Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 49

ческая анемия. При массовых обследованиях

населения на выявление дефицита Г-6-ФД

учитываются резко положительные и положи-

тельные результаты анализов.

5.2.6. Креатинкиназа

Креатинкиназа (КК) (АТФ: креатин М-фос-

фотрансфераза; К.Ф. 2.7.3.2) катализирует

обратимую реакцию фосфорилирования креа-

тина.

КК человека состоит из двух субъединиц —

М, В, которые образуют три формы изофермен-

тов. ММ-фракция — мышечный тип; МВ-фрак-

ция — сердечный тип и ВВ-фракция — мозго-

вой тип.

Методы определения активности КК исполь-

зуют оба направления катализируемой реакции

с определением образующихся соединений.

Образующийся в данной реакции креатин

может быть определен фотометрически по реак-

ции с а-нафтолом, флуорометрически — по

реакции с нингидрином, а также может быть

использован как субстрат в непрямом опти-

ческом тесте.

Реакция с субстратом креатинфосфатом

более чувствительна, чем с креатином, и ее

используют чаще для определения активнос-

ти

 КК.

Методы, основанные на оптическом тесте,

точные, однако без готовых наборов реактивов

постановка их трудоемка и требует наличия

чистых кристаллических ферментов. Более

простыми являются фотометрические методы,

основанные на определении неорганического

фосфора, освобожденного в результате гидроли-

за креатинфосфата. Большинство коммерческих

наборов реактивов основано на оптическом

тесте. Результаты, получаемые с помощью набо-

ров реактивов, выпускаемых различными фир-

мами, как правило, не дают сопоставимых

результатов исследования, что связано с раз-

личными условиями определения.

Оптимизация условий определения и унифи-

кация методов. В большинстве стран в каче-

стве стандартного предложен метод, основан-

ный на оптическом тесте по обратной реакции.

Однако национальные различия касаются вида

буфера, активатора, концентрации реактивов,

температуры определения. На активность фер-

мента в значительной степени влияют исполь-

зуемые в качестве активаторов различные тиоло-

вые соединения. В качестве унифицированного

в нашей стране принят метод по определению

фосфора.

Унифицированный метод с использованием

креатина в качестве субстрата.  П р и н ц и п .

Активность фермента пропорциональна количе-

ству неорганического фосфора, образующегося

в результате кислотного гидролиза синтезиро-

ванного ферментом креатинфосфата. Неоргани-

ческий фосфор определяется по цветной реакции

с молибдатом аммония.

Р е а к т и в ы . 1. Аденозин-5 -трифосфорной

кислоты динатриевая соль. 2. L-Цистеин,

0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды.

Готовят раствор перед употреблением. На одну

пробу требуется 0,1 мл. 3. Креатин. 4. Магния

сульфат 7-водный, ч.д.а. 5. Аммоний молибде-

новокислый 4-водный х.ч., 0,02 моль/л: 2,5 г

молибденовокислого аммония растворяют в

мерной колбе в 70—80 мл воды и доводят

объем до 100 мл водой. 6. Натрия сульфат

безводный ч.д.а. 7. Натрий сернистокислый

пиро (метабисульфит натрия) ч.д.а. 8. 1-Амино-

2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген) ч.д.а.

9. Серная кислота, 2,5 моль/л. 10. НС1, 0,1 моль/л.

1 1 . Трис-(оксиметил)-аминометан (трис), ч.д.а.

12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г

трис растворяют в мерной колбе вместимостью

100 мл в 50—60 мл воды, устанавливают рН

буфера 0,1 моль/л раствором HCI и доводят

водой до метки. 13. Раствор эйконогена: 15,36 г

пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернисто-

кислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют

в 70—80 мл воды, взбалтывают, доводят объем

водой в мерной колбе до 100 мл и дважды

фильтруют (через 2 ч и через сутки после

приготовления). Раствор следует беречь от

яркого света; в случае выпадения осадка вновь

фильтруют. Стабилен в течение 1 мес при хра-

195

н е н и и в холодильнике. 14. Основная смесь

реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата

магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л

АТФ: 0,4920 г сульфата  м а г н и я , 0,4326 г

креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70—80 мл

трис-буфера (для полного растворения креатина

смесь нагревают в течение 5—10 мин на водяной

бане  п р и 40—45 °С). Затем объем основной

смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной

колбе до 100 мл. 15. Трихлоруксусная кислота

ч.д.а., 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50—

60 мл воды и объем раствора доводят в мерной

колбе до 100 мл. 16. Смесь растворов для

проведения кислотного гидролиза креатинфос-

фата. Смесь готовят перед употреблением,

учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл.

Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибдено-

вокислого  а м м о н и я , 0,25 мл раствора серной

кислоты и 1,5 мл воды (соотношение  1 : 1 : 6 ) .

17. Калия фосфат однозамещенный безводный

х.ч. (для приготовления калибровочного раство-

ра): 0,0169 г КН

2

РО

4

 растворяют в воде и объем

раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Фо-

тоэлектроколориметр.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я . Све-

жая сыворотка или плазма крови. При хране-

нии в холодильнике и при комнатной температу-

ре активность фермента падает.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Предварительно

все растворы реактивов прогревают в течение

5 мин при 37 °С. Опытная проба: в пробирку

вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл

раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.

Содержимое пробирки осторожно перемеши-

вают и ставят в термостат при 37 °С на 30 мин.

Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлор-

уксусной кислоты, перемешивают стеклянной

палочкой и центрифугируют при 3000 об/мин

в течение К) мин. Холостую пробу ставят так же,

как опытную, но сыворотку добавляют после

прибавления раствора трихлоруксусной кисло-

ты. Из опытной и холостой проб забирают по

1 мл надосадочной жидкости и переносят в  х и м и -

ческие пробирки (маркированные соответствую-

щим образом), в которых содержится по 2 мл

смеси растворов для проведения специфического

гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь

растворов перемешивают и оставляют при ком-

натной температуре на 30 мин (время гидролиза

креатинфосфата). После этого в пробы добавля-

ют с интервалом 1  м и н по 0,25 мл раствора

эйконогена и точно через 15  м и н опытную пробу

измеряют против холостой пробы при длине

волны 600—700 нм (красный светофильтр) в

кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Р а с ч е т производят по калибровочному

графику. Построение калибровочного графика;

готовят калибровочные пробы, как указано ниже.

Из каждого калибровочного раствора берут

по 0,4 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

В холостую пробу вместо калибровочных раство-

ров берут по 0,4 мл воды.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  д о 100

нмоль/л(с • л), или до 6 ME.

Активность изоферментов КК в сыворотке

крови у здоровых лиц колеблется в значитель-

№ про-

бирки

1

2
3

4
5

Кали-

бровоч-

ный ра-

створ,

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Дистилли-

рованная

вода, мл

14,4

7,7
5,13

2,85

2,08

Коли-

чество

фосфо-

ра в

пробе,

мкг

1

2
3

4

5

Актив-

ность КК,

нмоль/

( с - л )

45

90

135

180

225

ных пределах, и точных данных установить не

удалось. Активность ММ-фракции составляет

более 90 %, а КК MB — менее 2 % от общей

активности КК.

П р и м е ч а н и е . Если активность  К К

превышает 500  н м о л ь / ( с - л ) , то время

инкубации сокращают до 15 или 10  м и н ;

полученные величины активности умножают

соответственно на 2 или 3. Разбавлять сы-

воротку не рекомендуется, так как актив-

ность фермента при разведении сыворотки

изменяется непропорционально.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент

вариации составляет в среднем 10 %.

Л и т е р а т у р а . Ертанов И. Д., Борисен-

коЛ. М., Делекторская Л. Н. В кн.: Унификация

лабораторных методов исследования / Под ред.

В. В. Меньшикова.— М., 1980, с. 16---28; Левин

Ф. Б., Березов Т. Т., Кушниренко Е. А. Лаб.

дело, 1973, № 4, с. 229—231; Kuby S., Noda L.,

Lardy H. A. J.  h i o l . Chern., 1954, vol. 209, p. 191.

Метод с использованием креатинфосфата в

качестве субстрата.  П р и н ц и п . Активность

фермента пропорциональна количеству креати-

на, образующегося в результате ферментатив-

ной реакции. Креатин определяется но цветной

реакции с а-нафтолом.

Р е а к т и в ы .  1 . Трис-(оксиметил)-аминоме-

тан (трис) х.ч. 2. Магния сульфат ч.д.а., х.ч.

3. Трис-буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4, содержа-

щий 0,015 моль/л Mg

+2

 (в виде MgSO

4

):

1,21 г триса и 0,180 г MgSO

4

 помещают в

мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают

водой до метки. Раствор стабилен в течение

месяца при хранении в холодильнике. 4. Креа-

тинфосфат, динатриевая соль, 0,012 моль/л,

рН 7,4: растворяют 0,044 г креатинфосфата в

10 мл воды. Раствор стабилен в течение недели

при  х р а н е н и и в холодильнике. 5. Аденозин-

5-дифосфорной кислоты натриевая соль, 0,004

моль/л, рН 7,4: 0,017 г аденозиндифосфата

натрия (мол. м. 449) растворяют в 10 мл воды.

Раствор стабилен в течение недели при хранении
в холодильнике. 6. Бария гидроокись 8-водная

ч.д.а. или х.ч., 50 г/л: 5 г безводной гидро-

окиси бария или 8 г 8-водной гидроокиси бария

помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл

и доливают до метки водой, не содержащей

196

СО

2

. 7. Цинка сульфат ч. д. а., х.ч., раствор

50 г/л: 5 г сульфата цинка помещают в мерную

колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки

водой, не содержащей СО2. 8. а-Нафтол (1 -наф-

тол) ч.Д.а. 9. Натрия карбонат ч.д.а. 10. Натрия

гидроокись ч.д.а. 11. Раствор а-нифтола 10 г/л:

1 г а-нафтола, 16 г карбоната натрия и 6 г гидро-

окиси натрия помещают в мерную колбу вмести-

мостью 100 мл и доводят до метки водой. Раст-

вор готовят не ранее чем за 2 ч до использова-

ния. 12. Основной раствор диацетила в этиловом

спирте: 0,2 мл диацетила растворяют в 20 мл

этилового спирта. 13. Рабочий раствор диацети-

ла 0,5 г/л: к 1 мл основного раствора прили-

вают 20 мл воды. Раствор хранят в холодильни-

ке. 14. Основной калибровочный раствор креати-

на: 0,131 г креатина помещают в мерную колбу

вместимостью 100 мл и доливают водой до

метки. 15. Рабочий калибровочный раствор

креатина, 150 мкмоль/л: 1,5 мл основного раст-

вора креатина помещают в мерную колбу

вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.

Раствор хранят в холодильнике.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатинфосфата,

0,1 мл сыворотки нагревают 5 мин при 37 °С.

Добавляют 0,3 мл раствора аденозиндифосфа-

та натрия и инкубируют 30 мин при 37 °С.

После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов

гидроокиси бария и сульфата цинка, центрифу-

гируют 15 мин при 3000 — 4000 об/мин. К 1 мл

центрифугата добавляют 1 мл воды, 1 мл раство-

ра а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для

развития окраски пробу помещают в термостат

на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый

светофильтр). Холостую пробу ставят так же,

как опытную, но вместо раствора аденозинди-

фосфата натрия добавляют воду.

К а л и б р о в о ч н а я  п р о б а . 0,3  м л буфе-

ра, 0,3 мл раствора аденозиндифосфата, 0,4 мл

рабочего раствора креатина обрабатывают так

же, как опытную пробу. Измеряют против

холостой пробы. Холостую пробу ставят, как

опытную, но вместо креатина берут воду.

Р а с ч е т производят по формуле:

X 333 нмоль/(с •  л ) ,

где Eoп — экстинкция опытной пробы; Ехол —

экстинкция холостой пробы; Е

к

 — экстинкция

калибровочной пробы; 333 — коэффициент пере-

счета на наномоли креатинфосфата, преформи-

рованного 1 л сыворотки за 1 с.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  о т 0  д о

220 нмоль/(с  - л ) , или от 0 до 13 ME.

Л и т е р а т у р а . Токарская 3. Б. Лаб. дело,

1971, № 1, с. 24—27; Ennor A. H., Rosenberg H.

Biochem. J., 1954, vol. 57, p. 203.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . В сыворот-

ке крови повышенная активность КК может

быть следствием повреждения сердечной или

скелетной мускулатуры. К поражениям сердеч-

ной мышцы, которые могут вызвать повышение

активности фермента, помимо инфаркта, отно-

сятся миокардиты, сердечная недостаточность,

сердечные аритмии. При этом активность КК

может увеличиться в 20—30 раз по сравнению

с нормой. При поражении скелетной мускулату-

ры уровень активности фермента достигает зна-

чительно более высоких цифр. При инфаркте

миокарда, как правило, подъем активности КК

наступает через 4—8 ч, максимальная актив-

ность наблюдается через 16—36 ч и нормаль-

ный уровень устанавливается к 3—6-му дню. По-

вышение активности КК может быть вызвано и

рядом других причин — употреблением алкого-

ля, отравлением снотворными средствами,

внутривенным введением ряда лекарственных

веществ. МВ-фракция КК является высокоспе-

цифичной для сердечной мышцы, активность

ее повышается, как правило, при инфаркте

миокарда.

5.2.7. Лактатдегидрогеназа,

изоферменты лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа — ЛДГ (L-лактат:

NAD-оксидоредуктаза: К.Ф. 1.1.1.27) —глико-

литический фермент, открытый Мейергофом в

1918 г., катализирует обратимую реакцию вос-

становления пировиноградной кислоты в молоч-

ную.

В кристаллическом виде впервые получена

в 1943 г. ЛДГ состоит из 5 изоферментов,

представляющих собой различные комбинации

двух типов (М и Н) полипептидных цепей.

Изофермент, преобладающий в мышечной тка-

ни, состоит из 4 идентичных М-цепей и его

обозначают М

4

 (ЛДГ

6

); преобладающий в ткани

сердца, содержит 4 идентичные Н-цепи, и его

обозначают как Н,((ЛДГ|). Остальные три изо-

фермента представляют собой различные соче-

тания М- и Н-цепей, а именно М

3

Н, М

2

Н

2

, МНз.

ЛДГ: наиболее быстро продвигается к аноду,

термостабилен, адсорбируется на ДЕАЕ-сефа-

дексе, тормозится высокой концентрацией пиру-

вата, незначительно инактивируется при дей-

ствии мочевины и щавелевоуксусной кислоты

и обладает одинаковой активностью при при-

менении а-кетобутирата и пирувата в качестве

субстрата.

ЛДГб при электрофорезе продвигается

медленнее других фракций, термолабилен, почти

полностью инактивируется при действии мочеви-

ны и щавелевоуксусной кислоты и обладает

незначительной активностью при применении

а-кетобутирата в качестве субстрата. ЛДГ

2

.

ЛДГ

3

, ЛДГ

4

 обладают промежуточными свой-

ствами. При использовании в качестве субстрата

а-кетобутирата определяется а-гидрооксибу-

тиратдегидрогеназа, являющаяся не самостоя-

197

тельным ферментом, а фракцией ЛДГ, ориенти-

ровочно соответствующая ЛДГ|.

Методы определения. Наиболее аналитиче-

ски надежными для определения общей ЛДГ

являются спектрофотометрические методы, осно-

ванные на прямом оптическом тесте Варбурга

с использованием в качестве субстрата как

L-лактата, так и пирувата. Колориметрические

динитрофенилгидразиновые методы более до-

ступные, но менее точные. Редоксиндикаторные

методы основаны на превращении бесцветной

окисленной формы тетразолиевых солей в окра-

шенную восстановленную форму за счет окисле-

ния NADH.

Для определения изоферментов ЛДГ наибо-

лее распространенными являются электрофоре-

тические методы. Хроматографические методы

основаны на разной степени адсорбции изо-

ферментов ЛДГ на сефадексе. Возможно опре-

деление изоферментов ЛДГ по выбору опти-

мальной концентрации субстрата для каждого

изофермента. Наиболее простыми и быстро

выполнимыми методами определения изофер-

ментов являются методы, основанные на раз-

личном отношении  Л Д

1

| и ЛДГ

5

 к температуре

и действию мочевины.

В методе, основанном на термической инакти-

вации изоферментов ЛДГ, сыворотку, смешан-

ную с буфером, инкубируют при 56; 60; 65 °С

30 мин. Затем определяют активность ЛДГ

в неинкубированной и инкубированной сыворот-

ках и рассчитывают процент падения актив-

ности при инкубации при различной темпера-

туре. Сыворотка крови здоровых людей за 30 мин

при 56 °С теряет около 30 % своей активности,

при 65 °С — около 80%. При заболеваниях

печени при 56 °С сыворотка теряет активность

до 50 % и при 65 °С — до 90 %. При сердечных

поражениях инактивация при 56 °С дает потерю

активности до 10 % и при 65 °С — около 60 %.

Определение изоферментов ЛДГ по инги-

бированию мочевиной основано на свойстве

мочевины как ингибитора. Мочевина тормозит

ЛДГ

5

 почти на 100 %. В большинстве случаев

определяется процент стабильной к мочевине

фракции от общей ЛДГ, который при заболе-

ваниях печени обычно составляет около 20 %.

В норме мочевиностабильная фракция состав-

ляет около 30% (20—36%). Однако указан-

ные методы недостаточно аналитически надежны.

Оптимизация условий измерения и унифи-

кация методов. Вид буфера почти не оказывает

влияния на активность фермента при определе-

нии общей ЛДГ. Оптимум рН равен 7,2—7,5.

Точные оптимальные концентрации реактивов

и оптимума рН зависят от состава изофер-

ментов ЛДГ. В большинстве стран в качестве

стандартных предложены методы, основанные

на оптическом тесте, различия касаются условий

определения. В нашей стране в 1974 г. утвержден

в качестве унифицированного колориметриче-

ский динитрофенилгидразиновый метод.

Унифицированный метод по оптимизирован-

ному оптическому тесту. П р и н ц и п. Различно

спектров поглощения окисленной и восстанов-

ленной форм NAD при 340 нм.

Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-

щенный (КН

2

РО

4

) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат

двузамещенный 3-водный (К

2

НРО4 • ЗНзО)

ч.д.а. 3. Натрия пируват; содержание основ-

ного вещества не менее 99 %. 4. b-Никотинами-

дадениндинуклеотид восстановленный, дина-

триевая соль. Коэффициент молярного поглоще-

ния не ниже 5,6 • 10

 2

 моль

 -1

 • м

 2

 при 340 нм.

5. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4, с раство-

ром NADH 0,165 ммоль/л и раствором пирувата

натрия 0,00103 моль/л: 0,16 г однозамещен-

ного фосфата калия, 2,07 г двузамещенного

фосфата калия, 0,0117 г NADH и 0,0114 г

пирувата натрия растворяют в 40—60 мл

0,1 моль/л фосфатном буфере, доводят рН и

доливают водой в мерной колбе до 100 мл.

Стабилен в течение суток при хранении в холо-

дильнике и 8 ч при хранении при комнатной

температуре. 6. Натрия хлорид, 154 ммоль/л.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Спектрофотометр с термостатированной кю-

ветой для микроизмерений. 2. Полуавтомати-

ческие пипетки.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я . Све-

жая сыворотка, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определени-

ем температура растворов и сыворотки должна

быть доведена до температуры измерения. Опре-

деление проводят по следующей схеме.

В термостатиро-

ванную кювету

(30 °С) приливают

Буфер с NADH и

пируватом

Сыворотка

Опытная

проба, мкл

650

20

Конечные

концентрации

веществ в пробе

1. Фосфатный

буфер, 0,1

моль/л

2. NADH, 0,16

ммоль/л

3. Пируват,

1 ммоль/л

Перемешивают, тотчас измеряют экстинкцию

и одновременно включают секундомер. Точно

через 1 и 2 мин (или через более короткие

промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Измерение опытной пробы проводят против воды

при 340 нм в кювете с толщиной слоя жидкости

1 см. Расчет производят по формуле:

активность, моль/(с • м

 3

) = нмоль/(с -л) • 10

6

 =

где Vp,

c

 — объем реакционной смеси; К

С

ы

В

 —

А£

 -

объем сыворотки; t — время реакции; ——

изменение экстинкции за секунду; е. — коэффи-

циент молярной экстинкции NADH, моль

 -1

 • м

2

;

l — толщина слоя жидкости в кювете, м (1х10

-2

).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  д о 3200

нмоль/(с • л), или до 195 ME, при 25 °С. До

5330 нмоль/(с • л), или до 320 ME при 30 °С.

198