Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 68

значение определения кислоторастворимого

фосфора крови примерно такое же, как 2,3-ФДГ

эритроцитов.

Во фракцию липидного фосфора входят те

соединения, которые можно экстрагировать не

смешивающимися с водой растворителями —

эфиром, хлороформом и т. д. В эритроцитах

они участвуют в образовании оболочки, в плаз-

ме частиц липопротеидов. Большая часть ли-

пидного фосфора приходится на долю производ-

ных фосфатидиловой кислоты — фосфатидил-
холинов (лецитинов) и фосфатидилэтанолами-

нов (кефалинов).

При определении неорганического фосфора

в плазме белки осаждают трихлоруксусной

или хлорной кислотой и в безбелковом экстракте

определяют фосфор. Результат в значительной

мере зависит от используемого метода. При этом

играют роль два обстоятельства. Во-первых,

отщепление остатка фосфорной кислоты от орга-

нических соединений; по этой причине при

осаждении белков трихлоруксусной кислотой

результаты выше, чем при осаждении хлорной

кислотой. Во-вторых, во всех методах определе-

н и я фосфора на первом этапе образуется

фосфорно-молибденовая гетерополикислота, ко-

личество которой чаще всего определяют путем

восстановления до молибденового синего. Ге-

терополикислоту образуют не только неоргани-

ческий фосфор, но и некоторые его органи-

ческие производные. Варьируя восстановитель,

условия протекания реакции и длину волны

при фотометрии, можно в значительной мере

изменить чувствительность и специфичность

реакции. При определении неорганического фос-

фора в крови или тканях самые точные резуль-

таты получаются, если восстанавливать фосфор-

но-молибденовую гетерополикислоту эйконоге-

ном, другие вещества — аскорбиновая кислота,

гидрохинон и т. д.— в той или иной степени

завышают результаты, так как на них сказы-

вается присутствие фосфорных эфиров Саха-

ров и глицерина. Иное дело после минерализа-

ции, тут годится любой восстановитель.

Некоторые методы определения фермен-

тов — фосфатаз и фосфокиназ (например,

креатинкиназы), а также фосфорсодержащих

соединений (например, АТФ) — в конечном

итоге сводятся к анализу содержания отщепив-

шегося в определенных условиях фосфора.

Очень важно, чтобы неорганический фосфор

в этих случаях определялся таким методом,

на результаты которого не влияют другие фос-

форсодержащие вещества.

Наилучшие результаты с точки зрения

точности и чувствительности дают методы,

в которых фосфорно-молибденовая гетерополи-

кислота не восстанавливается до молибдено-

вого синего, а образует окрашенный комплекс

с каким-либо основным красителем, лучше

всего с малахитовым зеленым. В образовании

комплекса на один атом фосфора может при-

ходиться до 3 молекул красителя, поэтому

чувствительность и точность получаются очень

хорошими.

При определении кислоторастворимого и

липидного фосфора исследуемый материал ми-

нерализуют (сжигают). Некоторые авторы

рекомендуют для этого нагреватель с серной

кислотой, так же как и при анализе азотистых

соединений. В этом случае температура должна

быть около 300 °С, при этом образуются пиро-

фосфаты, которые надо разрушить, прокипятив

разбавленный минерализат. Поэтому лучше ми-

нерализовать нагреванием с хлорной кисло-

той, когда температура около 200 °С (дигидрат

хлорной кислоты  к и п и т при 203 °С), и пиро-

фосфаты не образуются.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : неоргани-

ческий фосфор в плазме или сыворотке

1—2 ммоль/л (3—6 мг/100 мл), в эритроцитах

1 —1,5 ммоль/л (3—4 мг/100 мл).

К и с л о т о р а с т в о р и м ы й  ф о с ф о р

в эритроцитах 7—14 ммоль/л (22—44 мг в

100 мл).

Л и п и д н ы й  ф о с ф о р в  п л а з м е

и л и  с ы в о р о т к е 2—3,5 ммоль/л (7—11 мг/

100 мл), в эритроцитах 3—5 ммоль/л (10—

16 мг/100 мл).

5.8.6. Неорганический фосфор

Унифицированный метод определения фос-

фора по восстановлению фосфорно-молибдено-

вой гетерополикислоты (метод унифицирован

в 1972 г.).  П р и н ц и п . Белки осаждают три-

хлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфор-

ная кислота образует с молибденовой кислотой

фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, ко-

торая восстанавливается эйконогеном с образо-

ванием ярко окрашенного молибденового си-

него.

Р е а к т и в ы .  1 . Кислота трихлоруксусная,

раствор 100 г/л  ( 1 0 % ) . 2. Кислота серная

5 н. 3. Аммоний молибденовокислый, 5 % раст-

вор. Готовят, растворяя 5 г (NН

4

)

6

Мо

7

O

2

-4Н

2

О

в 100 мл 5 н. серной кислоты. 4. Натрий кислый

сернистокислый NaHSO

3

. В такой форме соль

существует только в растворе, это скорее ком-

мерческое, нежели химическое, название. При

кристаллизации выпадает пиросернистокислый

натрий (Na

2

S

2

O

5

), который называют также

метабисульфитом. Все три названия — бисуль-

фит, пиросульфит и метабисульфит — синони-

мы; препараты с этими названиями могут быть

с равным успехом использованы для определе-

ния фосфора. 5. Натрий сернистокислый без-

водный, сульфид натрия Na

2

SO

3

. 6. Эйконоген,

раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита

натрия в 20—25 мл воды, вносят в этот раствор

0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой

кислоты), который также должен полностью

раствориться, на что уходит некоторое время.

Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г

безводного сернокислого натрия, оба раствора

смешивают, доводят объем до 50 мл, дают от-

стояться несколько часов и фильтруют. 7. Ка-

либровочный раствор. Основной калибровочный

раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л,

готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до по-

стоянной массы при 120 °С однозамещенного

фосфата калия КН

2

РО

4

 в 100 мл воды. Из него

готовят рабочие калибровочные растворы, со-

271

держащие 1; 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1; 2 или

3 мл основного раствора доводят водой до

объема 50 мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 1  м л прибавляют

4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной

кислоты, через 10 мин центрифугируют или
фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата

добавляют 1 мл раствора молибденовокислого

аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл

воды. Через 20 мин фотометрируют при длине

волны 630—690 нм в кюветах с длиной опти-

ческого пути 1 см против холостого опыта.

Одновременно ставят холостой опыт, в который
вместо исследуемой сыворотки берут воду, и ка-

либровочные опыты, в которые вместо сыворотки

берут рабочие калибровочные растворы.

Р а с ч е т проводят по калибровочному гра-

фику или правилу пропорций.

П р и м е ч а н и я . 1. Чувствительность ме-

тода можно значительно повысить, если

после добавления эйконогена пробы нагре-

вать 7 мин на кипящей водяной бане и

фотометрировать при длине волны 830 нм. В

этом случае вместо 5 % раствора молибде-

нового аммония берут 0,5 % раствор в 0,5

н. серной кислоте, остальные реактивы те же.

2. Согласно унифицированному методу окон-

чательный объем фотометрируемых проб со-

ставляет 8 мл, если объем кюветы меньше,
все дозировки можно пропорционально

уменьшить.
Л и т е р а т у р а . Fiske С., Subbarow 1.

J. Biol. Chem., 1925, vol. 66, p. 375;

Bartlett G. R. J. Biol. Chem., 1959, vol. 234,

N 3, p. 466.

Метод определения фосфора по образованию

окрашенного комплекса малахитового зеленого

с фосфорномолибденовой кислотой.  П р и н -

ц и п . Неорганический фосфор образует с мо-

либденовой кислотой фосфорномолибденовую

гетерополикислоту, которая, реагируя с основ-

ным красителем — малахитовым зеленым, дает

зеленовато-синее окрашивание. Если фосфора

нет, то малахитовый зеленый в кислой среде

окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не

мешает проведению реакции, поэтому депротеи-

низацию не проводят, для обеспечения коллоид-

ной устойчивости образовавшегося комплекса

в раствор добавляется твин 20.

Р е а к т и в ы . 1. Малахитовый зеленый.

2. Аммоний молибденовокислый. 3. Цветной

реактив. 1,5 г малахитового зеленого растворя-

ют в 250 мл воды, одновременно растворяют

10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл

5 н. НС1. Оба раствора смешивают, дают

отстояться и фильтруют, за это время цвет

реактива меняется. 4. Твин 20, 1,5 % раствор.

0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды. 5. Ка-

либровочный раствор. Основной калибровочный

раствор, содержащий 50 ммоль/л., готовят,

растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого

фосфата калия КН

2

РО

4

, высушенного при

120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него

готовят калибровочный раствор, содержащий

20 мкмоль/л.

272

Х о д  о п р е д е л е н и я . 0,02  м л сыворотки

вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют

2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5 % ра-

створа твина. Через 10—15 мин фотометриру-

ют при длине волны 600—650 нм против хо-

лостого опыта, который ставят так же, как

и основной опыт, но без сыворотки.

Для построения калибровочного графика

берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного

раствора, т. е. 10; 20 и 30 нмоль фосфора,

доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной

реактив и раствор твина так же, как в основ-

ном опыте. Калибровочная проба, в которую

взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответ-

ствует опытной пробе, у которой взята сыворот-

ка, содержащая фосфор в концентрации

1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые

взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сыворот-

кам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора

в 1 л. По этим данным строится калибровочная

кривая, которая и используется для расчета.

Л и т е р а т у р а . Грибанов Г. А., База-

нов Г. А. Лаб. дело, 1976, № 9, с. 527—530.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В сыворот-

ке или плазме содержится 1—2 ммоль/л (3—

6 мг в 100 мл) неорганического фосфора.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Неоргани-

ческий фосфор увеличивается при почечной

недостаточности, гипопаратиреоидизме, передо-

зировке витамина D, уменьшается при наруше-

нии кишечного всасывания, рахите, почечных

тубулопатиях, гиперпаратиреоидизме.'

5.8.7. Липидный фосфор

Унифицированный метод определения фос-

фора после осаждения белков трихлоруксусной

кислотой (метод унифицирован в 1972 г.).

П р и н ц и п . При осаждении белков крови

трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды

осаждаются вместе с белковым сгустком, а не-

органический и кислоторастворимый фосфор

остаются в растворе. Белковый сгусток мине-

рализуется нагреванием с хлорной кислотой

и фосфор определяется эйконогеновым методом.

В связи с тем что белки плазмы не содержат

фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной

кислотой фосфор входит в состав фосфоли-

пидов.

Р е а к т и в ы . 1. Кислота хлорная 57 %. Ее

концентрация должна быть 5,7 н., что прове-

ряется титрованием. Если концентрация зна-

чительно ниже, что часто случается, так как

продажный препарат может содержать 40 или

50 % НСЮ4, соответственно увеличивается

количество реактива, используемого при мине-

рализации (см. ниже). 2. Кислота трихлор-

уксусная, 100 г/л (10 %). 3. Аммоний молибде-

новокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя
4 г (NН

4

) Мо

7

О

24

-4Н

2

О в 100 мл воды. 4. Натрий

кислый сернистокислый '. 5. Натрий сернисто-

См. с. 271.

кислый безводный '. 6. Эйконоген, раствор

 2

.

7. Калибровочный раствор. Основной калибро-

вочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора

в 1 л

 3

, разводят водой в 50 раз; получается

раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,2 мл исследуе-

мой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно

3 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты,

через 1—2 мин центрифугируют, надосадочную

жидкость сливают — пробирку переворачивают

и дают стечь жидкости. К осадку добавляют

1 мл 57 % хлорной кислоты; если ее концентра-

ция ниже, соответственно увеличивают коли-

чество кислоты, переносят в колбу или в боль-

шую пробирку для сжигания и минерализуют.

Минерализация — наиболее ответственный

этап определения. Дигидрат хлорной кислоты

НСlO

4

-2Н

2

О кипит при 203 °С, при более низкой

температуре из пробы удаляют воду, а при

повышении температуры начинает улетучивать-

ся сама хлорная кислота. Температурный режим

должен быть подобран так, чтобы пары дигидра-

та хлорной кислоты конденсировались на стен-

ках и в виде капелек опускались на дно, где

опять испарялись, и т. д. При оптимальных

условиях минерализация заканчивается за не-

сколько часов; если температура слишком низ-

кая, она затягивается, если слишком высо-

кая, хлорная кислота улетучивается и проба

будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы

в больших пробирках 20X200 мм, которые

устанавливают в подогреваемом электричеством

металлическом блоке (каждую пробирку в от-

дельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают

специальными затычками или колпачками, на

которых также конденсируются и стекают вниз

пары хлорной кислоты. Высота блока должна

быть 2—3 см; большая часть пробирки, которая

находится над блоком, остается свободной

и относительно холодной, на ней и конденсиру-

ется хлорная кислота. Желательно, чтобы тем-

пература в блоке поддерживалась на уровне

200—210 °С с помощью электронного реле,

соединенного с контактным термометром (как

в термостате). Такое устройство позволяет

сжигать большое количество проб с наимень-

шими затратами времени лаборанта, но можно

работать также с круглодонными колбами с

длинными горлышками (колбы Къельдаля) на

песчаной бане, но это требует больше внимания

за ходом минерализации. Внешний признак

того, что минерализация окончилась — просвет-

ление проб, но он может быть обманчивым,

в то же время слишком длительное нагревание

приводит к потерям, поэтому перед началом

серийных анализов надо отработать режим

сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.

После охлаждения к минерализованной про-

бе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибде-

новокислого аммония и 1 мл раствора эйконоге-

1

 См. с. 271.

2

 См. с. 271.

3

 См. с. 271.

на, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин

фотометрируют в кюветах с длиной оптического

пути 1 см при длине волны 630—690 нм, против

холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной

кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную

реакцию так же, как и в опыте.

Для построения калибровочной кривой

минерализуют калибровочные пробы, содержа-

щие 0,2—1 мкмоль фосфора. Для этого к ним

прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят

нагревать вместе с опытными пробами, после

чего проводят цветную реакцию. По калибровоч-

ному графику вычисляют содержание фосфора

в пробе, эту величину умножают на 5 и полу-

чают концентрацию мкмоль/мл или, что то же

самое, ммоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : в плазме

или сыворотке содержится 2,0—3,5 ммоль/л

(7—11 мг в 100 мл) липидного фосфора.

Л и т е р а т у р а . Zilversmit A., Davis A.

J. Lab.

 Med., 1950, vol. 36, p. 155.

П р и м е ч а н и е . После минерализации

образовавшийся неорганический фосфор

может быть определен любым методом, в том

числе и наиболее чувствительным с мала-

хитовым зеленым. Иногда в процессе ми-

нерализации образуется некоторое коли-

чество пирофосфата, что приводит к зани-

женным результатам анализа. В этом слу-

чае пробу после разведения водой ставят

на несколько минут на кипящую водяную

баню, при этом пирофосфат гидролизуется.
К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Липидный

фосфор возрастает при гиперлипопротеидемиях.

5.8.8. Фосфонуклеотиды

Определение нуклеотидов эритроцитов элек-

трофоретическим методом.  П р и н ц и п . Белки

эритроцитов осаждают трихлоруксусной кисло-

той, надосадочную жидкость подвергают элект-

рофорезу на бумаге в цитратном буфере рН 5,1.

Пятна А'ГФ и АДФ идентифицируют в ультра-

фиолетовом свете, вырезают, элюируют и коли-

чественно определяют прямой спектрофотомет-

рией в ультрафиолетовом свете при длине волны

260 нм.

Р е а к т и в ы . 1. Натрия цитрат трехзаме-

щенный. 2. Гепарин, ампулированный препарат,

активность 5000 ЕД/мл. 3. Натрия хлорид

0,85% раствор (физиологический раствор).

4. Кислота трихлоруксусная 150 г/л (15 % ра-

створ). 5. НС1 0,01 н. 6. Цитратный буфер рН

5,1. Готовят, растворяя в воде 17,65 г натрия

цитрата трехзамещенного и 4,41 г лимонной кис-

лоты. Объем доводят до 1 л. 7. Бумага для

электрофореза, разрезанная на ленты 35 X

X 200 мм.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Кровь берут с гепа-

рином из расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритро-

циты отделяют центрифугированием, плазму

отсасывают, а клетки дважды промывают изото-

ническим раствором натрия хлорида при 4 °С,

каждый раз центрифугируя, отсасывая надоса-

273

дочную жидкость и вновь ресуспендируя в но-

вой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной

взвеси добавляют 0,5 мл 15 % трихлоруксусной

кислоты, перемешивают палочкой, выдержи-

вают при 4 °С 10 мин и центрифугируют.

Надосадочную жидкость используют для опре-

деления нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют

цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бу-

магу для электрофореза, согласно правилам ра-

боты на приборе. На место старта равномер-

ной поперечной полосой наносят 0,05 мл иссле-

дуемого трихлоруксусного экстракта и проводят

электрофорез при напряжении 12—14 В/см при

силе тока 0,5—1 мА на 1 см поперечного сече-

ния.ленты в течение 3 1/2 ч. После этого электро-

фореграммы высушивают в темноте и рассмат-

ривают при освещении коротким ультрафиоле-

товым светом (длина волны меньше 300 нм,

можно пользоваться ультрахемоскопом Блюм-

берга или другим аналогичным прибором).

Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей,

а адениловые нуклеотиды, которые сильно по-

глощают свет в этой области, видны в виде тем-

ных пятен. Ближе к старту находится АДФ,

дальше от старта — АТФ. Контуры пятен обво-

дят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл

0,01 н. HCI в течение 4 ч. Одновременно

экстрагируют аналогичный участок бумаги, не

содержащий нуклеотидов; этот раствор исполь-

зуют в качестве холостого опыта. Экстинкции

всех растворов измеряются при длине волн 260

и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути

1 см, из первой величины вычитают вторую.

Р а с ч е т основывается на данных моляр-

ного коэффициента экстинкции при длине волны

260 нм, который у разных нуклеотидов несколь-

ко отличается, авторы данного метода считают

возможным пренебречь этими небольшими раз-

личиями и принимают его равным 14,2-10

3

. Это

значит, что такая величина оптической плот-

ности получится, если фотометрировать в кювете

с длиной оптического пути 1 см раствор

концентрации 1 моль/л и вычесть из этой ве-

личины оптическую плотность при 290 нм. Для

раствора концентрации I мкмоль/л величина

будет 0,0142. В данном методе окончательное

разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из

25 мкл эритроцитной массы оказываются в

5 мл), поэтому расчет производят по формуле:

где Е — разность оптических плотностей, изме-

ренных при длинах волн 260 и 290 нм.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : для АТФ

600—14-00 мкмоль/л, для АДФ 250—800

мкмоль/л, отношение молярных концентраций

АТФ/АДФ в норме 2.

Л и т е р а т у р а . Шаврова Ю. А., Бирюко-

ва Т. В., Шанояп С. А. Электрофоретическое

274

определение показателей адениловой системы

крови доноров.— Лаб. дело, 1976, № 2,

с. 92—94.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повторное

донорство приводит к возрастанию содержа-

ния обоих нуклеотидов.

Определение адениловых нуклеотидов эрит-

роцитов методом тонкослойной хроматографии.

П р и н ц и п . Белки эритроцитов осаждаются

хлорной кислотой, избыток которой удаляется

в виде калиевой соли. Безбелковый фильтрат

хроматографируется в тонком слое на пластинах

«Силуфол», нуклеотиды идентифицируются в

ультрафиолетовом свете и определяются по све-

топоглощению элюатов.

Р е а к т и в ы . 1. Диоксан. 2. Изопропи-

ловый спирт. 3. Аммиак, концентрированный

раствор. 4. Кислота хлорная, 0,8 н. (8 % НС1О4).

5. Калия карбонат, раствор 2 моль/л. Готовят,

растворяя 27,6 г карбоната калия (поташ,

К

2

СО

3

) в воде, объем доводят до 100 мл.

В случае необходимости препарат предвари-

тельно сушат при 105—110°С. 6. Подвижная

фаза для хроматографии. Смешивают 40 мл

диоксана, 20 мл изопропилового спирта, 40 мл

воды и 10 мл концентрированного раствора

аммиака. Можно использовать и более

простую систему, которую готовят без изопропа-

нола, смешивая 40 мл диоксана, 40 мл воды

и 10 мл раствора аммиака. 7. НС1, 0,1 н. 8. Нат-

рия хлорид, 0,85 % раствор (изотонический

раствор). 9. Пластины для тонкослойной хро-

матографии «Силуфол».

Х о д  о п р е д е л е н и я . Кровь берут с гепа-

рином, добавляя его из расчета 12 ME на 1 мл

крови. Эритроциты отделяют центрифугирова-

нием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза про-

мывают холодным изотоническим раствором

натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по

20 мин при 3000 об/мин. К 1 мл эритроцитной

массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты,

перемешивают и через несколько минут осадок

отделяют центрифугированием. К 1 мл надоса-

дочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора

калия карбоната и оставляют на холоде, пока

полностью не выпадут кристаллы образовав-

шегося перхлората калия. 0,05—0,1 мл холодной

надосадочной жидкости (если она согреется,

кристаллы частично растворяются) наносят

в виде полоски на пластину «Силуфол» и

проводят восходящую хроматографию в течение

60—90 мин в смеси диоксана, изопропилового

спирта и аммиака. Перед началом хроматогра-

фии камера должна быть насыщена парами

растворителя, фронт растворителя должен
пройти расстояние не менее

 3

/4 пластины; если

он не пройдет его, то наиболее вероятная

причина этого — плохое насыщение камеры па-

рами подвижной фазы или плохая герметиза-

ция камеры.

Вынутые из камеры пластины высушивают

на воздухе и просматривают в коротком ультра-

фиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюм-

берга или другом аналогичном приборе), нахо-

дят пятна нуклеотидов и обводят их острым

предметом. В этой системе быстрее всего

движется АМФ, медленнее АТФ. Порошок с от-