Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 57

Для приготовления компенсационной жид-

кости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, ко-

торая использовалась для приготовления калиб-

ровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л

раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л

раствора уксусной кислоты. Для построения

калибровочного графика готовят ряд разведе-

ний с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по

1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазо-

смеси. При появлении помутнения можно до-

бавить по 3 капли 30 % раствора едкого натра.

Измерение проводят при тех же условиях, что и

в опытных пробах, через 20 мин.

Из компенсационной жидкости готовят раз-

ведения, аналогичные калибровочным (как ука-

зано ниже) и далее обрабатывают их так же,

как калибровочные пробы.

С п о с о б II. Калибровочный график стро-

ится по готовому набору реактивов «Билирубин-

эталон» («Лахема», ЧССР).

Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон»

включает: 1) билирубин лиофилизированный

(точная концентрация билирубина приведена на

этикетке флакона); 2) альбумин лиофилизиро-

ванный. Способ приготовления растворов били-

рубина указан в инструкции к набору.

Калибровочная кривая линейка до 170

мкмоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В сыво-

ротке крови содержится 8,5—20,5 мкмоль/л об-

щего билирубина (0,5—1,2 мг/100 мл), из ко-

торого 75 % приходится на долю свободного

(непрямореагирующего) билирубина. На пра-

вильность метода влияет способ построения ка-

либровочной кривой. Ряд веществ — гидрокор-

тизон, андрогены, эритромицин, глюкокорти-

коиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота —

вызывают интерференцию.

Л и т е р а т у р а . Jendrassik L., Cleghorn R.

Biochem'J., 1936, vol. 289, p. 1.

Спектрофотометрический метод определения

общего билирубина и его фракций (метод Эбер-

лейна).  П р и н ц и п . Измерение характерного

для билирубина максимума абсорбции при

450 нм после фракционирования билирубина в

фосфатном буфере, этилацетате и бутиловом

спирте.

Р е а к т и в ы . 1. Однозамещенный фосфат

натрия (NaH

2

PO

4

), 0,2 моль/л. 2. Натр едкий,

5 моль/л. 3. Фосфатный буфер рН 5,0; 0,2 моль/л

раствор NaH

2

PO

4

 доводят до необходимого рН

раствором едкого натра 5 моль/л. 4. Этилацетат.

5. п-Бутиловый спирт. 6. Билирубин-эталон лио-

филизированный.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  В 2 центрифужные

пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. В первую

приливают 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл

этилацетата, во вторую — 2,2 мл фосфатного

буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывают,

энергично встряхивают и центрифугируют 5—

10 мин, после чего все три образовавшихся слоя

переносят осторожно в кюветы спектрофото-

метра для измерения. Этилацетатный экстракт

содержит свободный билирубин, бутаноловый

экстракт — свободный билирубин и моноглюку-

ронид, буферный водный слой — диглюкуронид.

Каждую пробу измеряют при 450 и 575 нм (из-

мерение при 575 нм проводят для исключения

поглощения за счет гемоглобина).

Из значения экстинкции при 450 нм вычи-

тают значение экстинкции при 575 нм. Даль-

нейший расчет производят по калибровочной

кривой. Для построения калибровочной кривой

можно использовать «Билирубин-эталон лиофи-

лизированный» («Лахема», ЧССР), из которого

готовят рабочие калибровочные растворы раз-

ной концентрации согласно инструкции. Из каж-

дого раствора берут по 0,2 мл и добавляют соот-

ветствующий растворитель (этилацетат, п-бута-

нол, фосфатный буфер). Калибровочные пробы

обрабатывают и измеряют при тех же условиях,

что опытные пробы.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Непрямореа-

гирующий билирубин и моноглюкуронид били-

рубина определяют в бутаноловом экстракте;

в этилацетатном экстракте определяют непрямо-

реагирующий билирубин; в фосфорно-буферном

слое — диглюкуронид билирубина; моноглюку-

ронид билирубина определяют по разнице содер-

жания билирубина в бутаноловом и этилацетат-

ном экстрактах.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы  т е же, что в

унифицированном методе.

Л и т е р а т у р а . Eberlein W. R. Pediatrics,

1960, vol. 25, p. 878.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Причины,

.вызывающие гипербилирубинемию, различны.

Желтуха появляется, когда уровень билирубина

в крови превышает 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл).

Предложены различные классификации патоло-

гических желтух, при которых в зависимости от

механизма их возникновения повышаются раз-

личные фракции билирубина.

Заболевания, вызывающие повышение свя-

занного прямореагирующего билирубина: ви-

русный гепатит, цирроз печени, опухоль печени

и метастазы, жировая дистрофия, синдром Ду-

бина—Джонсона.

Заболевания, вызывающие повышение не-

связанного непрямореагирующего билирубина:

гемолитическая анемия, пернициозная анемия;

несвязанный билирубин бывает также повышен

227

при желтухе новорожденных, болезни Жиль-

бера, синдроме Криглера—Найяра, синдроме

Ротора.

При механической желтухе связанный с глю-

куроновой кислотой билирубин увеличивается

в основном за счет билирубиндиглюкуронида,

при паренхиматозной желтухе — билирубин-

моноглюкуронида. Прямореагирующий билиру-

бин при гемолитической желтухе новорожден-

ных состоит  г л а в н ы м образом из билирубинмо-

ноглюкуронида.

5.4.2. Порфирины

Порфирины представляют собой азотистые

пигменты пиррольного ряда, обладающие общей

основной структурой — порфином, который со-

стоит из 4 пиррольных колец. В зависимости от

того, какими радикалами замещены атомы водо-

рода в порфине, образуются различные типы

порфиринов — уропорфирины, копропорфири-

ны, протопорфирины. Названия «уропорфи-

рины» и «копропорфирины» были даны по источ-

нику их первоначального выделения. Все соеди-

нения, имеющие в основе молекулы кольцо пор-

фирина, флюоресцируют и характеризуются ин-

тенсивным поглощением на границе видимой

и ультрафиолетовой областей спектра. Восста-

новленные формы порфиринов называют пор-

фириногенами. Они являются бесцветными

предшественниками порфиринов. Дельта-амино-

левулиновая кислота является предшествен-

ником порфобилиногена, который в свою очередь

является предшественником уропорфириногена

и копропорфириногена. Для порфиринов харак-

терно наличие изомерии, что обусловлено

р а з л и ч н ы м  р а с п о л о ж е н и е м  р а -
д и к а л о в .

Порфирины входят в состав ряда сложных

белков: гемоглобина, миоглобина, цитохромов,

каталазы.

Определение порфиринов в биологическом

материале имеет диагностическое значение при

ряде патологических состояний — анемиях, ге-

патите, отравлении свинцом и особенно при пор-

фириях. Повышение содержания порфиринов

может быть связано с увеличением их синтеза

в различных клетках организма или недоста-

точностью ферментов, участвующих в их обмене.

Порфирии представляют собой заболевания,

чаще всего обусловленные генетическим нару-

шением функций различных ферментных систем.

Существуют различные формы порфирии — пе-

ченочная, эритропоэтическая и др.

Методы определения порфиринов. Исследо-

вание порфиринов в биологическом материале

представляет определенные трудности, так как

содержание их невелико, существуют разные

типы порфиринов, их изомеры, определение

которых требует применения специфических и

высокочувствительных методов. Количественные

методы определения порфиринов сложны и тре-

буют наличия дорогостоящей аппаратуры —

спектрометров, флуорометров. Качественные

пробы существуют лишь для немногих видов

порфиринов. Пурпурно-красная окраска мочи,

а также  о б н а р у ж е н и е оранжевой или красной

флюоресценции в ультрафиолетовом свете ха-

рактерны для наличия порфиринов. В норме

с мочой выделяется их немного — до 30 мкг/сут.

5.4.3. Порфобилиноген

Методы определения порфобилиногена (ПБГ)

и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче ос-

нованы на их разделении с помощью адсорбции

на колонках с ионообменной смолой, окисью

алюминия, каменным углем и др. После разде-

ления для определения дельта-аминолевулино-

вой кислоты применяют метод, основанный на

реакции с реактивом Эрлиха — п-диметил-

аминобензальдегидом или на модифицирован-

ной реакции Яффе с щелочным пикратом.

Для определения порфобилиногена в моче

применяют прямой метод с реактивом Эрлиха

и непрямой метод после выделения порфобили-

ногена при помощи адсорбции на колонке с

окисью алюминия. В качественной пробе Ват-

сона—Шварца с реактивом Эрлиха вызывают

интерференцию — уробилиноген, производные

индола, скатола и других веществ. Для повы-

шения специфичности пробы добавляют ацетат

натрия и проводят экстракцию хлороформом

и бутанолом. При добавлении ацетата натрия

образуется слабая уксусная кислота, в то время

как для реакции индола и скатола с реактивом

Эрлиха необходимо присутствие сильных мине-

ральных кислот. После экстракции хлороформом

в водной фазе, помимо порфобилиногена, могут

остаться и другие вещества (меланоген, оксо-

пирролдикарбоксильная кислота и др.). Для их

удаления применяют экстракцию бутанолом, в

котором растворяются вещества, интерферирую-

щие реакцию. Порфобилиноген-альдегид - сое-

динение, образующееся при взаимодействии

порфобилиногена и реактива Эрлиха, не раство-

ряется ни в хлороформе, ни в бутаноле. Пред-

ложены и другие способы экстракции, например

смесью амилбензила. Метод обнаружения пор-

фобилиногена в моче реакцией с п-диметил-

аминобензальдегидом утвержден в качестве уни-

фицированного в 1979 г.

Унифицированный метод по реакции с п-ди-

метиламинобензальдегидом.  П р и н ц и п .

Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с п-диметил-

аминобензальдегидом с образованием окрашен-

ного в красный цвет соединения.

Р е а к т и в ы .  1 . п-Диметиламинобензаль-

дегид. 2. НС1 концентрированная х.ч. 3. Реактив

Эрлиха: 0,7 г п-диметиламинобензальдегида

растворяют в 150 мл концентрированной НС1,

приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор

должен быть бесцветным или слегка желтым.

Хранят в посуде из темного стекла. Реактив

стабилен. 4. Натрия ацетат 3-водный х.ч., ч.д.а.,

насыщенный раствор: 375 г ацетата натрия

3-водного (или 226 г безводной соли) раство-

ряют в 250 мл теплой воды, охлаждают до ком-

натной температуры. Хранят при комнатной тем-

пературе. Раствор должен быть бесцветным и

прозрачным. 5. Хлороформ. 6. Бутиловый спирт.

7. Бумага индикаторная для измерения рН

(в интервале 4,0—5,0).

228

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Моча в первые 2—3 ч после мочеиспускания.

Х о д  о б н а р у ж е н и я и  о ц е н к а  р е -

з у л ь т а т о в . Смешивают в пробирке 2,5 мл
реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют

5 мл насыщенного раствора ацетата натрия

и перемешивают. Измеряют рН индикаторной
бумагой; значение рН должно быть в интервале

4,5—5,0; если рН меньше 4,0 добавляют раствор
ацетата натрия для установления нужного рН.

Если окраски не образуется — результат отри-
цательный. При образовании розовой или крас-
ной окраски добавляют 5 мл хлороформа и

встряхивают. Если окраска переходит в слой
хлороформа, а верхний водный слой становится

бесцветным или желтым — результат отрица-

тельный. При сохранении  о к р а ш и в а н и я водной

фазы переносят 6—8 мл водного слоя в другую

пробирку, добавляют бутиловый спирт в соот-

ношении 2 : 1 и встряхивают. Обычно фазы раз-

деляются быстро; в противном случае смесь цент-
рифугируют. При переходе окраски в бутиловый

слой — результат отрицательный. Если водная

часть остается окрашенной — результат поло-
жительный для ПБГ.

Н о р м а л ь н о е  з н а ч е н и е . В норме

ПБГ в моче не обнаруживается (0—2  м г / л ) .

Данным методом ПБГ обнаруживается при кон-

центрации, превышающей 6 мг/л.

П р и м е ч а н и е . При хранении мочи свы-

ше 3 ч  п р и комнатной температуре реакция

может стать ложноотрицательной, что, по-
видимому, связано с превращением ПБГ в

порфирины и образованием ингибиторов
реакции. Если нет возможности исследовать
мочу в первые 2—3 ч, ее хранят в холодиль-

нике при 4 °С или в замороженном состоя-
нии. При хранении в холодильнике и дове-
дении рН мочи до 6,0—7,0 ПБГ стабилен
длительное время.
Л и т е р а т у р а . Clinical  c h e m i s t r y . Prin-

ciples and technics. 2ed/Eds. R.J. Henry,

D. C.  C a n n o n , J. W.  W i n k e l m a n . — Hagerstown

etc.: Harper and Row, 1974, p. 1251 — 1263.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Увеличе-

ние выделения ПБГ с мочой наблюдается при

острой перемежающейся порфирии, при ане-

миях, связанных с нарушением порфиринового
обмена, при свинцовой интоксикации.

5.4.4. Дельта-аминолевулиновая

кислота

Унифицированный метод по реакции с п-ди-

метиламинобензальдегидом.  П р и н ц и п .

Дельта-аминолевулиновая кислота (АЛК) опре-
деляется по реакции с реактивом Эрлиха после

удаления ПБГ и других мешающих определению
веществ сорбированием их на  а к т и в и р о в а н н о м
угле.

Р е а к т и в ы .  1 . Уксусная кислота ледяная

х.ч. 2. Хлорная кислота, 57 %, х.ч. 3. Натрия ацетат

3-водный х.ч. 4. Дельта-аминолевулиновой

кислоты гидрохлорид ч. 5. Уголь  а к т и в и р о в а н -
н ы й с дисперсностью 0,25—1 мм. 6. Ацетил-

ацетон ч.д.а. 7. п-Диметиламинобензальдегид

ч. 8. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кис-

лоты разводят водой в мерной колбе вмести-

мостью 1 л. 9. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия

растворяют в воде в мерной колбе вместимостью

1 л. 10. Ацетатный буфер рН 3,6: готовят, сме-

шивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б;

доводят до метки водой в мерной колбе вмести-

мостью 1 л.  1 1 . Калибровочный основной раст-
вор АЛК, 0,75 ммоль/л (100мкг/мл) в пересчете
на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида

растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной

колбе вместимостью 50 мл. Хранят в холодиль-
нике не более месяца. 12. Рабочий калибровоч-

ный раствор АЛК, 1 мкг/мл. Готовят перед

употреблением разведением основного калибро-

вочного раствора ацетатным буфером в 100 раз.

13. Взвесь угля: 0,25 г активированного угля

помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл
и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед

употреблением тщательно встряхивать. 14. Реак-
тив Эрлиха: 1 г п-диметиламинобензальдегида

растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл
в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют

8 мл 57 % хлорной кислоты и доводят до метки
ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из

темного стекла в холодильнике не более недели.

15. Беззольные фильтры (синяя лента).

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Отбирают не менее 2 мл мочи. Допускается

хранение мочи в холодильнике, рН мочи должен

быть равен 6, для чего добавляют на 10 мл мочи

0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  К 1 м л мочи в про-

бирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взве-

си угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию
взбалтывают 1 мин и фильтруют через бумаж-

ный фильтр (синяя лента). В две пробирки от-

бирают по 2 мл фильтрата. Первая пробирка
для холостой пробы. Во вторую пробирку (опыт-
ную) добавляют 0,05 мл ацетилацетона и тща-

тельно перемешивают. Затем обе пробирки по-

мещают на 20 мин в кипящую водяную баню.
После охлаждения проб и доведения объема

жидкости ацетатным буфером до 2 мл в каждую

пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха
и перемешивают. Через 15 мин опытную пробу

измеряют против холостой пробы при длине
волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Окраска раствора стабильна в течение 1 ч.

Р а с ч е т ведут по калибровочному графи-

ку (готовят разведения, как указано  н и ж е ) .

№ про-

бирки

1

2

3

4

5

6

Рабочий

калибро-

вочный

раствор, мл

0,1
0,3

0,5

0,7

1,0

2,0

Ацетат-

ный буфер

рН 3,6, мл

До 5 мл

То же

» »

» »

» »

» »

АЛК в пробе

(2 мл)

мкг

0,04

0,12

0,2

0,28

0,4

0,8

мкмоль

0,0003
0,0009

0,0015

0,0021
0,003

0,006

229

Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора

в 2 пробирки (холостую и опытную), которые

обрабатывают, как указано выше. По получен-

ным данным строят калибровочный график.

П р и м е ч а н и е . Поскольку диурез за сут-

ки может быть различным, более достовер-

ным показателем считается содержание АЛК

в пересчете на 1 г креатинина.
Р а с ч е т . Содержание АЛК в моче

(мкмоль/г креатина) рассчитывают с использо-

ванием калибровочного графика по формуле:

где С — количество АЛК в пробе (мкмоль),

найденное по калибровочному графику; А —

содержание креатинина в пробе (г) ; 10 — коэф-

фициент разведения мочи, 2 — объем фильтра-

та

  ( м л ) .

Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в

микромоли — 0,0076.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы содержа-

ния АЛК в моче 3,9 — 19 мкмоль/г креатинина

(0,52—2,5 мг/г креатинина).

О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и . Нижняя граница чувствительности

0,15 мкмоль/л. Воспроизводимость: коэффи-

циент вариации около 5 %.

Л и т е р а т у р а . Mauzerall D. S., Gra-

nick S. J. biol. Chem., 1956, vol. 219, № 1,

p. 435—446.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Выделе-

ние дельта-аминолевулиновой кислоты с мочой

увеличивается при патологических процессах,

связанных с нарушением порфиринового об-

мена, а также при интоксикации свинцом, бен-

золом и другими токсическими веществами.

5.4.5. Копропорфирин, уропорфирин

Для копропорфирина (КП) наиболее прием-

лемыми по аналитическим качествам являются

спектрофотометрические методы. Спектрофото-

метрический метод Соулсби в модификации

Римингтона рекомендован в качестве унифици-

рованного.

Унифицированный метод Соулсби в модифи-

кации Римингтона.  П р и н ц и п . Экстракция

КП и копропорфириногена (КПГ) из мочи в

кислой среде с последующим переводом КПГ

в КП йодом, реэкстракция КП кислотой и

спектрофотометрическое определение его по раз-

нице оптической плотности при трех длинах

волн.

Р е а к т и в ы . 1. Уксусная кислота ледяная

х.ч. 2. Эфир медицинский. 3. HCI х.ч. 1,4 моль/л.

4. Йод ч.д.а., спиртовой раствор, 0,039 моль/л.

5. Раствор йода в НС1. Готовят ежедневно, сме-

шивая реактивы № 3 (200 объемов) и № 4

(1 объем).

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежевыделенная моча. Срок хранения мочи не

более 3 ч.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В делительную во-

ронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной

кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение

1 мин. После разделения фаз нижний водный

слой отбрасывают. К эфирному слою добавляют

5 мл раствора йода в НС1 и встряхивают в тече-

ние 1 мин. После разделения фаз нижний слой

переносят в пробирку, термостатируют при 37°С

в течение 5 мин. Затем содержимое пробирки

встряхивают и измеряют оптическую плотность

раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при

трех длинах волн: 380; 402; 430 нм против

1,41 моль/л раствора НС1.

Р а с ч е т . Учитывая, что диурез за сутки

может быть разным, более достоверным показа-

телем считают содержание КП в пересчете на

креатинин. Содержание КП в моче (нмоль/г

креатинина) рассчитывают по формуле:

где Е

402

, Е

430

, Е

380

 — оптическая плотность рас-

твора при соответствующих длинах волн; А —

содержание креатинина в пробе (г); 1,52 —

коэффициент пересчета микрограммов КП в на-

номоли; 2,093 — коэффициент для расчета

содержания КП, предложенный Римингтон.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы  К П в моче:

30,5—122 нмоль/г креатинина (20—80 мкг/г

креатинина).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Содержа-

ние КП в моче повышается при гепатитах, цир-

розах печени, свинцовой интоксикации и неко-

торых формах порфирии, наследственной копро-

порфирии, перемежающейся порфирии, эритро-

поэтической уропорфирии. Повышенное выделе-

ние с мочой УП наблюдается при перемежаю-

щейся порфирии, эритропоэтической уропор-

фирии.

Л и т е р а т у р а . Павловская Н. А.,

Кахн X. А., Семенова Л. С., Мере А. Т. — Лаб.

дело, 1981, № 2, с. 86—89; Rimington С. Ass.

clin. Pathol., 1971, vol. 70, p. 39—42; Soulsby 1.,

Smith R. L. Brit. J. industr. Med., 1974, vol. 31,

№ 1, p. 72—74.

5.5. УГЛЕВОДЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

5.5.1. Глюкоза

Более 90 % всех растворимых низкомолеку-

лярных углеводов крови приходится на глюкозу;

кроме того, в небольших количествах могут при-

сутствовать фруктоза и пентозы, а при патоло-

гии и галактоза. После еды увеличивается со-

держание фосфорных эфиров гексоз, определя-

емых некоторыми методами вместе с глюкозой.

Глюкоза распределена почти равномерно между

230