Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 50

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации составляют 5—6 %.

Л и т е р а т у р а . Bergmeyer H. U. (Hrsg.)

Methoden der enzyrnalischen Analyse. Bd. 1.—

Weinheim: Verlag Chemie, 1974, S. 607—612.

Унифицированный метод по реакции с 2,4-ди-

нитрофенилгидразином (Севела — Товарека).

П р и н ц и п . L-Лактат под действием фермента

сыворотки в присутствии NAD окисляется в

пируват, который определяется по цветной

реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Р е а к т и в ы . 1. Молочная кислота 80%

ч.д.а., х.ч. 2. Натрия гидроокись ч.д.а., х.ч.,

растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л. 3. 0,45 моль/л

раствор лактата натрия. В мерную колбу вмести-

мостью 100 мл вносят 5 мл 80 % молочной

кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого

натра до получения рН 7,5 и доводят объем

водой до метки. Хранят в посуде из темного

стекла в холодильнике. 4. Натрия фосфат пиро

(Na

4

P

2

O7-10 Н

2

О) ч.д.а. 5. НС1 1 моль/л.

6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8:

6,69 г натрия пирофосфата растворяют в неболь-

шом количестве воды, добавляют 1 моль/л

раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят

объем водой до 500 мл. Стабилен в течение

месяца при хранении в холодильнике. 7. NAD

окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг

NAD на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение

4 нед при хранении в холодильнике. 8. Раствор

2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-ди-

нитрофенилгидразина растворяют в небольшом

количестве 1 моль/л раствора НС1 при нагре-

вании на водяной бане. После охлаждения до-

водят объем 1 моль/л раствором НС1 до 100 мл.

На следующий день реактив фильтруют. Раст-

вор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен

в течение 1 года. 9. Пируват натрия (для по-

строения калибровочной кривой): 11 мг кристал-

лического пирувата натрия растворяют в не-

большом количестве бидистиллированной воды,

переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл

и доводят водой объем раствора до метки;

1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноград-

ной кислоты. Рабочий раствор готовят разведе-

нием основного раствора в 10 раз бидистиллиро-

ванной водой; 1 мл рабочего раствора содержит

8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают

с 0,3 мл раствора NAD, прогревают 5 мин при

37 "С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л

раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл

0,45 моль/л раствора лактата натрия, предвари-

тельно прогретых при 37 °С, и инкубируют смесь

при 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкуба-

ции добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитро-

фенилгидразина, выдерживают 20 мин при

комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл

0,4 моль/л раствора едкого натра, перемеши-

вают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в

кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны

500—560 нм (зеленый светофильтр) против

холостой пробы. Холостую пробу ставят, как

опытную, но сыворотку добавляют после инку-

бации.

Р а с ч е т активности производят по кали-

бровочному графику.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о  г р а -

ф и к а : из рабочего калибровочного раствора

пирувата натрия готовят ряд разведений, как

указано в таблице. Затем в пробирки прили-

вают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидра-

зина. Далее калибровочные пробы обрабаты-

вают и измеряют, как опытные. Холостую пробу

ставят так же, как калибровочную, но вместо

калибровочного раствора добавляют воду.

Линейная зависимость между концентрацией

пировиноградной кислоты и оптической плот-

ностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с • л).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 220—1100

нмоль/(с • л), или 0,8—4,0мкмоль/(ч • мл) при

37

 °С.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент

вариации около 10 %.

Л и т е р а т у р а . Seuela M., Tovarek J.

Cas. Lek Cesk., 1959, vol. 98, N 27, p. 844.

Электрофоретическое разделение изофер-

ментов ЛДГ на пленках из ацетата целлюлозы.

П р и н ц и п . Изоферменты ЛДГ разделяются

путем электрофореза на пленке из ацетата цел-

люлозы при рН 8,6. Затем пленка инкубируется

на слое геля, содержащего субстратную смесь;

при этом места расположения полос изофермен-

тов прокрашиваются в синий цвет формазаном

в результате следующей реакции:

NADH + НСТ—

I

(нитросиний тетразолий)

Оптимум рН инкубационной среды лежит

в области 8,0—8,3. Реакция ускоряется в при-

сутствии феназина метасульфата.

Р е а к т и в ы . 1. Буфер для электрофореза:

а) 1,84 г 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты (веро-

нала) и 10,3 г натриевой соли 5,5-диэтилбарби-

туровой кислоты (мединала) растворяют в 1 л

воды, рН 8,6; б) 3,025 г трис-(оксиметил)-

аминометана растворяют в 700 мл воды в мерной

199

колбе, концентрированной HCI, доводят до

рН 8,6 и доливают водой до метки. Растворы

«а» и «б» смешивают в равных пропорциях.

2. Буфер для приготовления агара: 24,2 г трис-

(оксиметил)-аминометана растворяют в 700 мл

воды, доводят рН до 8,3 прибавлением кон-

центрированной HCI и доливают водой до метки.

3. Буфер для растворения субстратной смеси,

рН 8,3: 2,42 г трис-(оксиметил)-аминометана

и 1,41 г однозамещенного фосфата калия

(КН

2

Ро

4

) растворяют в 100 мл воды, рН 8,3.

4. Агар Дифко. 5. Лития лактат ч.д.а., х.ч.

6. Тетразолевый п-нитросиний (нитросиний

тетразолий, НСТ) ч.д.а. 7. Метилфеназоний

метасульфат (феназина метасульфат ФМС) ч.

8. Никотинамидадениндинуклеотид окисленный

( N A D ) . 9. Уксусная кислота, 5 % раствор.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е .  1 . Ап-

парат для электрофореза на пленках из ацетата

целлюлозы. Может быть использован аппарат

ЭПАУ-20-50 отечественного производства. 2. Аце-

татцеллюлозная пленка ТУ-6-05-1696-74 г.

3. Денситометр.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Приготовление

агара: 1 г агара Дифко растворяют при нагре-

вании в 50 мл буфера № 2, затем охлаждают

до 65—70 "С. Субстратную смесь 264 мг лактата

лития, 4 мг НСТ, 20 мг NAD и 0,4 мг ФМС (4 мг

ФМС растворяют в 1 мл субстратного буфера

и берут 0,4 мл) растворяют при  п о м е ш и в а н и и

в 10 мл субстратного буфера; беречь от света.

10 мл охлажденного до 65 °С раствора агара

осторожно смешивают с приготовленной суб-

стратной смесью, избегая образования пузырь-

ков. Полученный гель наливают ровным слоем

толщиной около 2 мл на стекло или в какую-

либо подходящую емкость. Помещают гель в

темное место при комнатной температуре и

накрывают крышкой, следя за тем, чтобы капли

влаги не оседали на его поверхности.

П р о в е д е н и е э л е к т р о ф о р е з а. За-

ливают в камеру прибора примерно 90 мл

охлажденного до 4 °С буфера для электрофоре-

за. С заранее замоченной в этом буфере ацетат-

целлюлозной пленки удаляют избыток влаги

фильтровальной бумагой и закрепляют пленку

в предназначенной для этого рамке (см. инструк-

цию к  а п п а р а т у ЭПАУ-20-50). Наносят на по-

верхность пленки образцы сыворотки в коли-

честве около 1,5 мкл с помощью аппликатора

(2  а п п л и к а ц и и ) . Помещают рамку с пленкой

в камеру, закрывают камеру крышкой и вклю-

чают ток. Электрофорез проводят в течение

25 мин при  н а п р я ж е н и и 150 В (сила тока

3—5  м А ) . Выключают ток, снимают пленку

с рамки и помещают (предварительно обрезав

влажные концы пленки) на слой геля. К гелю

должна прилегать поверхность пленки, на кото-

рую нанесены образцы. Следует избегать обра-

зования воздушных пузырьков. Помещают гель

с пленкой в термостат на 30 мин при темпера-

туре 37 °С. После  о к р а ш и в а н и я пленку отмы-

вают в растворе 5 % уксусной кислоты примерно

в течение 3 мин и высушивают между листами

фильтровальной бумаги в термостате или при

комнатной температуре. Пленка должна быть в

расправленном виде. Денситометрируют при

длине волны 575—600 нм.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Соотноше-

ние фракций ЛДГ, по  д а н н ы м различных авто-

ров, составляет: ЛДГ

1

 — 19—29 %, ЛДГ

2

 —

23-37 %; ЛДГз - 17-25 %; ЛДГ

4

 - 8-

17 %; ЛДГ

5

-8-18%.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации для различных изоферментов от

10 до 15%.

Л и т е р а т у р а . Михайлов Ю. Е., Шишло

Л. А. Лаб. дело, 1983, № 10, с. 23—26; Маг-

kert С. L., Moller F. Proc. nat. Acad. Sci.,

1959,  v o l . 45, p. 753—763; Oplier A. «/., Collier

C. S., Miller J. M.  C l i n . Chem., 1966, vol. 12,

N 5, p. 308—313.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Актив-

ность ЛДГ в сыворотке крови повышается при

повреждениях миокарда, лейкозах, почечных за-

болеваниях, тромбоцитопениях, инфекционном

мононуклеозе, повреждениях  п а р е н х и м ы печени,

опухолях, прогрессивной мышечной дистрофии.

При инфаркте миокарда активность фермента

в сыворотке крови достигает  м а к с и м у м а через

24—36 ч и приходит к норме медленнее (на

8—10-й день), чем активность КК и АсАТ.

Однако из-за отсутствия органной специ-

фичности диагностическая значимость опреде-

л е н и я общей активности ЛДГ ниже, чем ее

изоферментов. Изофермент ЛДГ, обладающий

наибольшей электрофоретической подвижно-

стью (ЛДГ|), локализуется преимущественно в

ткани сердца. Увеличение активности этого

изофермента в сыворотке крови характерно

главным образом для поражения сердца. При

инфаркте миокарда в большей степени увеличи-

вается активность ЛДГ| по сравнению с общей

ЛДГ. В скелетных  м ы ш ц а х , печени преобладает

медленно движущийся изофермент ЛДГ (ЛДГ

5

),

При остром гепатите резко возрастает актив-

ность ЛДГз и ЛДГ

4

 и уменьшается активность

ЛДГ

1

 и ЛДГ

2

. При циррозе печени сдвиг в

изоферментном спектре ЛДГ также происходит

в сторону ЛДГ

5

. При холецистите активность

ЛДГз увеличивается незначительно. При остром

лейкозе в сыворотке крови увеличивается актив-

ность ЛДГ

2

 и ЛДГз, причем степень увеличения

зависит от количества незрелых клеток. В опухо-

левых тканях преобладают изоферменты ЛДГ

4

и ЛДГ

5

, однако определенной корреляции

между ростом опухоли и изменением спектра

ЛДГ в сыворотке крови определить не удалось.

5.2.8. Липаза

Панкреатическая липаза (триацилглицерол-

ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.3) относится к группе

эстераз, гидролизует в  ж и р а х внешние, эфирные

связи с освобождением  ж и р н ы х кислот.

200

Фермент секретируется поджелудочной железой

и в большом количестве содержится в дуоде-

нальном содержимом. В сыворотке крови актив-

ность фермента низкая. Липаза представляет

собой гликопротеид, по данным некоторых

авторов, может существовать в виде двух

изоформ. Помимо панкреатической липазы, в

сыворотке крови содержатся и другие липазы,

например липопротеиновая липаза. Липаза

является термолабильным ферментом и при

37 °С частично инактивируется.

Методы определения активности липазы от-

личаются по используемому субстрату, буферу,

по технике исполнения и основаны главным

образом на определении количества освободив-

шихся под действием фермента  ж и р н ы х кислот.

В качестве субстратов наиболее часто приме-

няются: оливковое масло, трибутирин, 2-нафтил-

меристат, твин-80, триолеин, а-нафтиллаурат,

фениллаурат и др. За исключением триглице-

ридов (оливковое масло, триолеин), другие

субстраты подвергаются гидролизу под действи-

ем неспецифических эстераз, что снижает специ-

фичность методов, использующих эти субстраты.

Оливковое масло способно образовывать тонко-

дисперсную стабильную эмульсию.

Первый метод определения активности липа-

зы с применением оливкового масла в качестве

субстрата был описан в 1932 г. Впоследствии

метод подвергался многочисленным модифика-

циям. По способу оценки результатов фермента-

тивной реакции методы могут быть титро-

метрические, фотометрические, турбидиметриче-

ские, сталагмометрические, манометрические.

Большинство методов относится к титрометри-

ческим, основанным на титровании жирных
кислот, освобождающихся в результате фер-

ментативного гидролиза.

Методы этой группы недостаточно точны,

так как очень трудно установить конечную

точку титрования в масляной эмульсии. При

титровании эмульсия оливкового масла должна

быть гомогенной, в противном случае получен-

ные результаты будут неправильными.

Колориметрические методы более точные, но

связаны с введением в реакцию ряда дополни-

тельных реактивов. Турбидиметрические методы

основаны на измерении величины уменьшения

оптической плотности стабильной эмульсии

оливкового масла под действием липазы. Ста-

лагмометрические методы используют поверхно-

стные свойства  ж и р н ы х кислот, что позволяет

только условно судить об активности фермента.

Манометрические методы очень сложны и трудо-

емки. Принцип их основан на измерении объема

угольной кислоты, которая вытесняется из би-

карбонатного буфера жирными кислотами.

Оливковое масло или триолеин как субстраты

используются в методах, предлагаемых в ка-

честве стандартных в США, а также в боль-

шинстве наборов реактивов для определения

активности липазы, в частности, в наборах

реактивов фирмы «Harleco» (США), «Boehrin-

ger Mannheim» (ФРГ), амилазно-липазном ана-

лизаторе модели  « P e r k i n - E l m e r 91» (США) с

прилагаемым набором реактивов. Описаны

фотометрические методы, основанные на выде-

лении жирных кислот в виде медных солей,

которые определяются по реакции с диэтилди-

тиокарбаминатом.

Оптимизация условий определения и уни-

фикация методов. Оптимум рН для липазы

8,8—9,0. Липаза поджелудочной железы водо-

растворима, и ее липолитическое действие про-

является на поверхности жировых гранул.

Поэтому эмульсия масла должна быть тща-

тельно приготовлена. В качестве эмульгатора

чаще применяют дезоксихолат натрия; опти-

мальная концентрация 3,5 г/л. Липазу акти-

визируют желчные кислоты, ионы кальция,

колипаза. Кроме того, желчные кислоты, так

иге как и дезоксихолат натрия, уменьшают по-

верхностное натяжение, что приводит к образо-

ванию эмульсий и увеличению контакта между

ж и р а м и и липазой.

Свободные жирные кислоты, образующиеся

в результате ферментативной реакции, инги-

бируют липазу. Связывание жирных кислот

ионами кальция с образованием нерастворимых

соединений является причиной активации  л и п а

зы в присутствии ионов кальция.

Колипаза, представляющая собой белок,

образует с желчными кислотами и  л и п а з о й

комплекс, который обладает большим сродством

к субстрату по сравнению со свободной  л и п а -

зой. При применении в качестве субстрата

эмульсии оливкового масла реакция нулевого

порядка протекает в течение короткого интерва-

ла времени (от 4 до 12  м и н ) . В СССР реко-

мендован в качестве унифицированного тур-

бидиметрический метод с оливковым маслом

в качестве субстрата. В методах определения

активности липазы сложным является стан-

дартизация единиц активности. Изменение

мутности пропорционально освобождению жир-

ных кислот, но оно варьирует при измерении

на разных фотометрах. Поэтому абсорбционные

единицы нежелательно употреблять для измере-

ния липазной активности. При разрушении

1 мкмоля оливкового масла освобождается

2 мкмоля жирных кислот. Поэтому возможны

два способа выражения активности: в микро-

молях разрушенного под действием липазы сы-

воротки крови оливкового масла или триолеина

или в микромолях освобожденных жирных

кислот. Однако калибровать турбидиметриче-

ские методы сложно, так как рассеяние света

меняется с концентрацией нелинейно.

Унифицированный метод с использованием

оливкового масла в качестве субстрата.  П р и н -

ц и п . Спектрофотометрическое измерение изме-

нения мутности суспензии оливкового масла

под действием липазы. Активность фермента

пропорциональна количеству гидролизованного

оливкового масла или количеству жирных кис-

лот, образующихся при гидролизе.

Р е а к т и в ы . 1. Оливковое масло, мол. мас-

са 880 (сред.). 2. Алюминия окись хромато-

графически чистая (для очистки оливкового

масла). Очистка оливкового масла: в колбу

вместимостью 50 мл помещают 25 мл оливко-

вого масла и добавляют 5 г окиси алюминия,

ставят на 1 ч на аппарат для встряхивания

жидкости в сосудах. Затем оливковое масло

201

переливают в центрифужные пробирки и центри-

фугируют 30 мин при 5000 об/мин. Оливковое

масло сливают с осадка и пропускают через

плотный бумажный фильтр (с синей полосой) на

воронке Бюхнера. 3. Меди сульфат 5-водный

(CuSO

4

 • 5Н

2

O) для получения абсолютного

спирта. 4. Этиловый спирт абсолютный. Для

абсолютирования этилового спирта применяют

безводный сульфат меди (сульфат меди) белого

цвета. Безводный сульфат меди получают про-

сушиванием CuSO

4

 • 5НгО при температуре

120°С в сушильном шкафу при периодическом

перемешивании. Безводный сульфат меди (охла-

жденный) заливают 96 % этиловым спиртом.

Тщательно перемешивают и оставляют стоять

3—4 дня, ежедневно перемешивая. Кристаллы

сульфата меди приобретают синий цвет. Затем

спирт сливают и засыпают в него новую порцию

сульфата меди. Операцию продолжают до тех

пор, пока цвет кристаллов не будет меняться.

Спирт сливают и фильтруют. 5. Основной раст-

вор оливкового масла, 0,011 моль/л. В колбу

с притертой пробкой наливают 100 мл абсолют-

ного спирта, пипетку с 1,1 мл очищенного олив-

кового масла помещают в колбу так, чтобы

конец ее находился близко к поверхности спирта,

но не касался ее. Держа пипетку в таком поло-

жении, непрерывно вращают колбу круговыми

движениями до тех пор, пока оливковое масло

не вытечет из пипетки. Затем колбу ставят на

1 ч на аппарат для встряхивания жидкости.

Хранят при комнатной температуре. 6. Рабочая

эмульсия оливкового масла, 0,00017 моль/л, или

170 мкмоль/л: 1,5 мл основного раствора олив-

кового масла медленно добавляют к 100 мл

буфера рН 8,8. При этом кончик пипетки держат

под поверхностью эмульсии. Реактив стабилен

при хранении в холодильнике в течение 2 нед.

7. Трис-(оксиметил)-аминометан. 8. Дезоксихо-

левой кислоты натриевая соль. 9. НС1 концен-

трированная. 10. Буфер, содержащий трис,

0,025 моль/л и натриевую соль дезоксихолевой

кислоты, 0,014 моль/л, рН 8,8: 0,3 г триса и

0,6 г дезоксихолата натрия растворяют в 40—

60 мл воды, доводят рН до 8,8 концентрирован-

ной НС1 (3—8 капель) и доливают водой в

мерной колбе до 100' мл. Реактив стабилен при

хранении в холодильнике в течение 2 нед.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр с термостатированной кюветой.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка, свободная от гемолиза, или плазма

крови. Активность липазы сохраняется в тече-

ние 7 дней при хранении сыворотки в холо-

дильнике.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определени-

ем сыворотку и реактивы прогревают до темпе-

ратуры измерения. В кювету приливают 3 мл

рабочей эмульсии оливкового масла, добавляют

0,1 мл сыворотки, смешивают (без встряхива-

ния) и ставят в термостат при 30 или 37 °С,

через 2 мин измеряют экстинкцию (Ei) против

воды или воздуха при длине волны 340 нм

в кювете с толщиной слоя 1 см, затем кювету

снова помещают в термостат при той же темпе-

ратуре и через 5 мин измеряют экстинкцию

(Е

2

), рассчитывают ЛЕ за 1 мин.

202

Р а с ч е т  а к т и в н о с т и . Для расчета

активности липазы можно использовать кон-

трольную сыворотку с известной активностью

липазы. Активность липазы в контрольной сы-

воротке определяют так же, как в исследуемой.

Расчет производят по формуле:

где Еоп — изменение величины экстинкции

опытной пробы за 1 мин; ДЕоп = Е

1 а и

 — Е

2оп

за 1 мин; ДЕ

к

 — изменение величины экстинк-

ции в контрольной сыворотке за минуту, ДЕ

к

 =

= Е1

к

 — Е

2к

 за 1 мин; С

к

 — активность липазы

в контрольной сыворотке, ME. Расчет в мкмолях

разрушенного оливкового масла ведут по фор-

муле:

где ДЕоп — изменение экстинкции опытной про-

бы за 1 мин; 170 — концентрация оливкового

масла в рабочей эмульсии (мкмоль/л), при

которой экстинкция равна приблизительно 1;

Ек — экстинкция рабочей эмульсии оливкового

коэффициент пересчета на 1 л сыворотки.

Линейная зависимость сохраняется до 204

мкмоль/л оливкового масла. 16,67—коэффи-

циент пересчета в нмоль/(с • л).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 0—470

нмоль/(с • л), или 0—28 мкмоль/(мин • л).

П р и м е ч а н и е . Нормальные величины

следует проверять в каждой лаборатории.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации составляют 10—15 %.

Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. П., Бори-

сенкоЛ. М., Стародворцева В. Г. В кн.: Унифи-

кация лабораторных методов исследова-

ния/Под ред. В. В. Меньшикова.— М., 1980,

с. 41—49; Огнев Ю. В., Шабанова Т. К. Лаб. де-

ло, 1978, № 7, с. 424—427; Shihabi L. К.,

Bishop С. Clin. chem., 1971, vol. 17, p. 1150.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . В сыворот-

ке здоровых людей активность липазы очень

низкая, при остром панкреатите активность фер-

мента может увеличиться до 200 раз по сравне-

нию с нормой. Активность липазы в крови быст-

ро увеличивается в течение нескольких часов

после приступа панкреатита, достигая максиму-

ма через 12—24 ч, и остается повышенной в те-

чение 10—12 дней, т. е. более продолжительное

время, чем а-амилаза. В моче активность липа-

зы не обнаруживается. В дуоденальном содер-

жимом липазу рекомендуется определять после

стимуляции секретином и панкреозимином.