Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 76

Л и т е р а т у р а . Наставление по примене-

нию иммунодиагностикума на антиген вирусного

гепатита В (HBsAg) и антитела к нему (HB

s

At)

сухого.— М., 1977; Руководство по количествен-

ному иммуноэлектрофорезу / Под ред. Н. Ак-

сельсен, И. Крелль.— М., 1977.

6.4.7. Количественный анализ

антигенов

Метод иммуноэлектрофореза в среде, содер-

жащей антитела.  П р и н ц и п  м е т о д а .  А н -

тиген, помещенный в среду агара с антисыворот-

кой, образует преципитат, который под дейст-

вием электрического потенциала образует петлю

(ракетку), вытянутую по оси электрофореза.

Метод практически совмещает в себе описанную

выше радиальную иммунодиффузию и электро-

форез. Величина петли преципитата находится

в линейной зависимости от эквивалентной кон-

центрации антигена, связанных антител и гра-

диента потенциала. Если последняя величина

постоянна, то первая может отражать концент-

рацию внесенного в агар антигена.

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Стек-

лянные пластины  8 X 1 2 см. 2. Пробойники для

лунок в агаре с внутренним диаметром 3 мм.

3. Водоструйный насос. 4. Прибор для электро-

фореза ПЭФ. 5. Измеритель. 6. Измерительная

миллиметровая линейка.

Р е а к т и в ы . 1. Агароза (в СССР выпуска-

ется заводом химреактивов в г. Олайне). 2. Бар-

биталовый буфер рН 7,4 (ионная сила 0,07)

с 2 М лактата кальция. 3. Антисыворотки (к им-

муноглобулинам А, М, О, к легким цепям -л и К,

к aF-протеину, секреторному IgAS), выпускае-
мые ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи в Москве, НИИ

вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова в

Москве, ИЭМ в г. Горьком. 4. Краситель и от-

мывающая жидкость (прописи см. в разделе

«Иммуноэлектрофоретический анализ»).

Х о д  о п р е д е л е н и я .  1 % (по объему

или по массе) раствор агарозы на барбиталовом

буфере растворяют при подогревании на кипя-

щей водяной бане, а затем охлаждают до 45 °С.

Предварительно выбранное количество антисы-

воротки (титрование антисыворотки проводят

аналогично описанной процедуре в иммуно-

электрофорезе) тщательно смешивают с раство-

ром агарозы и заливают между двумя стеклян-

ными пластинами с помещенной между ними

П-образной рамкой (см. выше). Заливка ага-

розы и формирование слоя происходит более

успешно, если форму и пипетку, которой зали-

вают смесь агарозы с антисывороткой, предва-

рительно нагревают до 40—45 °С. Дают остыть

форме при комнатной температуре, а затем осто-

рожно снимают верхнее стекло. По линии пер-

пендикулярной оси электрофореза параллельно

длинной стороне стекла наносят ряд лунок на

расстоянии не менее 2 см между рядами. Центры

соседних лунок не должны быть ближе 8 мм. При

таких условиях на стекло можно поместить

24 лунки. В средние лунки вносят разведения

стандарта (требования к стандарту и его раз-

ведениям см. выше), используемые для построе-

ния калибровочной кривой. Антиген вносят ав-

томатической пипеткой (выпускается в СССР)

или микропипеткой в количестве 10 мкл. Под-

готовленные таким образом пластины помещают

на поверхности столика прибора для электро-

фореза. Стекла с агарозой соединяют с элект-

родными кюветами агарозными пленками с ши-

риной, равной ширине стекла, и толщиной 3 мм.

Можно применять и соединительные полоски из

фильтровальной бумаги. Во избежание подсы-

хания и деформации геля в месте соединения

с  б у м а ж н ы м и полосами последние перед соеди-

нением их с пластинами смачивают в буферном

растворе. Электрофорез ведут при потенциале

10 В/см в течение 2—10 ч в зависимости от ха-

рактеристик и количества антигена, взятого в

определенном отношении к используемой анти-

сыворотке. Если этот метод применяется для

определения иммуноглобулинов в биологических

жидкостях с исходно низкой концентрацией ан-

тигена (цереброспинальная жидкость, промыв-

ные воды бронхоальвеолярной системы), обычно

достаточно 2 ч. Электрофорез предпочтительно

проводить при внешней температуре 4 °С (в хо-

лодильнике или холодной комнате). Время про-

ведения процедуры лимитируется также высотой

образующихся при реакции пиков.

После электрофореза гелевые пластины на

стеклах отмывают в 0,2 М растворе хлорида

натрия в течение суток. Затем высушивают и

окрашивают, как это описано выше.

Пики максимальной миграции комплексов

антиген—антитело измеряют миллиметровой ли-

нейкой. Ошибка измерения не должна превы-

шать 0,2 мм при высоте пиков от 2 до 5 см.

Стандартную кривую строят на соотношении

величины пиков и концентраций белка в разве-

дениях стандартов антигена обычным путем.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Метод

может быть рекомендован для определения низ-

ких концентраций антигена в таких биологиче-

ских жидкостях, как моча, цереброспинальная,

бронхоальвеолярная жидкость, слюна и т. д.

Высокая чувствительность и воспроизводимость

метода дают основания для более широкого ис-

пользования его в клинико-иммунологическом

анализе.

Л и т е р а т у р а . Laboratory techniques  i n

Biochemistry and molecular biology/Ed by

T. S. Work, E. Work, 1970, p.  I l l : 534; Руковод-

ство по количественному иммуноэлектрофорезу.

/ Под ред. Н. Аксельсен, И. Крелль, Б. Бике.—

М., 1977.

6.4.8. Возможные источники

ошибок и неспецифические реакции

при использовании иммунодиффузионных

методов

Качественные и количественные результаты

иммунодиффузионных методов прежде всего за-

висят от профессионального мастерства иссле-

дователя. Тем не менее ряд объективных факто-

ров, которые необходимо знать и учитывать

при критическом анализе результатов, могут

вызывать определенные отклонения.

303

Все варианты методов указанной группы

требуют использования тщательно сбалансиро-

ванной системы по отношению антигена и анти-

тел. Низкая концентрация антигенов вызывает

смещение преципитата к лунке с антигеном

вплоть до полного слияния его с краем отверстия

и невозможностью определения при двойной

иммунодиффузии в геле. Аналогичная картина

может наблюдаться при избытке антител (пре-

ципитат сливается с краем лунки, содержащей

антитела). Число молекул антител, которое сое-

диняется с молекулами антигена, называют эк-

вивалентным количеством. Хейдельберг и Кен-

далл впервые определили это количество на

основании опытов преципитации в пробирке как

количество антигена, которое присоединяется

к определенному количеству антител с образо-

ванием максимального количества преципитата.

Необходимо знать, что при использовании коли-

чественных методов иммуноэлектрофореза в

ходе реакции все увеличивающееся число моле-

кул антител присоединяется к молекулам анти-

генов, образуя преципитат, который уже не про-

двигается в геле в ходе электрофореза. Коли-

чество антител, приводящее к преципитации в

ходе иммуноэлектрофореза, меньше, чем экви-

валентное количество антител, установленное по

преципитации в пробирках. Следовательно, им-

мунные комплексы в преципитате должны быть

относительно ненасыщены антителами. При

дальнейшем ведении электрофореза уже обра-

зовавшиеся преципитаты остаются в геле и ста-

новятся все отчетливее по мере того, как соот-

ветствующее число молекул антител мигрирует

к области преципитации из окружающего геля.

Таким образом, при подборе в каждом конкрет-

ном случае соотношения в системе антиген—ан-

титело необходимо использовать условия (ха-

рактеристики электрического поля, среда, время

п р е ц и п и т а ц и и ) , которые будут в дальнейшем

п р и м е н е н ы в основном опыте.

Ложноотрицательные реакции могут наблю-

даться в системе с избытком антигена — обра-

зование растворимых комплексов. При несба-

лансированном отношении антиген—антитело

возможно образование нескольких полос пре-

ципитации или ложных «шпор», что затрудняет

интерпретацию результатов в методе двойной

иммунодиффузии.

Необходимо учитывать молекулярную массу

и размер белковых субстратов, включаемых в

реакцию, так как эти параметры оказывают зна-

чительное влияние на скорость диффузии и

электрофоретической подвижности в гелях. Бел-

ки с молекулярной массой свыше 200 000 мед-

ленно диффундируют в агаре. Иммунный гло-

булин М, a2-макроглобулин, а

2

-липопротеин и

фибриноген обладают и более низкой электрофо-

ретической подвижностью.

Неправильная обработка сыворотки может

приводить к агрегации белков и образованию

крупномолекулярных агрегатов, например агре-
гированного IgG. Значительно меняется диффу-

зия сыворотки, содержащей иммунные комп-

лексы, особенно IgM с IgG. При исследовании

парапротеинов могут наблюдаться двойные

кольца  п р е ц и п и т а ц и и вследствие общности ан-

тигенных характеристик легких цепей парапро-

теина и нормального иммуноглобулина  а н т и

сыворотки.

При наличии в исследуемом материале мо-

номерной формы можно наблюдать размытое

большое кольцо диффузии без четкого кольца

преципитации.

Необходимо учитывать воздействие физи-

ческих и медикаментозных факторов, которые

могут изменять диффузионные свойства и элект-

рофоретическую подвижность. Так, рентгенов-

ское или радиоактивное облучение, длительная

терапия высокими дозами кортикостероидов мо-

гут вызывать расщепление белков на субъеди-

ницы с различными молекулярными размерами
и массой, но с идентичными иммунологически-

ми свойствами. Это приводит к появлению

артефактов, которые могут быть непра-

вильно интерпретированы («ложные пара-

протеины») .

Большое внимание необходимо уделять зна-

нию качеств среды, применяемой для иммуно-

диффузии или иммуноэлектрофореза в соответ-

ствии с теми задачами, которые стоят перед ис-

следователем. Плохая очистка геля может слу-

жить причиной электростатического взаимо-

действия антигенов с некоторыми ионизирован-

ными группами геля, антигены могут образовы-

вать преципитаты в плохо очищенном геле, ко-

торые могут быть приняты за специфические.

Исследователь должен творчески подходить к

оценке деталей исполнения метода. Так, при

изучении высокомолекулярных антигенов с боль-

шим размером молекулы, например определение

высокополимерной ДНК в плазме методом встреч-

ного иммуноэлектроосмофореза, правильнее

использовать агарозный гель с концентрацией

его в буфере 0,7—0,8 %. Наоборот, применяя

стандартный метод радиальной иммунодиффу-

зии для количественной оценки секреторного

компонента IgAS, можно допустить применение

более плотных гелей, с которыми проще рабо-

тать и к очистке которых предъявляются мень-

шие требования.

Все иммунопреципитационные методы ана-

лиза антигенов требуют тщательного подбора

антисывороток. Налаживание промышленного

производства гибридомных сывороток значи-

тельно повысит специфичность реакции. Все

выпускаемые в настоящее время моноклоновые

и очищенные сыворотки требуют обязательного

контроля специфичности (особенно это касается

люминесцирующих антисывороток к  и м м у н н ы м
глобулинам, к альфа-фетопротеину и др.). При

работе с каждой партией антисывороток необ-

ходимо определять концентрацию антител. Имеет

значение вид животного, использованного в ка-

честве объекта иммунизации (кролик, лошадь,

коза, свинья и т.д.). Наиболее удобны для

практической работы в потоковых методах козьи

и кроличьи антисыворотки. Лошадиная антисы-

воротка может быть причиной удвоения полос

преципитации.

При использовании этой антисыворотки

часто наблюдается растворение уже сформиро-

вавшегося преципитата как в избытке антигена,

так и антител (т. е. эта антисыворотка требует

304

очень тщательного подбора эквивалентных

концентраций). В редких случаях может иметь

место преципитация неиммунной природы.

Такие преципитаты часто растворяются в 10 %

растворе хлористого натрия в отличие от устой-

чивого к этой обработке иммунного преципитата.

6.5.  А Н Т И Я Д Е Р Н Ы Е  А Н Т И Т Е Л А

Иммунофлюоресцентный метод определения

антиядерных антител.  П р и н ц и п  м е т о д а .

Тиоизоцианат флюоресцеина или производные

родамина (чаще всего применяемые метки),

конъюгированные с антителами, под действием

ультрафиолета светятся желто-зеленым или

оранжево-красным светом, указывая на распо-

ложение антигена, с которым специфически свя-

зались меченые антитела.

Существуют два основных варианта метода

Кунса: прямой, когда метится непосредственно

у-глобулиновая фракция антисывороток (т. е.

антитела), и непрямой, в котором используется

промежуточная инкубация среза с немеченой

антисывороткой (или антителами, предположи-

тельно находящимися в исследуемой сыворотке)

и последующим проявлением образовавшегося

комплекса антигаммаглобулиновой меченой сы-

вороткой другого животного.

Непрямой метод более чувствителен и более

применим в условиях клинических исследований.

Однако он сопровождается повышением неспе-

цифической адсорбции белков и поэтому требует

обязательной постановки контролей.

Антинуклеарный фактор (АНФ) определя-

ется методом иммунофлюоресценции на крио-

статных срезах печени крыс или мышей. Анти-

тела к различным антигенам клеточного ядра —

ДНК, нуклеогистону, рибосомам, нуклеолам, на-

ходящиеся в исследуемой сыворотке, вступают

в специфическое связывание с антигенами, ко-

торое определяется меченой ФИТЦ-антиглобу-

линовой сывороткой (иммунная сыворотка,

конъюгированная с флюоресцеинизотиоциана-

том — ФИТЦ).

П о с у д а и  о б о р у д о в а н и е .  1 . Пред-

метные и покровные стекла. 2. Чашки Петри.

3. Центрифуга. 4. Люминесцентный микроскоп

(МЛ-2, МЛ-3, «Люмам»).

Р е а к т и в ы .  1 . Антигаммаглобулиновая

сыворотка, меченная ФИТЦ. 2. Нефлюоресци-

рующее иммерсионное масло. 3. Фосфатный бу-

фер рН 7,2—7,4 : 0,53 г однозамешенного фос-

фата калия, 0,95 г двузамещенного фосфата

калия, 8,75 г хлорида натрия на 1 л дистиллиро-

ванной воды. 4. Печеночный порошок (для спе-

цифической адсорбции). У обескровленного жи-

вотного извлекают печень и прополаскивают ее

в изотоническом растворе хлорида натрия, раз-

резают на мелкие кусочки и растирают в Ф

а

Р~

форовой ступке с кварцевым песком. Получен-

ную массу заливают двойным объемом 0,87 %

раствора хлорида натрия и добавляют 4 объема

ацетона (по отношению к полученной смеси).

Смесь интенсивно взбалтывают 3—5 мин. Над-

осадочную жидкость сливают, а осадок промы-

вают изотоническим раствором хлорида натрия

до исчезновения гемоглобина в надосадочной

жидкости. Осадок снова разбавляют двумя

11 п/р В. В. Меньшикова

объемами изотонического раствора и четырьмя

объемами ацетона. После отстаивания мате-

риала надосадочную жидкость вместе с гомо-

генатом печени сливают, отделив его от квар-

цевого песка, а после дополнительного отстаи-

вания сливают надосадочную жидкость. Остав-

шийся осадок гомогената заливают четырьмя

объемами ацетона и фильтруют через воронку

Бюхнера с бумажным фильтром. Высушивание

порошка проводят в стерильных чашках, при-

крытых фильтровальной бумагой, в течение 18 ч

при 37 "С. Высушенный материал растирают в

ступке, просеивают через мелкое сито и расфа-

совывают. Предпочтительнее использовать пе-

нициллиновые флаконы, которые после запол-

нения порошком закупоривают резиновыми

пробками и заливают парафином. Порошок со-

храняет способность устранять неспецифиче-

скую люминесценцию в течение 3 лет.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Сыворотку крови

больного, получаемую обычным путем, раститро-

вывают забуференным изотоническим раствором

хлорида натрия (1 ч 0,15 М фосфатного буфера

рН 7,4 и 9 ч 0,87 % раствора хлорида натрия)

1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80... и т. д. Послед-

нее разведение сыворотки, при котором еще оп-

ределяется четко выраженное свечение (не ме-

нее 2 + ), определяется как титр АНФ. Опыт

подсказывает необходимость разведения сыво-

ротки до 320—640, в редких случаях концентра-

ция АНФ достигает 1 : 10240.

П р и г о т о в л е н и е  с р е з о в  п е ч е н и .

Печень извлекают из только что забитых крыс

или мышей,

1

 тут же разрезают на блоки

10Х 10Х5 мм и помещают в термостат с жид-

ким азотом на 1—2 мин. После этого блоки по-

мещают на столик криостата, камера которого

охлаждена до —20 "С. Полученные срезы нано-

сят кисточкой на тщательно вымытые обезжи-

ренные предметные стекла по 3—4 среза на одно

стекло. Стекла со срезами могут храниться 1 —

2 мес в морозильной камере холодильника и ис-

пользоваться по мере надобности.

Предметные стекла со срезами печени (если

они извлечены из морозильника, необходимо

подождать, пока испарится конденсат, т. е. стек-

ло прогреется до комнатной температуры) по-

мещают в фосфатный буфер рН 7,5 на 8—10 мин.

Затем их извлекают и дают стечь буферу. На

влажные срезы пастеровской пипеткой наслаи-

вают (по капле) разведения сыворотки. Стекла

с исследуемой сывороткой на срезах помещают

во влажную камеру (чашки Петри с кусочками

смоченной ваты) при комнатной температуре

на 45 мин, после чего стекла со срезами промы-

Необходимо отбирать здоровых животных.

305

вают в течение 10 мин в фосфатном буфере.

Излишки буфера на стекле вокруг срезов тща-

тельно промокают фильтровальной бумагой. На

влажные срезы наслаивают антисыворотку к

IgQ человека, меченную ФИТЦ и предвари-

тельно истощенную печеночным порошком для

исключения фонового свечения, которое связано

с взаимодействием нормальных печеночных ан-

тител, находящихся, как правило, в небольших

титрах в нормальных и патологических сыворот-

ках.

Люминесцирующая (меченная ФИТЦ) сы-

воротка выпускается в ампулах в лиофилизиро-

ванном виде. На этикетке ампулы обозначено

рабочее разведение препарата. Для употребле-

ния сыворотку в ампуле разводят 0,5 мл забу-

ференного изотонического раствора хлорида

натрия и затем адсорбируют на печеночном

порошке. На 1 мл сыворотки берут 80 мг по-

рошка. Смесь тщательно встряхивают. В течение

часа при комнатной температуре периодически

через 5—10 мин перемешивают, интенсивно

встряхивая. Затем центрифугируют 15 мин при

9000 об/мин. Надосадочную жидкость — адсор-

бированную сыворотку — отсасывают. При тем-

пературе хранения 4 °С сыворотка может быть

использована в течение 3—6 дней.

Инкубацию срезов с меченой антисывороткой

также проводят во влажной камере 45 мин при

комнатной температуре. Затем срезы отмывают

в фосфатном буфере (удаляют непрореагиро-

вавшие белки) в течение 10—15 мин и высуши-

вают на воздухе.

Микроскопирование готовых препаратов

производят при возбуждающем ультрафиолето-

вом облучении с использованием входного свето-

фильтра УФС-3 и окулярного светофильтра

ОС-3 в системе масляной иммерсии. Степень све-

чения оценивают в плюсах (от 4+ до  2 + ) .

По характеру свечения различных структурных

образований ядра выделяют 4 формы свечения,

которые отражают отличные друг от друга анти-

нуклеарные факторы. Дифференциация их

имеет диагностическое значение.

Результаты непрямого метода иммунофлюо-

ресценции могут быть учтены при условии соб-

людения техники постановки реакции и выпол-

нения контролей на специфичность свечения:

1) наслаивать на срезы сыворотку, истощен-

ную антигеном — ДНК, нуклеопротеином или

гистоном;

2) использовать сыворотку с заранее опре-

деленными антителами другой специфичности.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Диагно-

стическую информативность имеют концентра-

ция и тип антинуклеарного фактора. Низкие

титры АНФ часто определяются при разнообраз-

ной патологии и у здоровых доноров. Высокие

концентрации характерны для системной крас-

ной волчанки (СКВ), хронического активного ге-

патита (ХАГ), в ряде случаев при ревматоидном

артрите с системными проявлениями (РА). При

СКВ, как правило, выявляется диффузное све-

чение ядер, при ХАГ — кольцевидное (или крае-

вое), при РА — крапчатое. Последний тип све-

чения встречается при исследовании сывороток

больных склеродермией. Сочетание высоких кон-

центраций АНФ с гомогенным (диффузным)

свечением ядер гепатоцитов и низкими значе-

ниями гемолитической активности комплемента

характерно для СКВ. Нарастание титра АНФ

при динамическом исследовании сыворотки па-

циента может служить ранним признаком обост-

рения процесса (до появления клинических

симптомов) и диктовать необходимость повы-

шения дозы стероидных гормонов.

6.6.  И С С Л Е Д О В А Н И Е ФАКТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

О с н о в н ы е  н а п р а в л е н и я и  м е т о -

д и ч е с к и е  п р и н ц и п ы . Учение о клеточ-

ной кооперации в осуществлении иммунологи-

ческой адаптации, иммунологического надзора

за генетическим постоянством внутренней среды

организма получило значительное развитие за

два десятилетия своего существования. Выде-

ление тимусзависимой (Т) и тимуснезависимой

(В) клеточных систем в конце 60-х годов позво-

лило изучить их функции и взаимодействие и

детализировать эффекторное звено в реализа-

ции иммунного ответа, определив субпопуляции

Т-лимфоцитов: супрессоры, хелперы, киллеры,

клетки антителозависимой цитотоксичности, от-

личающиеся друг от друга специфическими ре-

цепторами, по которым они и могут быть детер-

минированы в общем пуле лимфоцитов. Были

выявлены специфические различия В-клеток по

мембранным иммуноглобулинам, рецепторам к

Fc-фрагменту иммуноглобулина G, к С

3

-компо-

ненту комплемента. Наконец, в последние годы

(1981 —1983) обнаружены супрессорные функ-

ции В-лимфоцитов.

Значительно шире современные оценки фаго-

цитоза в комплексном анализе генетически де-

терминированных дефектов иммунитета: распо-

знавание антигенов макрофагами и представ-

ление их Т-лимфоцитам.

Существенное значение в понимании роли

клеточных реакций в формировании клини-

ческих синдромов приобретает все углубляюще-

еся изучение сывороточных факторов: лимфоки-

нов, монокинов, костномозгового стимулятора

антителопродуцентов и др.

6.6.1. Т-лимфоциты

Метод розеткообразования для определения

Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.

П р и н ц и п . Поверхностные рецепторы, специ-

фичные для различных субпопуляций лимфо-

цитов, проявляются, связывая эритроциты, на-

тивные или нагруженные антителами к этим

рецепторам. Эритроциты образуют с поверхно-

стью лимфоцита фигуру розетки. За розетку

306