Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 66

Основной калибровочный раствор,

содержащий 80 ммоль/л Na и

20 ммоль/л К, мл

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Вода, мл

До

 100

» 100

» 100

» 100

» 100

Содержание в

100 мл, мкмоль

Na

320

280

240

200

160

К

80

70

60

50

40

Соответствует содержанию

в моче при условии, что она

была разведена 1:100,

ммоль/л

Na

320

280

240

200

160

К

80

70

60

50

40

Х о д  о п р е д е л е н и я . При определении

калия в плазме крови очень важно, чтобы не

было гемолиза, так как эритроциты значительно

богаче этим элементом, чем плазма, и разруше-

ние даже небольшого их количества приводит к

завышенным результатам. Если есть хоть малей-

шее сомнение в том, что эритроциты удалены

полностью, плазму или сыворотку надо повторно

центрифугировать. В связи с тем, что калий,

хотя и медленно, но выходит из эритроцитов

через неповрежденную мембрану, предпочти-

тельнее использовать для исследования плазму,

которую получают центрифугированием в тече-

ние 15 мин при 3000 об/мин не позднее чем через

45—60 мин после взятия крови.

Обычно для определения калия исследуемую

плазму разводят водой в 20 раз, а для определе-

ния натрия в 100 раз, но разведения могут быть

и другими в зависимости от чувствительности

прибора. Определение начинают с того, что

сжигают серию калибровочных растворов, за-

тем исследуемые пробы и снова калибровочные

растворы, определение считают успешным, если

калибровка, полученная вначале, совпадает с

полученной в конце.

Р е з у л ь т а т ы  р а с с ч и т ы в а ю т  п о

к а л и б р о в о ч н о м у  г р а ф и к у . После

окончания анализа надо с особой тщатель-

ностью промыть и просушить распылитель,

согласно заводской инструкции. Это очень

ответственная и легко повреждаемая деталь

прибора, коррозия которой или засорение делает

невозможным выполнение анализа.

Содержание натрия в плазме крови опреде-

ляют так же, как и содержание калия, с той

разницей, что исследуемый материал разводят,

как правило, в 100 раз и используют калибровоч-

ный раствор для определения натрия.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Содержа-

ние натрия в плазме 130—156 ммоль/л, содер-

жание калия 3,4—5,3 ммоль/л.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Значитель-

ное увеличение или уменьшение содержания

натрия в плазме или сыворотке наступает пото-

му, что человек в процессе дегидратации непро-

порционально теряет воду и соли. Это состояние

требует неотложных лечебных мероприятий.

Увеличение выведения натрия с мочой — обычно

благоприятный симптом, оно бывает при рас-

сасывании отеков или выпотов, а также под

влиянием лечения диуретиками.

Содержание калия в плазме или сыворотке

возрастает при ацидозе, печеночной недостаточ-

ности, передозировке некоторых лекарств. Со-

держание его уменьшается чаще всего в резуль-

тате неправильного применения диуретиков, а

также при истощении калиевых запасов орга-

низма при некоторых поражениях почечных

канальцев и при альдостеронизме.

Унифицированный метод определения в

моче.  П р и н ц и п . Определение натрия и калия

в моче аналогично их определению в плазме

крови с той разницей, что размах физиологиче-

ских колебаний здесь больше, а различие между

концентрациями Na и К не так велико, как в

плазме, поэтому требования к точности меньше

и можно работать с общим калибровочным раст-

вором.

П р и г о т о в л е н и е  к а л и б р о в о ч -

н о г о  р а с т в о р а . Используют  т е  ж е исход-

ные калибровочные растворы, что и при анализе

плазмы. Для приготовления основного калибро-

вочного раствора в мерную колбу вместимостью

100 мл вносят 8 мл исходного калибровочного

раствора хлорида натрия, содержащего

1000 ммоль/л ', и 20 мл раствора хлорида калия,

содержащего 100 ммоль/л

 2

, и доводят водой до

метки 100 мл. Получается раствор, содержащий

80 ммоль/л Na и 20 ммоль/л К. Из него готовят

разведения согласно приведенной выше таблице.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Если в исследуемом

материале имеется осадок, его тщательно пере-

мешивают, 0,5 мл мочи вносят в мерную колбу

вместимостью 50 мл и доводят до метки водой

либо 1 мл вносят в колбу вместимостью 100 мл и

доводят водой до метки. На пламенном фотомет-

ре сжигают сначала калибровочные растворы,

затем исследуемые и снова повторяют калиб-

ровку.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Содержа-

ние натрия в моче может колебаться от ничтож-

ных величин до 320—340 ммоль/л, калия — до

80—100 ммоль/л.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Выведение

натрия возрастает при спадении отеков, умень-

шается при их развитии. Высокое выведение ка-

' Реактив 1, с. 262.

2

 Реактив 2, с. 262.

263

л и я бывает при неправильно подобранной гипо-
тензивной терапии.

Унифицированный метод определения в эрит-

роцитах.  П р и н ц и п . Эритроциты отделяют

центрифугированием, гемолизируют водой и оп-
ределяют содержание электролитов методом

фотометрии  п л а м е н и . В связи с тем что между
эритроцитами всегда остается некоторое количе-

ство плазмы, большое значение имеет единооб-

разие режимов центрифугирования; приведен-
ный ниже режим рекомендован в качестве уни-
фицированного.

П р и г о т о в л е н и е  к а л и б р о в о ч -

н ы х  р а с т в о р о в . В качестве исходных
используют те же растворы, что и при определе-
нии натрия и калия в плазме.

1. Рабочий калибровочный раствор для опре-

деления калия в эритроцитах. В мерную колбу

вместимостью 100 мл вносят 3,84 мл исходного
калибровочного раствора КС1, содержащего

100 ммоль/л ', и доводят объем водой до 100 мл;

получается основной калибровочный раствор с
концентрацией 3,84 ммоль/л. Из него готовят

разведения согласно приведенной ниже таблице.

Раствор

КС1 3,84

ммоль/л,

мл

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Вода, мл

До 100

» 100

» 100

» 100

» 100

Концентра-

ция калия,

ммоль/л

0,288
0,308

0,327
0,346

0,365

Соответст-

вует содер-

жанию калия

в эритроци-

тах при раз-

ведении

1:260,

ммоль/л

75

80

85
90

95

2. Рабочий калибровочный раствор для опре-

деления натрия в эритроцитах. В мерную колбу

вместимостью 1 л вносят 33 мл исходного калиб-
ровочного раствора KCI, содержащего

100 ммоль/л ', и доводят до 1 л; получается фо-

новый раствор, содержащий 3,3 ммоль/л КС1. В

колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл исход-
ного калибровочного раствора NaCl, содержа-
щего 1000 ммоль/л

 2

, и доводят до объема 100 мл

фоновым раствором, содержащим 3,3 ммоль/л

KCI; получается раствор, содержащий 10 ммоль/л

NaCl и 3,3 ммоль/л KCI. Из полученных

растворов готовят разведение, согласно сле-

дующей таблице.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Кровь для исследо-

вания берут с гепарином из расчета 5 мг

(650 ЕД) на 1 мл, центрифугируют 15  м и н при

3000 об/мин, отсасывают плазму с верхним сло-

ем эритроцитов и снова центрифугируют
30 мин при 3000 об/мин и удаляют верхний слой.

Раствор,

содержащий

10 ммоль/л

NaCl и

3,3 ммоль/л

KCI, мл

5

6

7

8

Фоновый

раствор

КС1 3,3

ммоль/л,

До 100

» 100

» 100

» 100

Концен-

трация,

ммоль/л

К

3,3
3,3
3,3
3,3

Na

0,5

0,6

0,7
0,8

Соответствует

содержанию

натрия в эритро-

цитах при разве-

дении 1:26,

ммоль/л

13,0

15,6

18,2

20,8

1

 Реактив 2, с. 262.

2

 Реактив 1, с. 262.

Из упакованного слоя эритроцитов берут пробу,

которую разводят для определения калия в 260

раз, а для определения натрия — в 26 раз водой.

Пробы сжигают одновременно с калибровочны-

ми растворами. Расчет проводят по калибро-

вочному графику.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : натрий

13—22 ммоль/л, калий 77—96 ммоль/л.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Высокое

содержание натрия в эритроцитах бывает у лиц

с наследственной предрасположенностью к ги-

пертонической болезни.

5.8.2. Кальций

Около 40 % всего кальция плазмы крови

связано с белком, еще примерно 5 % образуют

комплексы с лимонной, фосфорной или угольной
кислотой, остальной кальций находится в физио-

логически активном, ионизированном состоянии.
Доля кальция, связанного с белками (так назы-

ваемый неультрафильтруемый кальций), зави-

сит от содержания протеина в плазме крови,

поэтому четкой количественной связи между

общим и ионизированным кальцием не сущест-
вует, и тот, и другой параметр имеют клиниче-

ское значение. Во многих физиологических и

патологических ситуациях представляет интерес

именно содержание ионизированного кальция,
но, к сожалению, он может быть определен лишь

с помощью специальных кальциевых электро-
дов, аналогичных электродам для определения

рН, которые недоступны практическим лабора-

ториям. Содержание общего кальция точнее все-

го может быть определено методом атомной

абсорбционной спектроскопии; в данном случае
этот метод может быть принят в качестве рефе-
рентного.

Предложено много  х и м и ч е с к и х методов опре-

деления кальция в сыворотке крови и в моче; они

основаны главным образом на способности

образовывать окрашенные соединения с комплек-

сонами, т. е. веществами, образующими прочные
комплексы с металлами. Здесь можно выделить

две подгруппы — либо общее количество комп-

лекса непосредственно определяется фотомет-

рией, либо окрашенный комплекс используется

лишь как индикатор конца титрования, методы

второй группы сейчас практически не находят

применения.

264

К сожалению, ни один из описываемых ниже

методов не обладает бесспорными преимуще-

ствами, чтобы полностью вытеснить все осталь-

ные. Большинство работников отдает предпочте-

ние методу с крезолфталеинкомплексоном, кото-

рый принят в качестве унифицированного. При-

нятый ранее в качестве унифицированного метод

с глиоксаль-бис-2-оксианилином, видимо, менее

точен, но для этого метода чехословацкое пред-

приятие «Лахема» выпускает готовые наборы

реактивов, которые продолжают совершенство-

ваться. Самый старый метод с мурексидом так-

же продолжает использоваться в некоторых

лабораториях, наконец, самый чувствительный

метод с флурексоном имеет то преимущество,

что позволяет обходиться  м и н и м а л ь н ы м коли-

чеством исследуемого материала. Описанный

ниже метод унифицирован в 1979 г.

Унифицированный метод по цветной реакции

с крезолфталеинкомплексоном.  П р и н ц и п .

Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием

в щелочной среде комплекс красно-фиолетового

цвета, интенсивность окраски пропорциональна

концентрации кальция. В реакционную смесь

добавляют 8-оксихинолин, который связывает

металлы, мешающие определению, но образует

с кальцием менее прочный комплекс, чем крезол-

фталеинкомплексон.

Р е а к т и в ы . 1. Боратный буфер: 200 г

борной кислоты (Н

3

ВОз, ортоборная кислота)

растворяют при нагревании в 300 мл воды,

добавляют 580 мл 5 н. КОН, объем доводят

водой в мерной колбе до 1 л, при температуре

ниже 56 °С из раствора могут выпадать кристал-

лы. 2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворя-

ют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и

доводят объем до 50 мл. Для консервации до-

бавляют 2 капли хлороформа, хранят в холо-

дильнике. 3. 8-Оксихинолин (оксин), 1 % раст-

вор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсо-

лютного спирта. 4. Рабочий буферный раствор:

к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного

буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают

и устанавливают величину рН в пределах 10,5—

10,6 с помощью 5 н. КОН, добавляют 50 мл 1 %

раствора оксихинолина, переносят в мерную кол-

бу вместимостью 500 мл и доводят до метки

водой, после чего снова проверяют рН. 5. Кре-

зилфталеинкомплексон, 0,1 % раствор: 10 мг

крезилфталеинкомплексона растворяют в 100 мл

основного буферного раствора. При хранении

в холодильнике реактив стоек не более 2—

3 дней. 6. Калибровочный раствор. Основной

калибровочный раствор, содержащий кальций

в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя

250 мг кальция карбоната (СаСОз) в 5 мл 1 н.

HCI. Раствор переносят в мерную колбу вмести-

мостью 100 мл и доводят водой до метки. Для

консервации добавляют 2 капли хлороформа.

Одновременно готовят раствор солей магния

3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния

(MgCl

2

-6H

2

O) в 100 мл воды. Из этих растворов

готовят рабочие калибровочные растворы, со-

гласно приведенной ниже таблице.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 3 мл рабочего

раствора крезолфталеинкомплексона добавляют

0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.

Основной ка-

либровочный

раствор

25 ммоль/л

Са, мл

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Раствор

магния

3 мг/мл, мл

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Вода, мл

До 100

» 100

» 100

»

 100

» 100

Концентра-

ция кальция.

ммоль/л

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной

оптического пути 0,5 см при длине волны 500—

560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего

раствора крезолфталеинкомплексона. Одновре-

менно обязательно ставят хотя бы одну калибро-

вочную пробу. Расчет ведут по калибровочной

кривой либо по правилу пропорций.

П р и м е ч а н и е . Некоторые сорта стекла

могут выщелачиваться, отдавая в раствор

соли кальция, поэтому лабораторную посуду,

особенно пробирки, желательно предвари-

тельно прокипятить в соляной кислоте. Опре-

деление желательно проводить в сыворотке

или в плазме, полученной из гепаринизиро-

ванной крови, так как щавелевая, лимонная

кислота и другие антикоагулянты, связываю-

щие кальций, могут помешать определению.

Л и т е р а т у р а . Boross M., Szilagyil

L Kisrl. Orvostud, 1974, vol. 24, p. 96—

102.

Метод определения кальция по цветной реак-

ции с глиоксаль-бис-2-оксианилом.  П р и н ц и п .

Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием

в щелочной среде окрашенный комплекс красно-

го цвета, интенсивность которого пропорцио-

нальна концентрации кальция.

Р е а к т и в ы . 1. Метиловый спирт (мета-

нол) х. ч., безводный. 2. Глиоксаль-бис-2-оксиа-

нил (ГБОА), 0,05 % раствор в метаноле, 50 Mi-

препарата растворяют в 100 мл этанола. Раствор

нестойкий. 3. Боратный буфер рН 12,6. Раство-

ряют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г

тетрагидробората натрия (Na

2

B

4

O

7

-10Н

2

О),

объем доводят до 1 л в мерной колбе. 4. Ацетон

х. ч. 5. Смесь метанола и ацетона 9:1 (по

объему). 6. Калибровочные растворы. Основ-

ной калибровочный раствор, содержащий

25 ммоль/л Са, готовят, растворяя 100 мг карбо-

ната кальция (СаСОз) в 5 мл 1 н. HCI и доводя

объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе.

Из этого раствора готовят рабочие калибровоч-

ные растворы с концентрацией 1,5—3,5 ммоль/л,

отбирая 6—14 мл в мерную колбу вместимостью

100 мл и доводя объем водой до метки (приготов-

ление аналогично методу, описанному в преды-

дущем методе, но без солей магния).

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 1,5 мл боратного

буферного раствора прибавляют 0,02 мл иссле-

дуемой сыворотки и через l'/2 мин 0,5 мл

0,05 % раствора ГБОА в метаноле и еще через

265

1 '/2  м и н 1 мл смеси метанола и ацетона. Фото-

метрируют точно через 5—10 мин после добав-

ления 0,05 % раствора ГБОА при длине волны

540—550 нм в кювете с длиной оптического пути

1 см против холостой пробы, в которую вместо

исследуемой сыворотки берут воду. Одновре-

менно ставят также калибровочную пробу.

Р а с ч е т выполняют по калибровочному

графику либо по правилам пропорции.

П р и м е ч а н и е . ГБОА в щелочной среде

распадается с образованием анилина и гли-

оксаля, который затем окисляется в глиокса-

левую кислоту, способную образовывать ком-

плексы с кальцием. Даже в растворе абсо-

лютного метанола на протяжении несколь-

ких недель реактив разрушается. Накапли-

вающаяся глиоксалевая кислота в значи-

тельно большей степени сказывается на экс-

тинкции опытных, нежели калибровочных,

проб. Поэтому измерение оптической плот-

ности должно проводиться в совершенно

определенное время, причем при длине волны

540—550 нм показания стабильнее, чем при

длине 530 нм, при которой наблюдается

максимум пика.
Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы и  к л и -

н и ч е с к о е  з н а ч е н и е те же, что и в пре-

дыдущем методе.

Л и т е р а т у р а . Mayer M., Farese G. Clin.

Chem., 1966, vol. 12, p. 234. Kao N., Rose Ch. F.

Lab. Pract., 1971, vol. 20, N 3, p. 217—219.

Метод определения кальция по цветной реак-

ции с мурексидом в присутствии глицерина.

П р и н ц и п . Мурексид образует с кальцием в

щелочной среде окрашенный комплекс, устойчи-

вость которого повышается путем добавления в

раствор глицерина.

Р е а к т и в ы .  1 . Мурексидглицериновый

реактив: 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н.

КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл

смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина. 2. Калиб-

ровочные растворы готовят так же, как и в пре-

дыдущем методе '.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В 0,3 мл воды вно-

сят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда

же добавляют 3 мл мурексилглицеринового

реактива, перемешивают и через 5 мин фото-

метрируют в кювете с длиной оптического пути

I см при длине волны 490 нм против холостой

пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки

берут воду. Одновременно ставят калибровоч-

ную пробу, в которую вместо сыворотки берут

0,1 мл калибровочного раствора.

Р а с ч е т производят по калибровочному

графику.

Л и т е р а т у р а . Вишневская Т. М., Ля-

шевская Т. Н. Лаб. дело, 1976, № 7, с. 444.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы для всех

приведенных методов 2,3—2,75 ммоль/л (9—

11

 мг

 в 100 мл).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Содержа-

ние кальция в сыворотке повышается при массив-

См, с. 265.

ных распадах костей, гиперпаратиреоидизме,

гипервитаминозе D. Оно уменьшается при нару-

шении всасывания в кишечнике в результате

стеатореи или гиповитаминоза D, а также при

некоторых почечных тубулопатиях и главным

образом недостаточности паращитовидных же-

лез.

5.8.3. Магний

Методы определения магния во многом близ-

ки методам определения кальция, так как и в

том, и в другом случае на первом месте по

точности стоит атомная абсорбция, на втором —

химические методы, основанные на образова-

нии окрашенных комплексных соединений. Хотя

магний, подобно кальцию, только частично на-

ходится в плазме крови в ионизированном со-

стоянии, а частично связан с белками и низко-

молекулярными комплексообразователями —

лимонной и фосфорной кислотами, однако кли-

ническое значение имеет только определение

общего магния.

Известно много веществ, образующих окра-

шенные или флюоресцирующие комплексы с

магнием, аналитическая пригодность их опреде-

ляется чувствительностью и главное способ-

ностью избирательно реагировать с магнием в

присутствии кальция. К сожалению, абсолютной

избирательности достичь очень трудно, поэтому

приходится использовать составные калибровоч-

ные растворы, в которых присутствует несколько

веществ.

Давно известен не очень чувствительный

метод определения с титановым желтым, кото-

рый достаточно специфичен, но требует предва-

рительной депротеинизации, благодаря чему

может быть использован для определения маг-

ния в эритроцитах. Значительно чувствительнее

метод с магоном (ксилидиновым синим II) или

его сульфопроизводным (ксилидиновый си-

ний  I ) . В кислой среде это вещество существует

в виде окрашенного в красный цвет недиссоции-

рованного соединения, в слабощелочной — в

виде однозарядного иона синего цвета, а в силь-

нощелочной — в виде двухзарядного иона крас-

ного цвета. С ионом магния образуют устойчи-

вый окрашенный в красный цвет комплекс два

однозарядных иона. Методы с титановым жел-

тым и магоном унифицированы в 1974 г.

Определение магния по цветной реакции с

титановым желтым.  П р и н ц и п . Магний в

щелочной среде образует комплекс красного

цвета с титановым желтым, присутствие гидро-

ксиламина стабилизирует окраску. При анализе

сыворотки или эритроцитов белки осаждают

вольфраматом натрия, моча предварительно

разводится до нужной концентрации.

Р е а к т и в ы . 1. 0,075 % раствор титанового

желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл

воды, хранят в холодильнике в темной склянке;

реактив очень светочувствителен, годен не более

10 дней. 2. 2 % раствор гидрохлорида гидрокси-

ламина: 2 г гидроксиламинагидрохлорида

(H

2

NOH-HC1) растворяют в 100 мл воды.

3. 0,1 % раствор метилового красного в 95 %

266