Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 56

ращением полученного синего производного в

стабильное медное производное оранжево-крас-

ного цвета, имеющее максимум пoглощения при

530 нм. Метод позволяет определить все амино-

кислоты, за исключением пролина и оксипро-

лина.

Р е а к т и в ы . 1. н-Бутиловый спирт. 2. Ук-

сусная кислота ледяная. 3. Смесь бутилового

спирта, уксусной кислоты и воды (в объемных

соотношениях 4 : 1 : 5): смешивают в мерном ци-

линдре 40 мл бутилового спирта, 10 мл ледяной

уксусной кислоты и 50 мл воды. Смесь переносят

в делительную воронку. После расслаивания

берут верхний слой и используют его в качестве

подвижного растворителя. Нижний слой исполь-

зуют для насыщения хроматографической ка-

меры. 4. Смесь бутилового спирта, уксусной кис-

лоты и воды (в объемных отношениях 40: 15:5).

Смесь используют в качестве подвижного раст-

ворителя. 5. Ацетон. 6. Нингидрин, раствор

5 г/л в ацетоне. Хранят в темной склянке. Пе-

ред определением смешивают 95 частей 5 г/л

раствора нингидрина в ацетоне с 1 частью ледя-

ной уксусной кислоты и 4 частями воды. 7. Эти-

ловый спирт 96 %. 8. Меди сульфат 5-водный,

насыщенный раствор в 75 % этиловом спирте.

Перед употреблением раствор фильтруют.

9. Набор аминокислот, растворы 0,01 моль/л.

10. НС1 концентрированная. 11. Солянокислый

ацетон: 1 мл концентрированной НС1 сме-

шивают с 99 мл ацетона. 12. Диэтиловый

эфир.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Хроматографические камеры. В качестве хрома-

тографической камеры могут быть использованы

высокие стеклянные банки с пришлифованной

стеклянной крышкой диаметром 25 см и больше,

высотой 50—60 см. 2. Хроматографические кю-

веты. Для получения нисходящих хроматограмм

растворитель наливают в хроматографическую

кювету, представляющую собой трубку диамет-

ром 2—4 см и имеющую по длине щель шириной

3—6 мм. Трубка имеет оправу из стеклянных

палочек, через которые перекидывается бумага.

3. Бумага. Для разделения аминокислот исполь-

зуют хроматографическую фильтровальную бу-

магу марки «быстрая» (Б). Для количествен-

ного определения аминокислот может быть ис-

пользована только бумага, освобожденная от

катионов металлов, мешающих точному коли-

чественному определению аминокислот на хро-

матограммах. Для удаления катионов металлов

из бумаги последнюю обрабатывают раствором

8-оксихинолина или трилона Б (динатриевая

соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Получение концентрированного безбелкового

экстракта сыворотки крови: предварительная

подготовка сыворотки крови для количествен-

ного определения аминокислот сводится к полу-

чению экстракта сыворотки крови, свободного

от белков и солей, мешающих хроматографи-

ческому разделению аминокислот, и сгущению

безбелкового экстракта. Для этого порошок,

полученный из 2 мл сыворотки, высушенной

лиофилизацией или в вакуумном эксикаторе над

безводным хлоридом кальция, помещают в цент-

рифужную пробирку с притертой пробкой и

экстрагируют 3 раза (каждый раз в течение

1 ч) 8 мл солянокислого ацетона. Нераствори-

мый осадок отделяют центрифугированием.

Надосадочную жидкость (всего 24 мл) выпари-

вают досуха в фарфоровой чашке на водяной

бане при 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл

воды и и обрабатывают 2 мл эфира для удаления

липидов. После отделения эфира водный рас-

твор помещают в фарфоровую чашку и сгущают

досуха. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл

воды. На хроматограмму наносят 40 мкл эк-

стракта порциями по 5 мкл.

П о л у ч е н и е  о д н о м е р н ы х  х р о м а -

т о г р а м м  с ы в о р о т к и  к р о в и .  Н а лист

бумаги, промытой раствором 8-оксихинолина,

наносят в 2 точках по 40 мкл полученного

экстракта сыворотки крови. В третью точку на-

носят 5 мкл 0,01 моль/л раствора аминокислот

«свидетелей». В качестве растворителя исполь-

зуются смеси: н-бутанол, уксусная кислота, вода

(в соотношении  4 : 1 : 5 ) и н-бутанол, уксусная

кислота, вода (40:  1 5 : 5 ) . Наиболее четкое и

полное разделение аминокислот сыворотки кро-

ви достигается при трехкратном пропускании

обеих смесей (в этом случае после каждого про-

пускания растворителя бумагу высушивают на

воздухе и снова помещают в хроматографи-

ческую камеру). После последнего пропускания

растворителя хроматограмму высушивают при

комнатной температуре в течение 2 ч. Следует

придерживаться одного и того же времени

сушки хроматограмм, что обеспечивает луч-

шее совпадение результатов отдельных опре-

делений.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Хроматограмму,

освобожденную путем высушивания от избытка

растворителя, погружают на несколько секунд

в 5 г/л раствор нингидрина в ацетоне, просуши-

вают в течение нескольких минут на воздухе и

прогревают в течение 10 мин при 50 °С в сушиль-

ном шкафу для развития окраски. Далее хро-

матограммы высушивают в течение суток на воз-

духе. Затем вырезают участки хроматограмм с

фиолетовыми пятнами аминокислот, разрезают

их на мелкие кусочки и помещают в пробирки

с притертыми пробками. В пробирку добавляют

2,5 мл насыщенного раствора сульфата меди

в этиловом спирте. При этом фиолетовая окрас-

ка аминокислот переходит в оранжево-красную

в результате образования комплексного соеди-

нения с медью, которое растворяется в 75 %

этаноле и экстрагируется из бумаги. Пробирки

закрывают пробками и содержимое их тща-

тельно перемешивают для полноты экстракции

окрашенного продукта. Экстракцию продол-

жают в течение часа в темноте при комнатной

температуре. Одновременно с пятнами амино-

кислот вырезают из бумаги контрольные участ-

ки, равные по площади опытным, и обрабаты-

вают их точно таким же образом. Интенсивность

окраски измеряют на фотоколориметре при

500—530 нм (зеленый светофильтр) в кюветах

с толщиной слоя 5 мм против контрольной

пробы.

Р а с ч е т аминокислот проводят по калиб-

ровочным графикам, которые строят по калибро-

223

вечным растворам аминокислот. Дальнейший

расчет проводят по формуле:

где А — количество аминокислоты, мгк/л сыво-
ротки; а — количество аминокислоты в пробе,

найденное по калибровочному графику, мкг;

в — количество экстракта, взятое для хромато-

графирования, мкл; с — общее количество экст-

ракта, мкл; d — количество сыворотки (мл),

соответствующее общему количеству экстракта.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н ы х

г р а ф и к о в . Для построения калибровочных

графиков готовят растворы аминокислот

0,01 моль/л, содержащие в 1 мкл 0,01 мкмоль

каждой аминокислоты. На бумагу наносят 5; 10;

15 и 20 мкл калибровочного раствора амино-

кислот порциями по 5 мкл. Каждая точка гра-

фика будет соответствовать 0,05; 0,10; 0,15; 0,20

мкмоль аминокислоты. Линейная зависимость

между концентрацией вещества и интенсив-

ностью окраски сохраняется при концентрациях

от 0,025 до 0,2 мкмоль для каждой аминокис-

лоты.

Разделение смеси калибровочных растворов

аминокислот проводят  п р и строгом соблюдении

всех условий хроматографирования и определе-

н и я описанных выше. На основании найденной

величины оптической плотности и взятых кон-

центраций аминокислот строят калибровочные

графики.

Большинство аминокислот, за исключением

фенилаланина, аспарагиновой кислоты, тиро-

зина, имеют очень близкие величины молярной

оптической плотности, поэтому для их количест-
венного определения можно пользоваться об-

щим графиком.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы в сыворот-

ке крови по данным различных авторов (даны

пределы колебаний в  м г / л ) :  л е й ц и н — 12—19;

фенил-аланин — 10—28; валин — 13—29; тиро-

зин — 4—20; аланин — 18—50; глутаминовая

кислота — 7—49; глицин — 10—39; серии —

4—18; аспарагиновая кислота — 0,3—9,8; цис-

тин -+- цистеин — 15—38; метионин — 3,8; трип-

тофан—  1 1 , 1 ; гистидин — 11—30; орнитин —

7,2; лизин — 8—30; аргинин — 8—15; цитрул-

лин

 — 5.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Содержа-

ние аминокислот в крови увеличивается при

экссудативном диатезе, заболеваниях печени,

фенилкетонурии, опухолях.

5.3.5. Индикан

Индикан представляет собой калиевую соль

индоксилсерной кислоты.

Методы определения. В практических лабо-

раториях чаще применяют качественное иссле-

дование (обнаружение) индикана в моче. Наи-

более распространенной является проба Обер-

мейера, основанная на образовании синего и

красного индиго. Среди других исследований

применяют пробы с тимолом, а-нафтолом.

Проба Обермейера.  П р и н ц и п . Индикан

превращают в индоксил, в результате окисления

которого образуется синее индиго (индиготин)

и красное индиго (индигорубин).

Р е а к т и в ы . 1. Свинца ацетат, 100 г/л.

2. Железо хлорное. 3. НС1 концентрированная,

отн. плотность 1,19. 4. Реактив Обермейера:

0,2—0,4 г хлорного железа и 100 мл НС1 кон-

центрированной. 5. Хлороформ.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . Несколько милли-

литров мочи смешивают с раствором ацетата

свинца в соотношении по объему 1 : 10, фильтру-

ют. Смешивают 1—2 мл фильтрата с реактивом

Обермейера в соотношении  1 : 1 , прибавляют

0,5—1 мл хлороформа.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Если слой

хлороформа окрашивается в синий или красный

цвет, проба положительная.

Н о р м а . Индикан содержится в моче в не-

значительном количестве и не обнаруживается

качественными пробами.

П р и м е ч а н и е . При наличии солей йода

в моче образуется красно-фиолетовая окрас-

ка хлороформа, которая исчезает после при-

бавления раствора тиосульфата натрия.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Увеличе-

ние содержания индикана в моче происходит

при заболеваниях, связанных с усилением рас-

пада белка, или при интенсивном гниении бел-

ковых веществ в кишечнике.

5.4.  П И Г М Е Н Т Ы

Пигменты, или окрашенные соединения не-

белкового характера, могут находиться в орга-

низме человека в свободном и связанном состоя-

нии.

Основными структурными компонентами

пигментов являются пиррольные кольца, связан-

ные между собой метиновыми группами

(= СН ). С диагностической целью в био-

логических жидкостях определяют  п и г м е н т ы

красного цвета — порфирины и желчные пиг-

менты. Биосинтез иорфиринов происходит прак-

тически в каждой клетке живого организма,

однако в свободном состоянии находится очень

незначительное их количество. Основное содер-

ж а н и е порфиринов приходится на долю гемо-

протеидов. Гем представляет собой протопорфи-

рин, связанный с двухвалентным железом.

Желчными  п и г м е н т а м и называют продукты

распада гемоглобина и других хромопротеидов.

К желчным пигментам относятся билирубины

и уробилиноиды. При распаде гемоглобина

разрывается порфириновое кольцо тема, связь

между ним, железом и белковой частью молеку-

лы гемоглобина нарушается, образуется били-

вердин, который восстанавливается до основ-

ного желчного пигмента — билирубина.

224

5.4.1. Билирубин

Билирубин — желто-красный пигмент; пред-

ставляет собой линейный тетрапиррол. Большая

часть его в организме образуется в ретикулоэн-

дотелиальной системе печени и селезенки при

распаде гемоглобина, миоглобина, цитохромов.

Образовавшийся в клетках ретикулоэндотелия

билирубин плохо растворим в воде, является

токсическим веществом, медленно реагирует с

диазореактивом, что требует добавления аксе-

лератора, поэтому он называется непрямореаги-

рующим. При поступлении его с током крови в

печень в гепатоцитах происходит его обезврежи-

вание путем присоединения глюкуроновой кис-

лоты. Диглюкуронид билирубина в отличие от

свободного билирубина — вещество индиф-

ферентное, растворим в воде и быстро реагирует

с диазореактивом, т. е. является прямореаги-

рующим. Конъюгирование билирубина в гепа-

тоците с образованием диглюкуронида и неболь-

шого количества моноглюкуронида протекает

с помощью фермента уридиндифосфоглюкуро-

нилтрансферазы (УДФГА). Гепатоциты обла-

дают также способностью удалять связанный

с глюкуроновой кислотой билирубин. Это обус-

ловлено главным образом свойствами мембраны

гепатоцита и наличием в цитоплазме гепатоцита

специального белка (лигандина). Выделение би-

лирубина происходит с желчью, вместе с

желчью билирубин попадает в пищеваритель-

ный тракт, где происходит его дальнейшее прев-

ращение. В сыворотке крови содержится били-

рубин, связанный с глюкуроновой кислотой, или

прямореагирующий (диглюкуронид и моноглю-

куронид); и билирубин, не связанный с глюку-

роновой кислотой, или непрямореагирующий.

Обе фракции билирубина в сыворотке крови

могут находиться в свободной форме или в виде

комплексов, соединенных с фосфолипидами или

альбумином (связывающая способность альбу-

мина сыворотки составляет 2 моля билирубина

на 1 моль альбумина).

Комплексы  с в я з а н н о г о билирубина с фосфо-

липидами могут встречаться в сыворотке крови

при длительной закупорке желчных путей. Их

можно экстрагировать из сыворотки эфиром

(эфирорастворимый билирубин). Свойства свя-

занного билирубина обусловливают появление

желтухи при значительно более низких цифрах

его в крови по сравнению с концентрацией несвя-

занного билирубина. У новорожденного актив-

ность фермента УДФГА во много раз ниже, чем

у взрослых, ниже и уровень белка лигандина,

что является причиной физиологической жел-

тухи новорожденных.

Методы определения билирубина. Для ис-

следования общего билирубина и его фракций

применяются прямые спектрофотометрические

методы, фотометрические методы после окисле-

ния, диазометоды, электрохимические методы с

использованием платинового и ртутного элект-

родов, хроматографическое разделение отдель-

ных фракций билирубина. Прямые спектрофото-

метрические методы основаны на измерении

абсорбции билирубина при 440—460 нм. Глав-

ным источником ошибок в них является интер-

ференция желтых небилирубиновых пигментов.

Определение билирубина после окисления осно-

вано на образовании пигментов, имеющих раз-

личную окраску. Методы этой  г р у п п ы отли-

чаются низкой чувствительностью, низкой точ-

ностью и позволяют определить лишь общий

билирубин.

Диазометоды основаны на взаимодействии

билирубина с диазотированной сульфаниловой

кислотой с образованием азопигментов, этими

методами определяются количественно две ос-

новные фракции билирубина. Связанный били-

рубин дает быструю (прямую) реакцию азо-

сочетания. Реакция несвязанного билирубина

значительно медленнее. Ее ускоряют вещества-

акселераторы: гидроокись натрия, желчные кис-

лоты и их соли, некоторые органические кислоты

и их соли, мочевина, кофеин, ацетамид, смесь

НС1 и диметилсульфоксида, смесь антипирина,

мочевины и ацетата натрия, этиленгликоль и

другие вещества. Акселераторы освобождают

билирубин из белковых комплексов и тем самым

ускоряют реакцию азосочетания. Связанный би-

лирубин соединен с альбумином значительно

менее прочно, чем несвязанный, что обусловли-

вает характер реакции.

Азокраситель, образовавшийся при азосоче-

тании билирубина с диазотированной сульфани-

ловой кислотой, ведет себя как кислотно-основ-

ной индикатор с несколькими цветными пере-

ходами. В сильно кислой среде раствор азокра-

сителя окрашен в фиолетовый цвет, в слабо-

кислой и слабощелочной среде — в розовый,

в сильно щелочной среде — в синий. Опреде-

ление билирубина в сильно щелочной среде

значительно повышает чувствительность метода.

Азобилирубин обладает свойствами комплексо-

образования, что повышает интенсивность

окраски. На практике для определения билиру-

бина можно пользоваться азокомплексами

с медью и цинком.

Первый азобилирубиновый метод предложен

Van den Berg в 1916 г. В оригинальном методе

Ван ден Берга не применяются акселераторы;

содержание фракций билирубина количественно

этим методом не определяется. Наиболее рас-

пространенными и приемлемыми являются диа-

зометоды с применением в качестве акселера-

торных веществ смеси кофеина с бензоатом

натрия и ацетатом натрия, а также метанола.

Принцип первого способа положен в основу ме-

тода Ендрассика—Грофа, принцип второго —

в основу метода Маллоя—Евелина. В настоящее

время в автоанализаторах применяется кинети-

ческое определение билирубина, основанное на

различных кинетических свойствах связанного

и несвязанного билирубина.

Оптимизация условий определения и унифи-

кация методов. Метод Ендрассика—Грофа ут-

вержден приказом Министерства здравоохране-

ния СССР в 1972 г. в качестве унифицирован-

ного. Данный  п р и н ц и п положен в основу боль-

шинства коммерческих наборов реактивов, в

частности набора реактивов, выпускаемого «Ла-

хема» (ЧССР). Концентрация сульфаниловой

кислоты не оказывает заметного влияния на

скорость реакции диазосочетания и на чувстви-

8 п/р В. В. Меньшикова

225

тельность метода. Однако молярное соотноше-

ние сульфаниловой кислоты к нитриту в реак-

ционной смеси не должно быть менее 3 : 1. В на-

боре реактивов Био-Ла-Тест («Лахема», ЧССР)

такое соотношение равно 5 : 1; в унифицирован-

ном методе 14 : 1. Избыток сульфаниловой кис-

лоты не влияет на азокраситель. Наибольшая

чувствительность достигается при рН 5,4. Сни-

жение концентрации кофеина в 10 раз не ока-

зывает существенного влияния на результаты.

Унифицированный метод по диазореакции

в присутствии акселератора (метод Ендрас-

сика—Клеггорна—Грофа).  П р и н ц и п . Под

воздействием НС1 разрывается тетрапирроловая

связь билирубина и образуются два дипиррола,

которые диазотируются диазобензосульфоновой

кислотой с образованием розово-фиолетового

азобилирубина. Связанный билирубин реаги-

рует быстро, несвязанный билирубин реагирует

после добавления кофеинового реактива.

Р е а к т и в ы . 1. Кофеин, фарм. 2. Натрия

бензоат ч. 3. Натрия ацетат 3-водный ч.д.а. или

х.ч. 4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г

бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия раство-

ряют в 90 мл воды, нагревают до 50—60 °С,

хорошо перемешивают. После охлаждения до-

водят водой до 100 мл. Раствор стабилен в тече-

ние 2 нед. 5. Натрия хлорид ч.д.а. или х.ч.,

154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хло-

рида натрия помещают в мерную колбу вмести-

мостью 100 мл и доводят до метки водой. 6. НС1

концентрированная ч.д.а. или х.ч. 7. Сульфани-

ловая кислота ч.д.а. 8. Диазосмесь. Диазоре-

актив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют

при нагревании в 300—400 мл воды, прибавляют

15 мл концентрированной НС1. Если сульфани-

ловая кислота полностью не растворяется, колбу

помещают в теплую воду и помешивают. Только

после растворения и охлаждения раствор доли-

вают водой до I л. Реактив стабилен при хране-

нии в посуде из темного стекла. Диазореактив

II: натрия нитрит ч.д.а. или х.ч., 5 г/л (0,07

моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мер-

ную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой

до метки. Реактив стабилен в течение 2—3 нед

при хранении в посуде из темного стекла. Перед

работой смешивают 10 мл диазореактива I и

0,3 мл диазореактива П. 9. Билирубин для по-

строения калибровочного графика, 800 мг/л,

или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты

кристаллического билирубина содержат разные

примеси, которые могут мешать реакции азосо-

четания. Рекомендуется использовать набор

Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» (ЧССР), со-

держащий билирубин высокой степени чистоты

с коэффициентом молярной экстинкции не менее

6,05-10

4

  л - м о л ь

- 1

•см

при 453 нм и растворе-

нии в хлороформе. Растворы билирубина не-

стойкие, поэтому их готовят с добавлением белка

в качестве стабилизатора. Коммерческие препа-

раты билирубина не связаны с глюкуроновой

кислотой. 10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л:

10,6 г безводного Nа

2

СОз растворяют и доводят

до 1 л водой.  1 1 . Уксусная кислота, 4 моль/л:

25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до

100 мл водой.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза. Сы-

воротку хранят в холодном темном месте не бо-

лее 12 ч.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В 3 пробирки

(2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы,

как указано в схеме.

Ингредиенты

Сыворотка

Кофеиновый реактив

Раствор хлорида

натрия

Диазосмесь

Опытная проба, мл

общий

били-

рубин

0,5

1,75

—

0,25

связан-

ный били-

рубин

0,5

—

1,75

0,25

Холо-

стая

проба,

мл

0,5

1,75

0,25

"

Для определения связанного билирубина из-

мерение проводят спустя 5—10 мин после добав-

ления диазосмеси, так как при длительном стоя-

нии в реакцию вступает несвязанный билиру-

бин. Для определения общего билирубина пробу

для развития окраски оставляют стоять 20 мин,

после чего измеряют на фотометре. При даль-

нейшем стоянии окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500—

560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщи-

ной слоя 0,5 см против воды. Из показателей,

полученных при измерении общего и связанного

билирубина, вычитают показатель холостой

пробы.

Р а с ч е т производят по калибровочному

графику. Находят содержание общего и связан-

ного билирубина.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Способ 1 — Шелонга—Венде с ис-

пользованием стабилизирующего свойства бел-

ка сыворотки крови. Основной раствор билиру-

бина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют

40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л рас-

твора карбоната натрия Na

2

CO

3

. Хорошо взбал-

тывают, не допуская образования пузырьков.

Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором

Na

2

CO

3

 и несколько раз перемешивают. Раствор

стоек только в течение 10 мин от начала приго-

товления. В дальнейшем происходит окисление

билирубина.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл све-

жей негемолизированной сыворотки здорового

человека добавляют 2 мл свежеприготовленного

основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л

раствора уксусной кислоты. Хорошо перемеши-

вают. При этом выделяются пузырьки углекис-

лого газа. Рабочий раствор стоек в течение не-

скольких дней. Этот раствор содержит точно на

100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше,

чем сыворотка, взятая для приготовления рас-

твора. Чтобы исключить при расчетах количество

билирубина, содержащегося в этой сыворотке,

при измерении на фотометре из величин эксти-

нкции калибровочных проб вычитают величины

экстинкции соответствующих разведений ком-

пенсационной жидкости.

226