 200 мг в I л (1:5000); раствор не дол-

жен обесцвечиваться на протяжении 20 мин,

изменение окраски указывает на присутствие

альдегидов. Пищевой спирт обычно содержит

больше альдегидов, чем гидролизный.

Для удаления альдегидов можно использо-

вать два способа: с 2,4-динитрофепилгидрази-

ном и с серебра нитратом. В первом случае

к 1 л этилового спирта добавляют 2 г гидро-

хлорида 2,4-динитрофенилгидразина и 0,5 мл

концентрированной НС1, закрывают пробкой

и оставляют стоять 2 сут в темноте, затем пере-

гоняют. При очистке с помощью серебра нитра-

та в 100 мл горячего этанола растворяют 7 г

AgNO

3

 и добавляют туда 15 г едкого кали,

раствор выливают в 4 л подлежащего очистке

этилового спирта. Выпадает темный осадок,

который постепенно оседает на дно. Через сут-

ки его отделяют декантацией или фильтрова-

нием, этанол перегоняют, отбрасывая первую и

последнюю порции.

Очистка хлороформа и дихлорметана (ме-

тиленхлорида). Для определения гормонов луч-

ше всего использовать хлороформ марки «для

наркоза», содержащий небольшое количество

спирта, что делает его более стабильным. Для

очистки хлороформа или дихлорметана других

марок, а также для регенерации тех порций

растворителя, которые уже один раз использо-

вались для экстракции гормонов, их взбалты-

вают с концентрированной серной кислотой на

протяжении 1 или 2 рабочих дней, при этом

серная кислота темнеет тем скорее, чем более

загрязнен растворитель. Встряхивание надо

проводить в темноте; удобно пользоваться маг-

нитной мешалкой, закрывая колбу светонепро-

ницаемым колпаком. После этого кислоту отса-

сывают, хлороформ или дихлорметан промы-

вают водой, а затем на протяжении нескольких

часов концентрированным раствором аммиака,

1 н. NaOH или насыщенным раствором натрия

карбоната, затем опять промывают водой и осу-

шают безводным натрия сульфатом или натрия

карбонатом. После осушения растворитель

перегоняют, используя стеклянный перегонный

аппарат на шлифах, нагреватель обязательно

должен быть электрический с водяной баней.

Конкретный режим очистки во многом зави-

сит от качества исходного растворителя; не-

которые партии этими методами вообще очис-

тить не удается. Об эффективности очистки

лучше всего судить, поставив холостой или

калибровочный опыт.

Очистка эфира. Для удаления перекисей

эфир взбалтывают с 10 % раствором железа

сульфида (сернистого железа — FeS) в 1 н.

серной кислоте, затем промывают водой. Для

проверки  н а л и ч и я перекисей 200 мл эфира вы-

паривают, остаток растворяют в 2 мл абсо-

лютного этанола. Из этого количества отби-

рают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 %

спиртового раствора метадинитробензола и

0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле;
окраска не должна превышать той, которая

развивается при добавлении к тем же реакти-

в а м Г)  м к г  к р и с т а л л и ч е с к о г о кетостероида.

Очистка этилацетата. Несколько раз про-

мывают яркоокрашенным водным раствором

перманганата калия. Промывание повторяют

до тех пор, пока раствор не перестанет приобре-

тать фиолетовый оттенок, затем отмывают во-

дой 3—5 раз, осушают безводным сульфатом

натрия и перегоняют.

5.7.2. 17-Кетостероиды

Унифицированный метод по цветной реакции

с метадинитробензолом.  П р и н ц и п . Эфиры

17-кетостероидов (17-КС) с глюкуроновой и

серной кислотами гидролизуют нагреванием в

кислой среде в присутствии формальдегида,

который уменьшает образование темноокра-

шенных продуктов. Кетостероиды экстраги-

руют эфиром и определяют по цветной реак-

ции с метадинитробензолом. Побочные окра-

шенные продукты, мешающие фотометрирова-

нию, удаляют избирательной экстракцией.

Р е а к т и в ы .  1 . НС1 концентрированная.

2. Уксусная кислота ледяная. 3. Формальдегид,

водный раствор: 50 мл имеющегося в продаже

40 % раствора формалина смешивают с 250 мл

воды. 4. Едкий натр, 100 г/л: 10 г NaOH раст-

воряют в 50—60 мл воды, после охлаждения

объем доводят водой до 100 мл. 5. Этиловый

эфир, свободный от перекисей. 6. Хлороформ

очищенный. 7. Этиловый спирт 50 %. Смеши-

вают равные объемы этилового спирта и воды.

8. Этиловый спирт абсолютный. 9. Едкое кали,

раствор 5 моль/л в метаноле: растворяют 28 г

КОН в дважды перегнанном метиловом  с п и р -

те, объем доводят до 100 мл и немедленно

фильтруют (в противном случае раствор может

потемнеть) и проверяют концентрацию титро-

ванием 0,1 н. кислотой, используя в качестве

индикатора метиловый оранжевый. Хранят в

темной склянке в холодильнике. 10. Метади-

нитробензол, раствор 20 г/л в абсолютном эти-

ловом спирте: 400 мг метадинитробензола

растворяют в 20 мл абсолютного этанола. В

случае необходимости метадинитробензол

можно очистить перекристаллизацией, для это-

го в колбу вместимостью 3 л помещают 20 г

препарата, которые растворяют в 750 мл этило-

вого спирта, нагревая до 40 °С. Затем прибав-

ляют 100 мл 2 н. NaOH, перемешивают, охлаж-

дают и быстро добавляют 2,5 л холодной воды,

при этом должны выпасть мелкие кристаллы,

которые собирают, фильтруя раствор в воронке

Бюхнера.  1 1 . Калибровочный раствор. Навеску

в несколько миллиграммов дегидроэпиандро-

стерона или андростерона растворяют в таком

количестве этилового спирта, чтобы концентра-

ция составила 100  м к г / м л .

Х о д  о п р е д е л е н и я . Суточную мочу

собирают в чистую посуду; если выпадает оса-

док, его тщательно перемешивают и из всего

количества отбирают 5—20 мл в зависимости

от содержания кетостероидов. Объем доводят

изотоническим раствором натрия хлорида до

20 мл, добавляют 3 мл HCI, 1 мл уксусной

кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида.

Колбу закрывают стеклянной затычкой груше-

видной формы (можно использовать воронки

или неплотноприлегающие стеклянные пробки)

и ставят на 15 мин на кипящую водяную баню;

этот этап надо проводить под тягой или в хо-

рошо проветриваемом помещении.

После охлаждения содержимого колбы его

дважды экстрагируют  п о р ц и я м и по 10 мл эфи-

ра, экстракты сливают вместе, сначала промы-

вают 10 мл 10 % раствора едкого натра, затем

водой. Экстракцию и промывание можно про-

водить в делительных воронках, но лучше в

колбочках, используя для перемешивания маг-

н и т н у ю мешалку, или в пробирках с притерты-

ми  с т е к л я н н ы м и пробками. Вместо промывания

10 % раствором NaOH можно добавлять гра-

нулы едкого натра в  э ф и р н ы й экстракт, кото-

р ы й затем сливают в чистую посуду. Промытый

эфирный экстракт небольшими порциями пере-

носят в пробирку, в которой выпаривают на

водяной бане при температуре не выше 50 °С

при встряхивании, под струей воздуха или луч-

ше азота. Сухой экстракт можно оставить на

несколько дней в ожидании окончания анализа.

В пробирку с сухим экстрактом добавляют

0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле,

0,2 мл абсолютного этанола и 0,2 мл 2 % спир-

тового раствора метадинитробензола, переме-

шивают и оставляют в темноте при комнатной

температуре на 1 ч. После этого добавляют

4 мл 50 % этанола и 2 мл хлороформа, энер-

гично встряхивают и дают образоваться двум

слоям. Верхний, водно-спиртовой, слой корич-

невого цвета, содержащий загрязнения, отса-

сывают,  н и ж н и й слой фиолетового цвета фото-

метрируют в кюветах с длиной оптического

п-ути 0,5 см против холостого опыта при длине

волны 520 нм; кюветы закрывают крышками.

Одновременно ставят холостой опыт, в который

вместо пробирки с высушенными экстрактами

берут  ч и с т у ю пробирку, в которую помещают

по 0,2 мл этанола, 5 н. раствора едкого кали

в метаноле и 2 % раствора метадинитробензола,

дальнейшую обработку проводят так же, как

и опытных проб.

Для калибровки к 20 мл изотонического

раствора натрия хлорида добавляют 0,5 мл

калибровочного раствора, т. е. 50 мкг кетосте-

роида; в дальнейшем калибровочную пробу

обрабатывают так же, как и опытную пробу

мочи.

При  н а л а ж и в а н и и методики или смене ре-

активов рекомендуется построить калибровоч-

н ы й график, для приготовления которого берут

(1,5; 1; 1,5 и 2 мл калибровочного раствора.

Р а с ч е т проводят  п о правилу пропорций.

Получается содержание кетостероидов в 20 мл

мочи. Чтобы узнать выведение за сутки, полу-

ченную величину делят на 20 и умножают на

н е л и ч и н у суточного диуреза.

Упрощенный метод по реакции с метади-

нитробензолом.  П р и н ц и п . Принцип и ход

определения такой же, как и в  у н и ф и ц и р о в а н -

ном методе, но некоторые детали упрощены,

что практически не сказывается на точности
метода. Чтобы  у м е н ь ш и т ь ошибки, вызванные

посторонними веществами,  э к с т и н к ц и ю изме-

ряют трехволновым методом.

252

Р е а к т и в ы . 1. НС1 примерно 30%.

К 80 мл концентрированной HCI добавляют

20 мл воды. 2. Дихлорметан (метиленхлорид).

3. Этиловый эфир, лучше использовать марки

«для наркоза». 4. Этиловый спирт 30 %. К 35 мл

96 % этилового спирта добавляют воды до

объема 100 мл. 5. Едкое кали, спиртовой рас-

твор 200 г/л. Растворяют 2 г КОН в 10 мл эти-

лового спирта, нерастворившиеся примеси отде-

ляют центрифугированием. Раствор нестоек.

6. Метадинитробензол, спиртовой раствор 5 г/л.

Растворяют 250 мг метадинитробензола в 50 мл

этилового спирта. 7. Едкое кали или едкий натр

гранулированный. 8. Калибровочный раствор.

Навеску в несколько миллиграммов дегидро-

эпиандростерона или андростерона растворяют

в таком количестве этилового спирта, чтобы

концентрация составила 500 мкг/мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  И з тщательно

перемешанной суточной мочи отбирают 10 мл

в большую пробирку или колбочку, желательно

с притертой пробкой, добавляют 10 мл 30 %

HCI и кипятят на водяной бане 10  м и н . Этот

этап надо проводить под тягой. После охлажде-

ния добавляют 10 мл дихлорметана или эфира

и тщательно встряхивают; когда слои разде-

ляются, водный слой удаляют. Если для эк-

стракции используют дихлорметан, который тя-

желее воды, то водный слой оказывается свер-

ху, поэтому его легче удалить, чем при

экстракции эфиром, который оказывает-

ся в верхнем слое. После удаления водной

фазы к органической добавляют 10—20 гранул

КОН или NaOH для осушения. Они должны

быть добавлены в таком количестве, чтобы

образовался конгломерат, впитавший всю

оставшуюся водную фазу, а дихлорметановый

слой был подвижным, прозрачным и однород-

ным. Отбирают 5 мл экстракта, которые пере-

носят в чистую сухую пробирку, где выпари-

вают в токе воздуха или азота при температу-

ре не выше 50 °С.

К сухому остатку добавляют 0,4 мл раство-

ра метадинитробензола и 0,2 мл раствора ед-

кого кали и выдерживают 40 мин в темноте при

35 °С для развития реакции. После этого до-

бавляют 2 мл этилового спирта и 5 мл эфира,

встряхивают и дают разделиться слоям. Верх-

ний (эфирный) слой переносят в кювету дли-

ной оптического пути 1 см, закрывают крышкой

и фотометрируют при трех длинах волн — 440;

520 и 600 нм против кюветы, заполненной во-

дой. Следует иметь в виду, что в результате

испарения эфира температура проб понижает-

ся, они мутнеют, что мешает фотометрии,

поэтому кюветы с пробами обязательно надо

закрывать крышками.

Для построения калибровочного графика в

сухие чистые пробирки вносят 0,05—0,15 мл

калибровочного раствора, т. е. 25—75 мкг кето-

стероида, и выпаривают досуха в токе воздуха

или  л у ч ш е азота. В темном месте такие под-

готовленные пробы могут храниться несколько

месяцев. В каждую пробирку вносят 0,4 мл
раствора динитробензола и 0,2 мл спиртового

раствора едкого кали, дальнейшая обработка

такая же, как и для опытных проб.

Строят калибровочный график, откладывая на

одной оси Е

исп

 а на другой — содержание кето-

стероида в калибровочной пробе. В связи с тем

что в конечном итоге в исследуемой пробе

оказываются все кетостероиды, содержавшиеся

в 5 мл мочи, чтобы узнать концентрацию, вы-

раженную в мг/л, полученную величину делят

на 5; чтобы узнать выведение за сутки, кон-

центрацию умножают на суточный диурез.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Экскреция

17-КС у мужчин 23—80 мкмоль/сут (8—29

мг/сут), у женщин 22—60 мкмоль/сут (8—

22 мг/сут).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние 17-КС свидетельствует о гиперсекреции

глюкокортикоидов (синдром Кушинга), чаще

всего вследствие опухоли надпочечника, гипо-

физа или АКТГ продуцирующей опухоли лег-

ких, уменьшение — признак пониженной выра-

ботки глюкокортикоидов и мужских половых

гормонов.

5.7.3. 17-Оксикортикостероиды

Определение в моче по реакции с фенил-

гидразиновым реактивом после ферментатив-

ного гидролиза.  П р и н ц и п . 17-Оксикортико-

стероиды (17-ОКС), т.е. глюкокортикоидные

гормоны и их метаболиты, содержащие гидро-
ксильные группы в положениях 17 и 10 и кето-

группу в положении 20, при нагревании с фе-

нилгидразином в смеси серной кислоты и спир-

та дают окрашенные в желтый цвет соедине-

ния. Одновременно с основным опытом ставят

холостой, в котором учитывают неспецифи-

ческую окраску, которая в этих условиях разви-

вается без фенилгидразина. В связи с тем что

большая часть 17-ОКС мочи присутствует в

виде парных соединений с глюкуроновой и сер-

ной кислотами, предварительно проводят гид-

ролиз с помощью фермента глюкуронидазы,

затем 17-ОКС экстрагируют хлороформом или

дихлорметаном и переводят в смесь серной

кислоты и спирта.

Р е а к т и в ы . 1. Хлороформ или дихлорме-

тан, лучше всего марки «для наркоза»

1

. 2. Эти-

ловый спирт

 2

. 3. 2. н. раствор едкого натра.

4. 2 н. раствор НС1. 5. Универсальная индика-

торная бумага; вместо нее можно пользоваться

рН-метром. 6. 0,1 н. раствор едкого натра.

7. Натрия сульфат или натрия карбонат

безводный. 8. Серно-спиртовой реактив. Для

его приготовления используют наиболее чистую

серную кислоту марки «выдерживает пробу

Саваля», стараясь как можно дольше рабо-

1

 Очистку см. с. 251.

2

 Очистку см. с. 250.

тать с одной и той же партией. 310 мл концент-

рированной серной кислоты осторожно выли-

вают в 190 мл воды, охлаждая колбу водой

со льдом, чтобы избежать нагревания, кото-

рое может сказаться на качестве реактива,

100 мл разведенной таким образом кислоты

осторожно смешивают с 50 мл этилового спир-

т а . 9. Фенилгидразиновый реактив: 21,7 мг

гидрохлорида фенилгидразина растворяют в

50 мл серно-спиртового реактива. В случае

необходимости гидрохлорид фенилгидразина

можно приготовить из фенилгидразина осно-

вания, нейтрализуя его НС1 из расчета 10 мл

10 н. HCI на 9,4 г фенилгидразина основания.
Препарат очищают перекристаллизацией из

этилового спирта, для этого 5—10 г вещества

растворяют в 30—40 мл этанола, затем охлаж-

дают в холодильнике, кристаллы отделяют на

фильтре и высушивают. 10. Ацетатный буфер

рН 4,5. Растворяют в воде 5,79 г ацетата нат-

рия, добавляют туда 3,25 мл ледяной уксусной

кислоты, доводят рН до требуемой величины

уксусной кислотой или NaOH и доливают водой

до 1 л. 11. в-Глюкуронидаза, активность

100 000 ЕД в 1 г препарата. Растворяют в воде

в таком количестве, чтобы активность была

500 ЕД в 1 мл, раствор хранят 1—2 дня. Пре-

парат плохо растворим в воде, поэтому при

приготовлении раствора его надо перемеши-

вать не менее 30 мин, лучше на магнитной ме-

шалке, после чего осадок удаляют центрифуги-

рованием или фильтрацией. Можно готовить

раствор и на ацетатном буфере, но в этом слу-

чае надо убедиться, что препарат действитель-

но растворяется (см. примечание 3). 12. Ка-

либровочный раствор, содержащий 20 мкг гор-

мона в 1 мл. Для его приготовления 1 мг гидро-

кортизона или кортизона растворяют в 50 мл

этилового спирта.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  И з хорошо пере-

мешанного объема суточной мочи отбирают не-

большое количество и доводят рН до 6,5, до-

бавляя по каплям 2 н. NaOH или НС1, кислот-

ность контролируют рН-метром или универсаль-

ной индикаторной бумагой. Отбирают 2 пробы

(опытную и холостую) по 5 мл и нагревают их

на кипящей водяной бане 3—5 мин для разру-

шения ингибитора фермента. Если по какой-

либо причине моча сразу не может быть про-

анализирована, желательно хранить ее после

кипячения, которое одновременно убивает и

микробную флору. После охлаждения и к опыт-

ной, и к холостой пробе добавляют по 5 мл

ацетатного буфера, по 5 мл раствора фермента

и ставят в термостат на 18—20 ч при 37 °С.

После ферментации каждую пробу экстра-

гируют 75 мл хлороформа (пятикратный объем),

после расслаивания удаляют верхний слой (мо-

чу), хлороформенный экстракт промывают 7,5 мл

0,1 н. NaOH и затем еще 3 мл воды, после

чего осушают безводным натрия сульфатом

или натрия карбонатом. Из опытной пробы от-

меривают точно 50 мл хлороформенного экс-

тракта и экстрагируют его 4 мл фенилгидра-

зинового реактива, из холостой пробы также

Очистку см. с. 250.

253

Для проведения расчета сначала вычисляют

исправленную величину экстинкции (Е

и с п

) по

формуле:

точно отмеривают 50 мл хлороформенного

экстракта и экстрагируют их 4 мл серно-спир-

тового реактива. Каждая из этих экстракций

должна занимать около 2 мин. После этого

осторожно удаляют нижние, хлороформенные,

слои, а верхние, т. е. соответственно фенил-

гидразиновый и серно-спиртовой реактивы, пе-

реносят в отдельные пробирки и нагревают на

водяной бане при 60 °С в течение 20 мин.

Одновременно ставят калибровочный опыт,

для чего 1 мл калибровочного раствора, содер-

жащий 20 мкг/мл, выпаривают досуха в про-

бирке, растворяют в 50 мл хлороформа и экстра-

гируют 4 мл фенилгидразинового реактива, хо-

лостой опыт при калибровке не ставят. Все

три раствора — опытный с фенилгидразино-

вым реактивом, холостой с серно-спиртовым

реактивом и калибровочный — фотометрируют

в кюветах с длиной оптического пути 1 см при

длине волны 410 нм против прогретого серно-

спиртового реактива.

Р а с ч е т проводят по правилу пропорции,

учитывая, что из 5 мл мочи, взятых для иссле-

дования, на стадии хлороформенного экстракта

отбрасывается 1/3 часть, поэтому фактически

в фенилгидразиновый реактив переходят 17-

оксикортикостероиды из 3,33 мл мочи. Вводит-

ся также поправка на неспецифические хромо-

гены, о которых судят по экстинкции холостой

пробы. Окончательный расчет проводят по

формуле:

Умножая полученную величину на суточный

диурез, получают выведение 17-ОКС с мочой

за сутки.

П р и м е ч а н и я . 1. Серно-спиртовой и фе-

нилгидразиновый реактивы очень агрессив-

ны как в отношении кювет и прибора, так

и в отношении платья и рук лаборанта,

поэтому работать с ними надо очень осто-

рожно. 2. Результаты работы по этой мето-

дике во многом зависят от чистоты реакти-

вов — растворителя, спирта, кислоты и даже

солей, используемых для осушения, поэто-

му при налаживании методики или смене

реактивов желательно провести контрольное

определение, в котором вместо мочи взять

воду. Оптические плотности серно-спиртово-

го и фенилгидразинового реактивов в этом

случае должны быть не более 0,1—0,2 при

измерении против воды, в противном случае

надо искать тот реактив, который вносит

загрязнения. 3. Приведенный унифициро-

ванный метод требует значительного рас-

хода реактивов, поэтому появилось много

предложений о том, как можно проводить

определение более экономно. С нашей точ-

ки зрения заслуживают внимания предло-

жения, направленные на уменьшение рас-

хода хлороформа. Это можно сделать, если

растворять фермент непосредственно в бу-

ферном растворе и брать в опыт по 4 мл мо-

чи и 4 мл фермент-буферного раствора, а

экстрагировать их 50 мл хлороформа или

дихлорметана, в этом случае из суммар-

ного экстракта отбирают по две порции по

20 мл — одну для экстракции фенилгидра-

зиновым реактивом (опыт), другую для

экстракции серно-спиртовым реактивом (хо-

лостой опыт). Экстракцию в этом случае

проводят порциями по 2 мл серно-спирто-

вого и фенилгидразинового реактива; этого

количества оказывается достаточно, чтобы

измерить светопоглощение на спектрофото-

метре типа СФ даже без специальных мик-

рокювет, а просто приподнимая стандарт-

ные кюветы с помощью вкладышей. Это

сокращает расход растворителя почти в 3

раза — с 150 до 50 мл. 4. В качестве экстра-

тента могут быть использованы и хлоро-

форм, и дихлорметан, но последний труднее

получить достаточно высокого качества.

Экстрагирование дихлорметаном удобнее,

так как он легче серно-спиртового и фенил-

гидразинового реактивов, в то время как

хлороформ тяжелее их. По этой причине

дихлорметановый слой оказывается сверху

и его проще полностью удалить, оставив на

дне пробирки тот слой, который в дальней-

шем используют для анализа. 5. Если нет

достаточно чистых реактивов, иногда можно

вводить поправку на их небольшие загряз-

нения, используя измерение экстинкции

при трех длинах волн — 370; 410 и 450 нм,

как это делается при анализе крови. 6. Иногда

после ферментативного гидролиза моча рез-

ко темнеет; это признак того, что обследуе-

мый получил с пищей или принял в виде

фармацевтических препаратов какие-то

вещества, которые образовали парные соеди-

нения с глюкуроновой кислотой. Как прави-

ло, это не влияет на дальнейший ход

анализа.
Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Суточное

выведение 17-ОКС составляет 4—20 мкмоль/сут

(1,4—7,2 мг/сут).

Определение 17-ОКС в плазме крови по

реакции с фенилгидразином.  П р и н ц и п ме-

тода аналогичен определению 17-ОКС в моче

с той разницей, что определяются лишь не свя-

занные с глюкуроновой кислотой соединения,

поэтому ферментативный гидролиз не прово-

дится. Для экономии плазмы крови холостой

опыт не ставят, а поправку на неспецифическое

поглощение проводят путем вычитания сосед-

них участков спектра.

Р е а к т и в ы . 1. Хлороформ'. 2. Фенил-

гидразина гидрохлорид. 3. Фенилгидразиновый

реактив

 2

. Сначала готовят смесь серной кисло-

ты, спирта и воды, для чего осторожно, избе-

гая нагревания, смешивают 62 мл концентри-

рованной серной кислоты, 38 мл воды и 50 мл

этилового спирта. В день определения раство-

ряют 4,3 мг гидрохлорида фенилгидразина

3

1

 Очистку см. с. 251.

2

 Требования к чистоте спирта и серной

кислоты см. с. 253.

3

 Очистку см. с. 253.

254