Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 51

5.2.9. Сорбитолдегидрогеназа

Сорбитолдегидрогеназа (L-идитол: NAD

 +

5-оксидоредуктаза; К. Ф. 1.1.1.14) фермент, ка-

тализирующий следующую обратимую реакцию:

СДГ

В человеческом организме фермент содер-

жится в основном в клетках печени.

Методы определения основаны на прямом оп-

тическом тесте или на образовании окрашенного

соединения фруктозы с резорцином — метод Се-

вела — Товарека. В методах определения актив-

ности СДГ, основанных на оптическом тесте,

используют обратную реакцию. Методы, исполь-

зующие эту реакцию, более чувствительные.

Оптимизация условий определения и унифи-

кации методов. Для определения активности

СДГ, основанного на UV-тесте, применяют сле-

дующие буферные растворы: фосфатный, триэ-

таноламиновый, трис-буфер. В трис-буфере ре-

а к ц и я протекает быстрее, чем в триэтанолами-

новом, однако в трис-буфере для насыщения

фермента требуется более высокая концентра-

ция фруктозы. Оптимум рН для СДГ 7.4 — 7,6.

В качестве унифицированного в 1974 г. утвер-

жден колориметрический метод Севела — Това-

река.

Метод по оптическому тесту. П р и н ц и п

Различие спектров поглощения окисленной и

восстановленной форм NAD при 340 им.

Р е а к т и в ы .  1 . Триэтаноламина гидрохло-

рид. 2. Натр едкий, 2 моль/л. 3, Триэтанолами-

новый буфер, 0,2 моль/л, рН 7,4: 37,2 г гидро-

хлорида триэтаноламина растворяют в воде, до-

водят рН до 7,4 2 моль/л раствором NaOH и до-

ливают водой до 1 л. Стабилен при комнатной

температуре. 4. Натрия карбонат кислый

(NaHCO

3

), 10 г/л. 5. Никотинамидаденинди-

нуклеотид восстановленный, динатриепая соль,

12 моль/л: 15 мг  N A D - Na

2

 растворяют в 1,5 мл

10 г/л раствора NaHCO

3

. Стабилен при 4 °С

1 нед. 6. D-Фруктоза, 4 моль/л: 72,0 г D-фрук-

тозы растворяют в воде и доводят водой до

100 мл. Раствор стабилен при 4 °С 4 нед.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр с термостатированной кюве-

той.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая сыворотка или плазма крови.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Предварительно

все растворы реактивов и сыворотку прогревают

до температуры измерения. Определение прово-

дят по следующей схеме:

Смешивают и измеряют экстинкцию при

340 или 365 нм в кювете с толщиной слоя 1 см

против воды в течение 5—8 мин через каждую

минуту.

Р а с ч е т производят по формуле:

В термостатиро-

ванную кювету

приливают

Триэтаноламино-

вый буфер

NAD- Na2, раствор

Сыворотка крови

Опытная

проба, мл

1,6

0,1

1,0

Конечная

концентрация

в пробе

Около 107

ммоль/л

0,4 ммоль/л

где Vр.с. — объем реакционной смеси; Vсыв —

объем сыворотки; t — время реакции, с; ^Е —

изменение экстинкции за 1 с; е — коэффициент

молярной экстинкции NADH в  м

2

- м о л ь

- 1

; / —

толщина слоя жидкости в кювете, м  ( 1 - 1 0 ~

2

) .

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Активность

в сыворотке крови здоровых людей низкая —

до 25 нмоль/(с-л), или до 1,5 ME.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент

вариации около 5 %. Если при 365 нм Л£> 0,03,

то сыворотку следует развести или уменьшить

интервалы измерения.

Л и т е р а т у р а . Bergmeyer H. U. (Hrsg.)

Methoden der enzymatischen Analyse. Wein-

heim: Verlag Chemie, 1974, S. 601—606.

Унифицированный метод по реакции с резор-

цином (метод/Севела — Товарека).  П р и н -

ц и п . Сорбитол под действием фермента сыво-

ротки в присутствии NAD превращается во

фруктозу, при реакции фруктозы с резорцином

образуется розово-красное окрашивание, интен-

сивность которого пропорциональна количеству

образовавшейся фруктозы.

Р е а к т и в ы . 1. Трис- (оксиметил) -аминоме-

тан. 2. НС1, 0,2 моль/л. 3. Трис-буфер, 0,05 моль/л,

рН 8,8: 70,5 мг триса растворяют в 2,5 мл воды,

прибавляют 0,4 мл 0,2 моль/л раствора HCI.

Доводят рН, доливают водой до 10 мл. Раствор

стабилен при хранении при комнатной темпера-

туре. 4. D-сорбитол, 0,5 моль/л раствор в

0,05 моль/л трис-буфере: 0,225 г D-сорбитола

растворяют в 2,5 мл 0,05 моль/л раствора трис-

буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при

хранении в холодильнике. 5. NAD, 0,006 моль/л:

25 мг NAD растворяют в 4,5 мл трис-буфера.

Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении

в холодильнике. 6. Трихлоруксусная кислота,

раствор 100 г/л. 7. Резорцин, 1 г/л раствор

в 96 % этаноле. 8. HCI, 30 % раствор. 9. НС1,

0,2 моль/л раствор. 10. Натрия хлорид, 154

ммоль/л. 11. D-фруктоза, калибровочный рас-

твор: 27 мг D-фруктозы растворяют в небольшом

количестве 154 ммоль/л раствора хлорида нат-

рия, переносят в мерную колбу вместимостью

100 мл и доводят объем до метки 154 ммоль/л

раствором хлорида натрия.

203

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

в центрифужную пробирку вносят 0,1 мл

0,5 моль/л раствора D-сорбитола и 0,3 мл сыво-

ротки, прогревают 5 мин  п р и 37 °С, затем добав-

ляют 0,2 мл 0,006 моль/л раствора NAD, предва-

рительно прогретого при 37 °С, и инкубируют

30 мин при 37 °С. Инкубацию прерывают добав-

лением 0,4 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной

кислоты. Центрифугируют. В чистую пробирку

вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл

раствора резорцина, 1,5 мл 30 % раствора НС1,

перемешивают и помещают в водяную баню при

80 °С точно на 8 мин, охлаждают. Возникающее

розово-красное окрашивание измеряют на ФЭКе

при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-

фильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против

холостой пробы. Холостую пробу ставят так же,

как опытную, но раствор трихлоруксусной кисло-

ты добавляют до инкубации.

Р а с ч е т активности  п о калибровочному

графику.

№

про-

бир-

ки

1

2

3

4

5

Калибровочный

раствор

D-фруктозы, мл

0,2 калибровочно-

го раствора, раз-

веденного в 10 раз

0,05

0,1

0,2

0,3

154

ммоль/л

раствор

NaCI, мл

0,1

0,25

0,2

0,2

—

Раствор

сорби-

тола, мл

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

Трис-

буфер,

мл

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Раствор

трихлор-

уксусной

кислоты, мл

0,4

0,4
0,4

0,4

0,4

Раствор

резор-

цина, мл

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

30%

раствор

HCI, мл

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0

Актив-

ность

сдг,

нмоль/

( с - л )

55,6

139

278

556

834

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а .  И з калибровочного раствора

D-фруктозы готовят ряд разведений с добавле-

нием реактивов, как указано ниже. Далее калиб-

ровочные пробы помещают в водяную баню при

80 °С на 8  м и н , охлаждают и измеряют при тех

же условиях, что и опытные пробы, против хо-

лостой пробы. В холостую пробу вместо калибро-

вочного раствора добавляют 154 ммоль/л рас-

твор хлорида натрия. Пересчет активности СДГ

на микромоли фруктозы на 1 л сыворотки за 1 с

инкубации при 37 °С производят по формуле:

активность СДГ,  н м о л ь / ( с - л ) =

С-1000-3300-2

180-3600

где С- 1000 количество D-фруктозы в калиб-

ровочной пробе, нг; 3300— коэффициент пере-

2

счета на 1 л сыворотки;

— коэффициент

пересчета на 1 с инкубации; 180— масса 1 мик-

ромоля D-фруктозы, мкг.

Л и н е й н а я зависимость сохраняется от 0 до

830 нмоль/(с  - л ) .

Н о р м а л  ь н ы с  в е л и ч и н ы :  д о

5,6  н м о л ь / ( с - л ) , или до 0,02  м к м о л ь / ( ч •  м л ) .

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты  в а р и а ц и и до 10 %.

Л и т е р а т у р а . Sevela M.,

V n i t r n i i e k , 1961, vol. 7, p. 1392.

Tovarek J.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . СДГ со-

держится главным образом в печени, поэтому

повышение активности в сыворотке крови специ-

фично для ее поражения. Однако из-за низкой

активности СДГ в сыворотке крови и недоста-

точной чувствительности метода определения

СДГ нормальное значение активности фермента

в сыворотке крови еще не говорит об отсутствии

поражения печени. Наиболее высокая актив-

204

ность фермента в сыворотке крови наблюдается

в первые дни острого гепатита и при обострении

хронического гепатита.

5.2.10. Уроканиназа

У человека уроканиназа содержится главным

образом в печени. Для определения ее актив-

ности в сыворотке крови пользуются спектрофо-

тометрическим методом, основанным на спектро-

фотометрическом определении концентрации

уроканиновой кислоты. В описанном методе ус-

ловия определения оптимизированы, метод уни-

фицирован.

Унифицированный спектрофотометрический

метод.  П р и н ц и п . Субстрат уроканиназы —

уроканиновая кислота — в щелочной среде име-

ет максимум поглощения при 277—280 нм. Ак-

тивность фермента определяют по убыли суб-

страта в процессе ферментативной реакции.

Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-

щенный безводный х. ч., 0,01 моль/л: 1,36 г

KHzPO

4

 растворяют в мерной колбе вместимо-

стью 1 л и доводят до метки водой. 2. Калия

фосфат двузамещенный, безводный х.ч.,

0,01 моль/л: 1,74 г К

2

НРО

4

 растворяют в мерной

колбе вместимостью 1 л и доводят до

метки водой. 3. Фосфатный буфер, 0,01 моль/л,

рН 7,2: к 0,01 моль/л раствору К

2

НРО

4

приливают порциями 0,01 моль/л раствор

КН

2

РО

4

 до получения рН 7,2. 4. Натр ед-

кий, 0,05 моль/л. 5. Уроканиновая кислота

2-водная, имп. 6. Основной калибровочный рас-

твор уроканиновой кислоты; 0,001 моль/л:

0,0087 г уроканиновой кислоты растворяют в

мерной колбе вместимостью 50 мл в 0,01 моль/л

фосфатном буфере. 7. Рабочий калибровочный

раствор уроканиновой кислоты. Готовят разве-

дением основного раствора в 20 раз раствором

0,05 моль/л NaOH; 1 мл рабочего калибровоч-

ного раствора содержит 0,05 мкмоля уроканино-

вой кислоты. В буфер и в раствор уроканиновой

кислоты в целях консервации добавляют 3—

4 капли хлороформа, после чего буферный рас-

твор можно хранить при комнатной температуре.

Раствор уроканата при хранении в холодиль-

нике без замораживания стабилен в течение

нескольких месяцев.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр с длиной волны 280 нм.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови. Фермент стабилен в течение

2—3 дней при 4 °С.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

0,35 мл фосфатного буфера смешивают с 0,1 мл

основного калибровочного раствора уроканино-

вой кислоты, затем добавляют 0,05 мл сыво-

ротки крови и инкубируют смесь 4 ч при 37 °С.

После инкубации в пробу сразу добавляют

2,5 мл 0,05 моль/л раствора NaOH для останов-

ки реакции. Холостую пробу № 1 ставят так же,

как опытную, но вместо 0,1 мл основного рас-

твора уроканиновой кислоты добавляют 0,1 мл

фосфатного буфера. Холостую пробу № 2 ставят

так же, как опытную, но 0,1 мл основного рас-

твора уроканиновой кислоты добавляют после

инкубации и сразу останавливают реакцию

0,05 моль/л раствором NaOH. После остановки

реакции измеряют оптическую плотность опыт-

ной пробы и холостой № 2 против холостой

пробы № 1 на спектрофотометре при длине

волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Р а с ч е т активности производят по калиб-

ровочному графику. При этом из величины

экстинкции холостой пробы № 2 вычитают вели-

чину молярной экстинкции опытной пробы.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Из рабочего калибровочного раст-

вора уроканиновой кислоты готовят ряд разве-

дений, как указано ниже.

Оптическую плотность проб измеряют против

холостой пробы тем же способом, что и при

определении активности фермента в сыворотке.

П е р е с ч е т активности уроканиназы  н а

микромоли разложившейся уроканиновой кис-

лоты на 1 л сыворотки за 1 мин производят

по формуле:

активность уроканиназы,  н м о л ь / ( с - л ) =

где С — количество разложившейся уроканино-

вой кислоты, нмоль (по калибровочному графи-

ку);  5 - 1 0

 5

 —коэффициент пересчета на 1 л

сыворотки крови; 14 400— коэффициент пере-

счета на 1 с инкубации.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У практи-

чески здоровых людей активность уроканиназы

в крови отсутствует.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации в среднем составляют 7—8 %.

С п е ц и ф и ч н о с т ь  м е т о д а . Уроканат

является единственным субстратом для урока-

ниназы, обладающей абсолютной субстратной

специфичностью.

Л и т е р а т у р а . Буробин В. А., Лихаче-

ва Н. В. В кн.: Унификация лабораторных мето-
дов исследования/Под ред. В. В. Меньшико-

ва.— М., 1980, с. 35—40; Буробин В. А., Лиха-

чева Н. В., Абгафорова Г. Е. Лаб. дело, 1978,

№ 11, с. 650—653; Tabor H., Mehler A. H.

Acad. Press. Soc., 1955, vol. 11, p. 228—233.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Урокани-

наза является органоспецифическим ферментом

печени. В 1963 г. С. Р. Мардашевым и В. А. Бу-

робиным впервые было обнаружено, что при

токсическом гепатите уроканиназа определяется

в крови. В дальнейшем многие исследователи

показали, что активность фермента обнаружи-

вается в крови при циррозе печени, хронических

гепатитах. Активность фермента в крови при

токсическом или вирусном гепатите достигает

величин 5—13  н м о л ь / ( с - л ) , или 0,3—0,8
мкмоль/(мин - л ) .

5.2.11. Щелочная фосфатаза,

изоферменты щелочной фосфатазы

Фосфатазы — ферменты, гидролизующие

эфиры фосфорной кислоты. В зависимости от

значения рН, при котором действует фермент,

различают щелочную и кислую фосфатазу.

Щелочная фосфатаза —-,ЩФ (фосфогидро-

лаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; К. Ф.

3.1.3.1) содержится практически во всех живот -

205

ных тканях; наиболее богаты ферментом печень,

костная ткань, кишечник, плацента. Щелочная

фосфатаза — негомогенный фермент; разли-

чают 5 тканево-специфических изоферментов

щелочной фосфатазы: плацентарный, костный,

печеночный, кишечный, почечный. Множествен-

ные формы щелочной фосфатазы обусловлены

как генетическими факторами, так и посттран-

сляционной модификацией. Для плацентарной

формы существуют отдельный генетический ло-

кус и аллельные варианты, которые не обнару-

живаются для других изоформ. Фракции щелоч-

ной фосфатазы различаются по своим каталити-

ческим свойствам, электрофоретической под-

вижности, устойчивости к тепловой инактива-

ции. Исследованием термоустойчивости (56 °С

10 мин или 65 °С 5 мин) изоферментов ЩФ из

различных тканей установлено, что при указан-

ных условиях плацентарная ЩФ устойчива к на-

греванию, костная фракция очень чувствитель-

на к теплу (85—90% инактивации); менее

чувствительна к теплу кишечная фракция (50—

65 % инактивации) и печеночная (50—75 %

инактивации).

Однако только по методу тепловой инакти-

вации судить об органной принадлежности ЩФ

невозможно. В норме при электрофорезе выяв-

ляется 1—2 фракции ЩФ в зоне а2-глобулинов.

При патологии количество изоферментов и их

расположение при электрофорезе могут менять-

ся. ЩФ образует комплексы с белками и липи-

дами.

Методы определения фосфатаз различаются

по используемому субстрату: р-глицерофосфат

натрия — метод Боданского; фенилфосфат нат-

рия — метод Кинга — Армстронга; п-нитрофе-

нилфосфат натрия — метод Бессея — Лоури —

Брока; кроме того, применяются субстраты —

нафтилсульфат, фенолфталеиндифосфат, фе-

нолфталеин монофосфат, тимол фталеинмоно-

фосфат. Ниболее специфичным и простым явля-

ется метод Бессея — Лоури — Брока, основан-

ный на ферментативном гидролизе п-нитро-

фенилфосфата, однако для получения правиль-

ных результатов важным в данном методе явля-

ется оптимизация условий определения. Во всех

методах субстратами служат однозамещенные

ортофосфата, дву- и трехзамещенные производ-

ные гидролизу щелочной фосфатазой не подвер-

гаются. Определение ЩФ с субстратом п-нитро-

фенилфосфатом проводится на биохимических

автоанализаторах различного принципа дей-

ствия.

Оптимизация условий определения и унифи-

кации методов. Во всех странах, где занимаются

стандартизацией методов, стандартизован метод

с субстратом п-нитрофенилфосфатом, однако

условия измерения предложены различные.

п-Нитрофенилфосфат легко гидролизуется, дает

минимальные различия для изоферментов ЩФ

в оптимизированной концентрации и с образова-

нием хромогена при гидролизе субстрата, что

дает возможность осуществлять кинетическое

измерение. Высокое значение молярного погло-

щения п-нитрофенилфосфата делает этот метод

достаточно чувствительным. Для оптимизации

методов определения ЩФ большое значение
206

имело применение так называемых трансформи-

рующих буферов.

Наиболее приемлемыми являются два тран-

сформирующих буфера: 2-амино-2-метил-1-про-

паноловый и диэтаноламиновый. В пропаноло-

вом буфере различия по отношению к изофер-

ментам менее выражены и степень чистоты его

более приемлемая, чем для диэтанол-аминового

буфера. В пропаноловом буфере п-нитрофенил-

фосфат более стабилен. Диэтаноламиновый

буфер требует высокой степени очистки, так как

содержит ингибиторы ЩФ. В наборах реакти-

вов «Лахема» (ЧССР) предложен новый буфер

D-N-метилглюкамин. К трансформирующим бу-

ферам относится М-(2-оксиэтил)-этилендиамин-

тетрауксусная кислота (НЭДТА). Этот буфер

содержит ионы цинка и магния, которые необхо-

димы для работы фермента. Данный буфер

и субстрат п-нитрофенилфосфат используются

в оптимизированном референтном методе опре-

деления активности ЩФ, разработанном Меж-

дународной Федерацией клинической химии. За

последние годы за счет оптимизации условий

измерения достигнуты значительные улучшения

аналитических качеств методов определения ак-

тивности ЩФ. В СССР в качестве унифициро-

ванных в 1972 г. утверждены два метода с суб-

стратом — (3-глицерофосфатом и п-нитрофенил-

фосфатом.

Унифицированный метод по гидролизу п-нит-

рофенилфосфата.  П р и н ц и п . Субстрат п-нит-

рофенилфосфат натрия гидролизуется с образо-

ванием п-нитрофенола, дающего в щелочной

среде желтое окрашивание.

Р е а к т и в ы . 1. п-Нитрофениловый эфир

фосфорной кислоты динатриевая соль ч. д. а.

2. НС1, 0,001 моль/л. 3. п-Нитрофенилфосфат

натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора

НС1: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в

мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают

до метки 0,001 моль/л раствором НС1. В связи

с тем, что в продаже чаще имеется бариевая

соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в нат-

риевую соль осуществляется следующим спосо-

бом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария,

соответствующей получению 9 г/л раствора и по-

мещенной в фарфоровую ступку, добавляют не-

большими количествами 0,001 моль/л раствор

НС1 в процессе растирания соли в ступке в тече-

ние 10 мин. Добавлением насыщенного раствора

сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора)

бариевую соль переводят в натриевую. Через

5 мин полученный раствор п-нитрофенилфос-

фата натрия фильтруют в делительную воронку,

где затем взбалтывают с равным объемом водо-

насыщенного бутилового спирта. После разделе-

ния слоев жидкости в делительной воронке

(вверху — бутанол, внизу — постепенно обес-

цвечивающийся субстратный раствор) бутанол

выливают, а субстратной раствор подвергают

описанной выше процедуре очистки еще 2—3 ра-

за, пока он не станет совершенно бесцветным.

После бутанола производят экстракцию водона-

сыщенным эфиром 1—2 раза. Реактив не дол-

жен содержать свободного п-нитрофенола, от-

сутствие которого в субстратном растворе про-

веряется следующей пробой: к 1 мл субстратного