Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 53

Метод, основанный на указанных реакциях,

трудно выполнять в практических лабораториях

без наличия готовых наборов реактивов, к тому

же глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа отличает-

ся низкой стабильностью. Из-за трудоемкости

методы, основанные на определении фосфотри-

оз также не нашли широкого применения.

Наиболее простыми и распространенными

являются динитрофенилгидразиновые методы,

основанные на гидролизе фруктозодифосфата

с образованием триоз, которые дают с 2,4-ди-

нитрофенилгидразином окрашенные гидразоны.

Первый динитрофенилгидразиновый метод для

определения активности альдолазы в сыворотке

крови был описан J. Sibley, A. Lehninger в 1949 г.

В дальнейшем были предложены различные мо-

дификации метода. В методах определения АЛД

сложным является вопрос относительно выбора

калибровочного материала. В качестве калибро-

вочного материала можно использовать фрукто-

зодифосфат и триозы: глицеральдегид или диок-

сиацетон. Возможность использования глицер-

альдегида и диоксиацетона обусловлена тем,

что в ходе ферментативной реакции образуется

равное количество триоз. Диоксиацетон — более

стойкое вещество, чем глицеральдегид, поэтому

его предпочтительнее использовать в качестве

калибровочного материала.

Колориметрический динитрофенилгидрази-

новый метод (Товарницкого — Волуйской).

П р и н ц и п . Альдолаза расщепляет фруктозо-

1,6-дифосфат на фосфоглицериновый альдегид

и фосфодиоксиацетон. При отщеплении лабиль-

ного фосфора альдегидные и кетоновые группы

триоз фиксируются гидразином по мере их обра-

зования. Для предупреждения вовлечения фос-

фотриоз в дальнейшие реакции к раствору

фруктозодифосфата прибавляется монойодук-

сусная кислота, которая блокирует ферменты,

разрушающие фосфотриозы. Свободные триозы

с 2,4-динитрофенилгидразином образуют гидра-

зоны, окрашенные в щелочной среде.

Р е а к т и в ы .  1 . 0-фруктозо-1,6-дифосфата

натриевая соль, 0,06 моль/л; 2 мл 10 % раствора

натриевой соли 0-фруктозо-1,6-дифосфата (рас-

фасованного в ампулах) разводят в колбе вме-

стимостью 25 мл водой и доводят объем раствора

до метки. Разведенный раствор фруктозе-1,6-

дифосфата стабилен при хранении в холодиль-

нике. 2. HCI, 2 моль/л. Готовят разведением

17 мл концентрированной кислоты (отн. плот-

ность 1,19) в 100 мл воды. 3. 2,4-Динитрофенил-

гидразин, 1 г/л раствор: 100 мг сухого вещества

растворяют в 100 мл 2 моль/л раствора HCI.

4. Натрия карбонат кислый, 5 г/л: 500 мг

МаНСОз растворяют в 100 мл воды. 5. Гидрази-

на сульфат, 0,56 моль/л: растворяют 7,3 г гидра-

зина сульфата в небольшом количестве воды

(от 30 до 40 мл), доводят рН до 7,4—7,6 и доли-

вают водой до 100 мл. 6. Монойодуксусная

кислота, 0,4 г/л водный раствор: 40 мг монойод-

уксусной кислоты растворяют в 80 мл воды,

доводят рН раствором едкого натра до 7,4 и до-

ливают водой до 100 мл. 7. Трихлоруксусная

кислота, 100 г/л. 8. Едкий натр, 30 г/л. 9. Бром-

тимоловый синий (индикатор), 0,4 г/л: раство-

ряют 10 мг индикатора в 3,2 мл 2 г/л раствора

едкого натра. Объем раствора доводят водой до

25 мл. Этим раствором пользуются для установ-

ления рН. При рН 7,4—7,7 индикатор приобре-

тает синий цвет. 10. Калибровочный раствор

диоксиацетона.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я !

Сыворотка, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в

пробирку вносят: 0,5 мл исследуемой сыворотки:

0,5 мл 5 г/л раствора NaHCOa, 0,12 мл раствора

гидразина сульфата, 0,12 мл раствора монойод-

уксусной кислоты, 0,12 мл воды, 0,12 мл фрукто-

зодифосфата. Перемешивают, инкубируют 1 ч

при 37 °С. После инкубации в пробу добавляют

1,5 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кисло-

ты, содержимое пробирок перемешивают и цен-

трифугируют.

В другую пробирку вносят 0,5 мл центри-

фугата, 0,5 мл 30 г/л раствора NaOH и оставля-

ют на 10 мин при комнатной температуре. Затем

добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенил-

гидразина, перемешивают, смесь нагревают

10 мин при 37 °С, добавляют по 3 мл 30 г/л

раствора NaOH и через 10—20 мин определяют

оптическую плотность раствора на ФЭКе в кюве-

те с толщиной слоя 0,5 см с зеленым светофильт-

ром (540 нм) против холостой пробы. При стоя-

нии проб больше 20 мин окраска бледнеет.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент

вариации около 10 %.

Р а с ч е т проводят по калибровочной

кривой.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о й

к р и в о й . 22,5 мг диоксиацетона при нагрева-

нии растворяют в 25 мл воды; 1 мл такого рас-

твора содержит 10 мкмолей диоксиацетона.

В ряд пробирок (см. ниже) разливают калибро-

вочный раствор диоксиацетона, доливают водой

и далее проводят реакцию так же, как и при

определении активности фермента.

Л и т е р а т у р а . Sibfey J. A., Lehninger A. L.

J. biol. diem., 1949, vol. 177, p. 859.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние активности АЛД наблюдается при многих

патологических состояниях: остром гепатите, ин-

фаркте миокарда, прогрессивной мышечной ди-

строфии, дерматомиозите, гемолитических со-

стояниях, активном ревматизме, раке различной

локализации.

211

№ про-

бирки

1

2
3

4

5

Калибре--

вочный

раствор

диокси-

ацетона,

мл

0,05

0,1

0,2

0,3

0,4

Дистил-

лирован-

ная вода,

мл

0,45

0,4

0,3

0,2

0,1

Диокси-

ацетон в

пробе,

мкмоль

0,5

1

2

3

4

Фрукто-

30-1,6-

дифос-

фат в

пробе,

мкмоль

0,25

0,5

1

1,5

2

Повышение активности фруктозомонофо-

сфат-альдолазы наблюдается при острых гепа-

титах. При хронических гепатитах и циррозах

печени активность фермента повышается у боль-

шинства больных, но это повышение менее выра-

жено, чем при остром гепатите.

5.2.14. Псевдохолинэстераза

Различают два типа холинэстераз — ацетил-

холинэстеразу, или истинную холинэстеразу —

АХЭ (ацетилхолин-ацетилгидролаза; К. Ф.

3.1.1.7) и псевдохолинэстеразу — ХЭ (ацил-

холин-ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8). Истинная

холинэстераза содержится преимущественно в

эритроцитах, нервной и мышечной тка-

нях; Псевдохолинэстераза — в сыво-

ротке крови, печени, поджелудочной железе.

АХЭ и ХЭ различаются по ряду свойств и прежде

всего по субстратной специфичности. Наиболее

специфичным субстратом для истинной холин-

эстеразы является ацетилхолин, для псевдохо-

линэстеразы — бутирилхолин. Псевдохолинэс-

тераза не отличается строгой субстратной спе-

цифичностью и гидролизует такие субстраты,

как ацетилхолин, бензоилхолин, сукцинилхолин

и другие эфиры холина.

При гидролизе ацетилхолина реакция проте-

кает следующим образом:

Методы определения. Манометрические ме-

тоды основаны на измерении в аппарате Вар-

бурга количества СО

2

, образовавшегося из кар-

бонатного буфера под влиянием уксусной ки-

слоты, освободившейся во время ферментной

реакции; титрометрические методы — на изме-

рении количества щелочи, пошедшей на титро-

вание уксусной кислоты; фотометрические мето-

ды — на изменении цвета раствора под влия-

нием уксусной кислоты в присутствии индика-

тора. К этой группе относится метод Молан-

дера — Фридмана (1954), гидроксиламиновый

метод Хестрина (1949). Электрометрические ме-

тоды основаны на измерении рН реакционной

смеси до и после опыта. Принцип кондуктомет-

рических методов состоит в изменении электро-

проводности инкубационной среды в результате

ферментативной реакции.

Применение кондуктометрических и мано-

метрических методов на практике ограничено,

так как требуется дорогостоящая аппаратура.

Наиболее простыми являются фотометрические

методы, основанные на гидролизе ацетилхолина

с образованием уксусной кислоты и изменением

'цвета реакционной смеси в присутствии индика-

тора. Эти методы различаются по концентрации

субстрата, виду буфера и индикатора. Широко

применяются также методы с использованием

в качестве субстрата ацетилтиохолина или бути-

илтиохолина. В результате гидролиза этих эфи-

212

ров под действием фермента образуется тиохо-

лин, который посредством своей SH-группы реа-

гирует с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной ки-

слотой с образованием 2-нитро-5-меркапто-бен-

зоата, имеющего желтую окраску с максимумом

абсорбции 410 нм. Эти методы могут быть ис-

пользованы для кинетического измерения актив-

ности фермента. При использовании в качестве

субстрата бензоилхолина применяют спектрофо-

тометрический метод, принцип которого основан

на различии абсорбции бензоилхолина и обра-

зующейся в процессе реакции бензойной ки-

слоты.

В 1974 г. в качестве унифицированного ут-

вержден фотометрический метод с субстратом

ацетилхолинхлоридом. Все параметры реакции

в методе оптимизированы.

Унифицированный метод по гидролизу аце-

тилхолинхлорида.  П р и н ц и п . Под действием

холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхо-

линхлорида с образованием уксусной кислоты

и холина. Уксусная кислота сдвигает рН раст-

вора, что устанавливается с помощью индика-

тора.

Р е а к т и в ы . 1. Ацетилхолина хлорид,

0,9 моль/л: 1,63 г ацетилхолина хлорида рас-

творяют в 10 мл воды. При использовании фар-

макопейного ампулированного препарата содер-

жимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл

воды. 2. 5,5'-Диэтилбарбитуровой кислоты нат-

риевая соль (натриевая соль веронала), фарм.

3. НС1, 0,1 моль/л. 4. Натр едкий х. ч., 0,05

моль/л. 5. Феноловый красный, индикатор, рас-

твор 0,1 г/л, область действия рН 6,8—8,4.

Изменение окраски от желтой к красной. В фар-

форовой ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора

едкого натра растворяют 0,1 г сухого  и н д и к а -

тора, переносят в мерный цилиндр и доводят

до 25 мл водой. Из полученного 4 г/л раствора

перед употреблением готовят 0,1 г/л раствор

разведением водой в 40 раз. 6. Вероналовый

буфер, 0,0075 моль/л, рН 8,4: 1,5450 г натриевой

соли веронала растворяют в 500 мл воды, добав-

ляют 9 мл 0,1 моль/л раствора HCI и 150 мл

0,1 г/л раствора индикатора, измеряют рН.

Доливают водой до 1 л. При хранении в холо-

дильнике в посуде из темного стекла реактив

стабилен в течение 1 мес. 7. Прозерин, фарм.,

7 г/л: 0,7 г прозерина помещают в мерную колбу

вместимостью 100 мл и доводят до метки водой.

Хранят в посуде из темного стекла. 8. Калибро-

вочный раствор уксусной кислоты, 0,1 моль/л:

0,57 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) поме-

щают в мерную колбу вместимостью 100 мл

и доводят до метки водой.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка, свободная от гемолиза. Цитратную

и оксалатную плазму употреблять нельзя, так

как соли лимонной и щавелевоуксусной кислот

ингибируют активность фермента.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

смешивают 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл

воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают

при 37 °С в течение 5 мин. Затем добавляют

0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкуби-

руют в течение 30 мин при 37 °С. После инкуба-

ции добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Ох-

лаждают и измеряют на ФЭКе в кювете с толщи-

ной слоя 0,5 см при длине волны 500-560 нм

(зеленый светофильтр) против воды. Окраска

устойчива в течение 1 ч. Холостую пробу ставят

так же, как опытную, но раствор прозерина

добавляют до инкубации. Из экстинкции хо-

лостой пробы вычитают экстинкцию опытной

пробы.

Р а с ч е т ведут  п о калибровочному гра-

фику.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Из 0,1 моль/л раствора уксус-

ной кислоты готовят разведения, как указано
ниже.

Из каждого разведенного раствора берут по

0,2 мл, смешивают с 5 мл вероналового буфера,

0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при 37 °С,

затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл аце-

тилхолинхлорида, инкубируют 30 мин при 37 "С

и охлаждают. Измерение проводят при тех же

условиях, что и опытные пробы. Холостую пробу

ставят так же, как калибровочную, но вместо

растворов уксусной кислоты добавляют воду.

Из экстинкции холостой пробы вычитают эк-

стинкцию калибровочной пробы. Линейная зави-

симость калибровочного графика сохраняется

в пределах от 0 до ПО мкмоль/(с •  л ) .

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 45—95

мкмоль/(с •  л ) , или 160—340 мкмоль/(ч •  м л ) .

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации 5—9 %.

Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. Н., Доб-

рянская Л. Д. В кн.: Унифицированные методы

клинических лабораторных исследований/Под
ред. В. В. Меньшикова.— М., 1974, вып. VI,

с. 5—18; Molander D., Friedman M., La Due J.

A n n .  I n t . Med., 1954, vol. 41, № 6, p. 1139—1151;
Schafer C. W., Dopke K. H., Gall, Gothe W.

A r z n .  s t a n d a r d , 1967, Bd 3, S. 84.

Метод с субстратом бутирилтиохолина йоди-

дом.  П р и н ц и п . Холинэстераза гидролизует

субстрат бутирилтиохолина йодид с образова-

нием кислоты и тиохолина. Тиохолин взаимодей-

ствует с 5,5'-дитио-бис-(2-нитро-бензойной ки-

слотой) с образованием 2-нитро-5-меркаптобен-

зоата, окрашенного в желтый цвет.

Основная реакция:

Индикаторная реакция:

тиохолин+ 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная

кислота) — —>-2-нитро-5-меркаптобензоат.

Активность холинэстеразы сыворотки крови

пропорциональна скорости изменения поглоще-

ния 2-нитро-5-меркаптобензоатом в индикатор-

ной реакции.

Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-

щенный ч. д. а. или х. ч. 2. Натр едкий х. ч. или

ч. д. а. 3. Фосфатный буфер, 52 ммоль/л, рН 7,7:

в мерной колбе вместимостью 1000 мл последо-

вательно растворяют приблизительно в 900 мл

воды 7,075 г однозамещенного фосфата калия

и 1,496 г едкого натра. Проверяют рН и доводят

объем до метки водой. 4. 5,5'-Дитио-бис-(2-нит-

робензойная кислота) кристаллическая, 0,26

ммоль/л раствор в фосфатном буфере, рН 7,7:

0,103 г 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кисло-

ты) растворяют в 500 мл фосфатного буфера

рН 7,7 в мерной колбе вместимостью 1 л. Объем

доводят буфером до метки. Раствор стабилен

в течение 6 нед при  х р а н е н и и в холодильнике

в посуде из темного стекла. 5. S-Бутирилтио-

холина йодид кристаллический, 218 ммоль/л:

0,0792 г бутирилтиохолина йодида растворяют

в мерной колбе, вместимостью 10 мл в воде.

Объем доводят до метки. Раствор стабилен в те-

чение 6 нед при хранении в холодильнике в посу-

де из темного стекла. 6. L-Цистеина гидрохло-

рид, мол. м. 175,6, х. ч. Пригоден L-цистеина

гидрохлорид производства ВНР. Хранят в холо-

дильнике. 7. Основной калибровочный раствор

L-цистеина гидрохлорид, 5 ммоль/л. Готовят в

ледяной бане: 0,0878 г цистеина гидрохлорида

растворяют в 50 мл воды в колбе вместимостью

100 мл, объем доводят до метки водой. Раствор

стабилен в течение 2 ч при хранении в холодиль-
нике. 8. Рабочий калибровочный раствор ци-
стеина гидрохлорида 2 ммоль/л соответствует

активности холинэстеразы 4000 МЕ/л, или

66,68 мкмоль/(с • л). Готовят путем разведения

основного калибровочного раствора водой в

2,5 раза. Стабилен в течение 2 ч при хране-
нии в холодильнике.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Спектрофотометр или колориметр с термостати-

рованной кюветой (25; 30; 37 °С) для микро-

измерений. Колебания температуры не должны
превышать ±0,1 °С. 2. Полуавтоматические

микропипетки.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка или плазма крови. Холинэстераза

сыворотки крови стабильна в течение 5 дней при

хранении при комнатной температуре или в хо-

лодильнике.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определени-

ем температура рабочих растворов и сыворотки

должна быть доведена до температуры измере-

ния. Определяют по следующей схеме.

Смешивают и тотчас измеряют оптическую

плотность против воды при длине волны 400

440 (405) нм в кювете с толщиной слоя 1 см и од-

новременно включают секундомер. Далее еще

3 раза измеряют экстинкцию точно через 30;

60; 90 с.

Р а с ч е т . Для расчета ^Е/30 с-из каждого

последующего результата измерения (при 25
или 30 °С для опытной пробы и при 37 °С —-

для опытной и холостой проб) вычитают пре-

дыдущий. Из полученных величин Е/30 с рас-

рую используют в последующих  р а с ч е т а х . В ел у
чае измерения при 37 °G делают поправку на

холостую пробу (за счет  с п о н т а н н о г о гидролиза
субстрата).

Активность холинэстеразы в сыворотке крови

может быть рассчитана по формуле с примене-

нием коэффициента молярной экстинкции 2-
нитро-5-меркаптобензоата, по калибровочной

кривой и с использованием величины экстинкции
рабочего калибровочного раствора L-цистеина.

Р а с ч е т с применением коэффициента мо-

лярной экстинкции производят по следующей

формуле:

каталитическая активность,  м о л ь / ( с - м

3

) =

где Vр. с.— объем реакционной смеси; V

сыв

 —

объем сыворотки; t — время реакции, с; ^E —

214

изменение экстинкции в 1 с; / — толщина слоя

жидкости в кювете, м  ( 1 - 1 0 -

  2

); ? — коэф-

фициент . молярной экстинкции 2-нитро-5-мер-
каптобензоата в условиях проведения определе-

н и я (м

2

 • моль-  ' ) .

Величина коэффициента молярной экстинк-

ции зависит от условий проведения определе-

ния: рН, температуры, длины волны измерения

и др. Коэффициент молярной экстинкции при

температуре 25 °С, длине волны 405 нм, толщине

слоя кюветы I см равен 13,3- 10

2

 м

2

/моль, при

измерении на фотоколориметре со светофильт-

ром с длиной волны 405 нм при 30 °С — 14,3

м

2

/моль, при 37 °С — 14,66 м

2

/моль.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о й

к р и в о й . Из основного раствора L-цистеина
п р и г о т а в л и в а ю т серию рабочих калибровочных

растворов как указано ниже.

№ про-

бирки

1

2

3
4

5

6

Основной

раствор

L-цистеи-

на, мл

1

2

4
6

8

10

Вода ди-

стиллиро-

ванная, мл

9

8

6

4

2

—

Активность

холинэстеразы

ME

1

 000

2000

4000

6000

8000

10000

мкмоль/

(с-л)

16,67

33,34
66,68

100,02
133,76

166,7