Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 54

К 5 мкл каждого рабочего калибровочного

раствора добавляют 750 мкл 5,5'-дитио-бис-

(2-нитробензойной кислоты) в фосфатном бу-

фере и 25 мкл воды. Экстинкцию измеряют при

405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против

холостой пробы.

Холостая проба включает 750 мкл раствора

5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в

фосфатном буфере и 30 мкл воды.

Линейность калибровочной кривой сохраня-

ется до 166,7  м к м о л ь / ( с - л ) или 10000 ME.

Р а с ч е т . При расчете по рабочему калиб-

ровочному раствору L-цистеина используют

формулу:

ния абсорбции опытной пробы за 30 с; Екал — эк-

стинкция рабочего калибровочного раствора

L-цистеина; 66,68 — активность холинэстеразы

для рабочего калибровочного раствора L-цисте-

ина, мкмоль/(с • л), за 30 с.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : при

25 °С — 50—155  м к м о л ь / ( с - л ) , или 3000—

9300 ME; при 30 °С — 62—191 мкмоль/(с • л),

или 3714—11513 ME; при 37 °С — 88—240

м к м о л ь / ( с - л ) , или 4659—14443 ME.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь 7—10%.
П р и м е ч а н и е . Определение и расчет ко-

эффициента молярной абсорбции для 2-нит-

ро-меркаптобензоата проводят по формуле:

Е

  2 ,

Е = М /МОЛЬ,

где с — концентрация L-цистеина в реакци-

онной смеси, моль/м

3

; / — толщина слоя

кюветы, м; £ — экстинкция 2-нитро-5-мер-

каптобензоата для данной концентрации

L-цистеина в условиях опыта.

Л и т е р а т у р а . Knedel M., Bottger R.

Klin. Wschr., 1967, Bd 45, S. 325; Szasz G.

Clin. chim. Acta, 1968, vol. 19, p. 191; Test-

Combination Cholinesterase. Cat. № 124133,

Boehringer Mannheim GmbH. Diagnostica.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . При пораже-

нии печени активность фермента в сыворотке

крови понижается, так как нарушается синтез

фермента клетками печени. Определение актив-

ности холинэстеразы не имеет большого значе-

ния при остром гепатите, но очень ценно для

наблюдения за течением болезни и для определе-

ния прогноза при хронических заболеваниях

печени. Активность фермента уменьшается при

отравлении фосфорорганическими соедине-

ниями.

5.3. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА

Низкомолекулярные азотистые вещества или

небелковые азотистые компоненты крови состоят

главным образом из конечных продуктов обмена

белков и нуклеиновых кислот. Эти вещества ос-

таются в сыворотке крови после осаждения

белка.

В состав фракций небелкового азота крови

или сыворотки крови входит азот мочевины

~50 %, аминокислот ~25 %, мочевой кислоты

~4 %, креатина и креатинина ~7,5 %, аммиа-

ка и индикана ~0,5 %, полипептидов, нуклео-

тидов и других азотистых соединений ~5 %.

Содержание небелковых компонентов сыворотки

крови может меняться в зависимости от способа

осаждения белков. Основной фракцией остаточ-

ного азота является мочевина, определение ко-

торой может применяться в диагностических

целях вместо остаточного азота.

5.3.1. Мочевина

Синтез мочевины происходит в печени глав-

ным образом из аммиака, который образуется

при дезаминировании аминокислот, распада пу-

риновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Методы определения мочевины. Мочевину

в биологических жидкостях можно определить

газометрическими, гипобромитными методами;

прямыми фотометрическими методами, основан-

ными на реакции мочевины с различными ве-

ществами с образованием окрашенных соедине-

ний; ферментативными методами с последу-

ющим определением аммиака или углекислоты

как продуктов действия уреазы на мочевину.

Принцип газометрических методов основан на

окислении мочевины гипобромитом натрия в ще-

лочной среде. Мочевина подвергается окисле-

нию соответственно следующему уравнению:

CO(NH

2

)

2

 + 3NaBrO—>

2

 + 3NaBr+2H

2

O.

Углекислота поглощается раствором, объем

газообразного азота измеряется с помощью спе-

циального аппарата. Наиболее удобно для прак-

тических целей проводить определение мочевины

в аппарате Бородина. Недостатком этой реакции

являются ее низкие специфичность и точность,

так как гипобромит натрия реагирует не только

с мочевиной, но и с другими соединениями,

содержащими аминогруппы. Методы этой груп-

пы неточны, плохо воспроизводимы и неудобны

при серийной работе, чувствительность их низ-

кая. Бром характеризуется высокой токсично-

стью.

Среди фотометрических методов наиболее

распространенными являются методы, основан-

ные на реакции мочевины с диацетилмоноокси-

мом — реакции Ферона, протекающей в два

этапа.

215

В о с п р о и з в о д и м о с т ь 7—10%.
П р и м е ч а н и е . Определение и расчет ко-

эффициента молярной абсорбции для 2-нит-

ро-меркаптобензоата проводят по формуле:

Для окисления гидроксиламина могут приме-

няться следующие вещества: персульфат калия,

мышьяковая кислота, хлорная кислота, катионы,

феназон. Для интенсификации окраски и повы-

шения ее стабильности применяются: тиосеми-

карбазид, фенилантраниловая кислота, глюку-

ронолактон, катионы, триптофан и нитриты. Ме-

тоды этой группы отличаются хорошей воспро-

изводимостью, высокой чувствительностью,

большей специфичностью, чем гипобромитные.

В некоторых методах используется 20—50 мкл

сыворотки, что позволяет применять их без де-

протеинизации сыворотки.

Ферментативные методы основаны на гидро-

лизе мочевины уреазой. Для уреазы мочевина

является единственным физиологическим суб-

стратом, поэтому уреазные методы высокоспе-

цифичны. Оптимум действия уреазы рН 6,0—

8,0 зависит от вида буфера. Наиболее употре-

бительные буферные растворы в уреазных ме-

тодах: ЭДТА-буфер, оптимум рН 6,0—6,5, и

фосфатный буфер, оптимум рН 6,9—7,0. Ком-

мерческие препараты уреазы характеризуются

различной активностью и степенью чистоты. Об-

разовавшийся в ходе ферментативной реакции

аммиак можно определить с помощью различ-

ных реакций. Фенолгипохлоритная реакция вы-

сокочувствительна и специфична на аммиак.

В реакции используются катализаторы, наибо-

лее эффективным из применяемых катализато-

ров является нитропруссид натрия. Интенсив-

ность окраски образующегося соединения не за-

висит строго от концентрации реактивов. Изме-

нение концентрации фенола и нитропруссида

натрия на 20 % и гипохлорита натрия на 25—

50 % не влияет на интенсивность окраски. Соот-

ношение концентраций фенола, едкого натра

и гипохлорита натрия в реакции приблизительно

должно быть равно 1:1:0,1. Салицилатно-гипо-

хлоритная реакция, описанная R. Richterich,

является чувствительной и специфичной на ам-

миак. Реакция Несслера не является специфич-

ной, приблизительно в 10 раз менее чувствитель-

на на аммиак, чем фенолгипохлоритная. Недо-

статком реакции является частое образование

помутнения. Дихлоризоциануратная реакция

216

достаточно чувствительна, но определению

а м м и а к а мешает наличие в пробах

бел ка.

Ферментные методы определения аммиака по

оптическому тесту Варбурга с применением глу-

таматдегидрогеназы позволяют определить наи-

более правильно содержание аммиака и прием-

лемы для ручного и автоматического определе-

ния мочевины.

Ксантгидроловые методы в клинических ла-

бораториях применяются редко, так как трудо-

емки и неспецифичны, многие амины и амиды

дают с ксантгидролом такую же реакцию, как

и мочевина. Кроме перечисленных выше ве-

ществ, мочевина образует окрашенные соедине-

ния с п-диметиламинобензальдегидом (реакция

Эрлиха), изо-нитрозопропиофеноном, N-бром-

сукцинидом. Однако перечисленные реакции не

являются специфичными на мочевину. Уреазный

и диацетилмонооксимный методы применяются

на автоанализаторах различного принципа дей-

ствия.

Унификация методов. В качестве унифици-

рованных утверждены диацетилмонооксимный

метод в 1972 г. и уреазный метод, фенолгипо-

хлоритная реакция в 1974 г. «Лахема» (ЧССР)

выпускает наборы реактивов для определения

мочевины диацетилмонооксимным и уреазным

методами. На уреазном принципе основано

определение мочевины во многих коммер-

ческих наборах реактивов, например фирмы

«Boehringer Mannheim» (ФРГ), «Reanal»

(ВНР).

Унифицированный метод по цветной реакции

с диацетилмонооксимом.  П р и н ц и п . Мочеви-

на образует с диацетилмонооксимом в присут-

ствии тиосемикарбазида и солей железа в кис-

лой среде окрашенное соединение.

Р е а к т и в ы .  1 . Трихлоруксусная кислота,

100 г/л. 2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный

раствор. Реактив стабилен. 3. Тиосемикарбазид,

2,5 г/л водный раствор. Для приготовления

реактива можно пользоваться также тиосеми-

карбазида гидрохлоридом; последний применя-

ется в виде 3,2 г/л водного раствора. Оба реак-

тива стабильны при хранении в темной посуде

при комнатной температуре. 4. Серная кислота

концентрированная. 5. Ортофосфорная кислота

85 %. 6. Хлорное железо. Основной раствор

хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят

до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл

концентрированной серной кислоты. Из основно-

го раствора готовят рабочий раствор хлорного

железа: 1 мл основного раствора хлорного желе-

за доводят до 100 мл водой, затем добавляют

8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл

85 % ортофосфорной кислоты. Хранят в темной

посуде. Годен в течение 2 нед. 7. Бензойная

кислота, 2 г/л; 0,2 г кристаллической бензойной

кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсив-

ном перемешивании на водяной бане. 8. Моче-

вина для приготовления калибровочного рас-

твора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины:

42 мг мочевины растворяют в воде в мерной кол-

бе вместимостью 100 мл. В качестве раствори-

теля можно использовать 2 г/л раствор бензой-

ной кислоты. Калибровочный раствор, приго-

товленный на растворе бензойной кислоты, ста-

бильнее, чем водный; 1 мл калибровочного рас-

твора содержит 0,007 ммоль мочевины. 9. Цвет-

ной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного

железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л рас-
твора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л

раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив

готовят каждый раз перед употреблением.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, моча. Перед определением

профильтрованную мочу (из суточного коли-

чества) разводят изотоническим раствором нат-

рия хлорида в соотношении 1:25 или 1:50.

Х о д  о п р е д е л е н и я мочевины в сыво-

ротке крови. Опытная проба: в центрифужную

пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыво-

ротки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной

кислоты, смешивают. Через 15 — 20 мин центри-

фугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл

надосадочной жидкости и 5 мл цветного реакти-

ва. Пробирку выдерживают на кипящей водяной

бане в течение 20 мин, затем охлаждают в тече-

ние 2 — 3 мин под проточной водой. Измерение

проводят на фотометре при длине волны 530 —

560 нм (зеленый светофильтр) против холостой

пробы в кювете с толщиной слоя 1 см. Холо-

стую пробу ставят так же, как опытную, но

вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл

воды.

Р а с ч е т проводят по формуле путем срав-

нения с калибровочной пробой. Калибровочную

пробу ставят аналогично опытной, но вместо

сыворотки берут 0,2 мл калибровочного рас-

твора.

где Еоп — экстинкция опытной пробы; Е

к

 — эк-

стинкция калибровочной пробы; С

к

 — концен-

трация мочевины в калибровочном растворе,

7 ммоль/л.

О п р е д е л е н и е  м о ч е в и н ы в  м о ч е

проводят аналогично определению мочевины в
сыворотке крови, но вместо сыворотки берут

0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обраба-

тывают калибровочную пробу, как описано для

определения мочевины в сыворотке крови.

Р а с ч е т мочевины на суточное количество

мочи производят по следующей формуле:

где Мсут — количество мочевины в суточной мо-

че, ммоль; Еоп — экстинкция опытной пробы;

Е

к

 — экстинкция калибровочной пробы; С

к

 —

содержание мочевины в калибровочном рас-

творе, ммоль; а — суточное количество мочи,

мл, б — количество мочи, взятое на анализ,

мл; К—коэффициент разведения мочи.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Для сыво-

ротки крови — 2,5—8,3 ммоль/л, или 15—50  м г /

100 мл; для мочи — 330—580 ммоль мочевины

в суточной моче, т. е. 20—35 г/сут.

П р и м е ч а н и я . 1. Измерение проводят не

позже чем через 15 мин после охлаждения

проб ввиду неустойчивости окраски. 2. Из-за

неустойчивости окрашенного комплекса мо-

чевины с диацетилмонооксимом и зависимо-

сти окраски от условий нагревания калибро-

вочную пробу определяют параллельно каж-

дой серии опыта. 3. При содержании моче-

вины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л

сыворотку разводят изотоническим раство-

ром хлорида натрия, а результаты умножают

на коэффициент разведения. 4. Для пере-

счета на азот мочевины результаты следует

разделить на 2,14.

О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и  м е т о д а . Воспроизводимость: коэф-

фициенты вариации составляют 3—6 %. Пра-

вильность: результаты исследования, получен-

ные диацетилмонооксимным методом, хорошо

коррелируют с уреазным методом; г = 0,93—

0,97.

Л и т е р а т у р а . Marsh W., Fingerhut В.,

Miller H.  C l i n . Chern., 1965, vol.  1 1 , p. 624.

Уреазный метод по реакции с фенол-гипо-

хлоритом.  П р и н ц и п . Мочевина под действи-

ем уреазы разлагается с образованием аммиака

и углекислого газа. Выделившийся  а м м и а к об-

разует с гипохлоритом натрия и фенолом окра-

шенный продукт—индофенол (синего цвета).

Реакция катализируется нитропруссидом нат-

рия. Интенсивность окраски пропорциональна

содержанию мочевины. Стадии реакции:

217

Р е а к т и в ы . 1. Уреаза. Для определения

пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.

2. Этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной

кислоты динатриевая соль (трилон Б), ч. д. а.

3. ЭДТА — буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5:0,50 г

трилона Б растворяют в 30—40 мл воды, доводят

рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и до-

ливают водой в мерной колбе до 50 мл. 4. Основ-

ной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг

уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в

10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависи-

мости от активности фермента. Раствор

стабилен в течение месяца при хранении

в холодильнике. 5. Рабочий раствор уреазы.

Перед началом определения берут

необходимое количество основного рас-

твора уреазы и разводят бидистиллированной

водой в отношении 1:4. 6. Фенол ч. д. а. 7. Нат-

рия нитропруссид 2-водный ч. д. а. 8. Цветной

реактив: фенол — 0,11 моль/л, нитропруссид

натрия — 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида

натрия помещают в мерную колбу вместимостью

500 мл, приливают примерно 300 мл воды, рас-

творяют при перемешивании. Затем добавляют
5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реак-

тив стабилен в течение месяца при хранении

в холодильнике в посуде из темного стекла.

9. Натр едкий ч. д. а., х. ч., 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорит натрия. Приготовление основ-

ного раствора гипохлорита: 100 г хлорной из-

вести размешивают в течение 15 мин с 170 мл

воды, после чего прибавляют при непрерывном

помешивании раствор, состоящий из 170 мл во-

ды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала

густеет, затем разжижается. Оставляют стоять

до следующего дня. Надосадочную жидкость

(гипохлорит натрия) сливают и фильтруют че-

рез промытый водой фильтр. Хранят в холо-

дильнике в посуде из темного стекла. Определе-

ние активности хлора: 1 мл основного раствора

гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды.

К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свеже-

приготовленного 50 г/л раствора йодида калия

и 10 мл 6 моль/л раствора НС1. Титруют 0,1 н.

раствором тиосульфата натрия (готовят из фик-

санала). Как только раствор приобретает слабо-

желтую окраску, добавляют 10 капель 1 % рас-

твора крахмала и титруют до обесцвечивания.

Концентрацию гипохлорита натрия рассчитыва-

ют по хлору:

К = а- 0,709,

где К — концентрация активного хлора,

г/100 мл гипохлорита натрия; а — количество

тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;

0,709 — коэффициент пересчета 1 мл тиосуль-

фата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.

11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После

установления концентрации активного хлора ос-

новной раствор гипохлорита натрия разводят

водой так, чтобы концентрация хлора состав-

ляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержа-

нием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объе-

мом 0,26 моль/л раствором едкого натра

(100 мл + 100  м л ) . Активность хлора проверяют

не реже одного раза в 2 нед. Рабочий раствор

218

содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л

едкого натра. Раствор хранят в холодильнике

в посуде из темного стекла. 12. Мочевина ч. д. а.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту раство-

ряют при нагревании). 14. Калибровочный рас-

твор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины

растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл

в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор

стабилен при хранении в холодильнике. 15. Нат-

рия хлорид, 0,154 моль/л.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр или колориметр с кюветой

для микроизмерений. 2. Полуавтоматические

микропипетки.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови или плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определе-

нием сыворотку разводят 0,154 моль/л раство-

ром хлорида натрия в отношении 1:9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора

уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл

разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, пе-

ремешивают и инкубируют в течение 15 мин

при 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл

цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора

гипохлорита натрия. Перемешивают и инкуби-

руют в течение 20—30 мин при 37 °С. Измеряют

экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см

при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-

фильтр) против холостой пробы. Окраска ста-

бильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу обрабатывают так же, как

опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л

раствор NaCl.

Калибровочную пробу обрабатывают так же,

как опытную, но вместо сыворотки берут калиб-

ровочный раствор мочевины. Измеряют при тех

же условиях против холостой пробы.

Расчет ведут по формуле:

где Еоп — экстинкция опытной пробы; Ек — эк-

стинкция калибровочной пробы; 0,5— концент-

рация мочевины в калибровочном растворе,

ммоль/л; 10— коэффициент разведения.

Линейная зависимость между оптической

плотностью и концентрацией мочевины сохра-

няется до 33 ммоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Сыворотка

крови —2,5—8,3 ммоль/л, или 20—50 мг/100 мл.

О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и  м е т о д а . Коэффициенты вариации

находятся в пределах 3—8 %. Уреазная реак-

ция высокоспецифична. Фенолгипохлоритная

реакция в условиях проведения метода при

рН> 7,0 также специфична.

П р и м е ч а н и е . Объемы сыворотки и реак-

тивов можно пропорционально увеличивать.
Л и т е р а т у р а . Chaney A. L., Mar-

bach Е. P. Clin. Chem., 1962, vol. 8, p. 131;

Gutmann 1., Bergmeyer H. U.  I n : Methods of

enzymatic analysis/Ed. H. U. Bergmeyer 2 ed.

New Jork — London, 1974, vol. 4, p. 1791 —

1794; Kaplan A. In: Standard methods in  c l i n i c a l

chemistry.— New York, 1965, vol. 5, p. 245.