Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 47

ных условий измерения. За исключением метода

МФКХ, ни в одном стандартном методе не

добавляется в инкубационную среду пиридо-

ксаль-5-фосфат, являющийся коферментом для

АсАТ и АлАТ. Добавление его в инкубацион-

ную среду позволяет увеличить чувствитель-

ность метода. Степень активации зависит от

многих факторов: вида буфера, концентрации

субстрата, концентрации апофермента, содер-

жания витамина B

6

 в организме.

1. Основная реакция:

Советском Союзе в 1972 г. утвержден

в качестве унифицированного модифицирован-

ный метод Райтмана — Френкеля. В качестве

наиболее точных рекомендованы оптимизи-

рованные методы, основанные на оптическом

тесте Варбурга.

АсАТ. Унифицированный метод по оптими-

зированному оптическому тесту. П р и и ц и и.

Различие спектров поглощения окисленной и

восстановленной форм NAD при 340 им.

Равновесие реакции сдвинуто вправо.

Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-

щенный (КН

2

РО

4

) х. ч., ч. д. а. 2. Калия

фосфат двузамещенный (К

2

НРО

4

 • ЗН

2

О) ч.д.а.

3. L-Аспарагиновая кислота или L-аспараги-

новой кислоты натриевая соль. 4. Фосфатный

буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещен-

ного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного

фосфата калия трехводного растворяют в 40—

60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в

мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении

в холодильнике. 5. Субстратно-буферный раст-

вор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в

0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г

L-аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой

соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в

40—50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, про-

веряют рН и доводят фосфатным буфером в

мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acna-

рагиновую кислоту, то к навеске перед растворе-

нием в фосфатном буфере для установления

рН 7,4 добавляют «20—26 мл 1 моль/л раство-

ра едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен

при хранении в холодильнике в течение месяца.

6. в-Никотинамидадениндинуклеотид восста-

новленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг

N A D H - N a

2

- 4 H

2

O растворяют в 1,5 мл воды.

Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении

в темной посуде в холодильнике. Коэффициент
молярного поглощения не ниже 5,6 • 10

 2

 м

 2

 X

X моль

-1

 при 340 нм. 7. а-Кетоглутаровая

кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г а-кетоглутаровой

кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют

0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если

используют динатриевую соль а-кетоглутаровой

кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды.

Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении

в холодильнике. а-Кетоглутаровая кислота не

должна содержать примесей пирувата и мала-

та. 8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи

(L-малат: NAD

+

 оксидоредуктаза; К. Ф.  1 . 1 . 1 . 3 7 ) .

Суспензия в 50 % растворе  г л и ц е р и н а .  С п е ц и -

фическая каталитическая активность выше

17  м м о л ь / ( с - л ) . Примеси:  А с А Т < 0 , 0 1 % ,

ГлДГ < 0,003 %, ЛДГ < 0,01 %. Для приго-

товления рабочего раствора к 20 мкл суспензии

добавляют 5 мл воды. 9. Лактатдегидрогеназа

из скелетной мышцы кролика или свиньи. Сус-

пензия в 50 % растворе глицерина. Специфи-

ческая каталитическая активность выше 8 ммоль/

/(с  - л ) . Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ <

< 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовле-

ния рабочего раствора к 40 мкл суспензии добав-

ляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 мес при

хранении в холодильнике в хорошо укупоренной

посуде. 10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

1 1 . Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологи-

ческий раствор).

П р и м е ч а н и е . Для определения актив-

ности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту

используют отечественные реактивы квали-

фикации «х.ч.» или «ч.д.а.» или импортные,

например, можно использовать реактивы

ф и р м ы «Reanal» (ВНР). Реактивы квалифи-

кации «ч.» непригодны. Все реактивы готовят

на бидистиллированной воде, хранят при

температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение

стабильности может наступить за счет роста

микроорганизмов. Поэтому в растворы ре-

комендуется добавлять несколько капель

хлороформа.
С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр с термостатированной кюве-

той. Измерение проводят при 340 нм.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови или плазма, свободные от

гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определени-

ем температура растворов и сыворотки должна
быть доведена до температуры измерения. Пе-

ред работой можно готовить смесь реактивов,

состоящую из субстратно-буферного  р а с м т р а .

187

раствора NADH, МДГ и ЛДГ в соотношении

60: 1 : 1 : 1. Определение проводят по следую-

щей схеме.

В термостати-

рованную

кювету

приливают

Субстратно-

буферный

раствор

N A D H - р а с т -

вор

МДГ-суспен-

зия

ЛДГ-суспен-

зия

Сыворотка
крови

154 м моль/л

раствор хло-

рида натрия

Опыт-

ная

проба,

мл

3,0

0,05

0,05

0,05

0,5

—

Холо-

стая

проба,

мл

3,0

0,05

0,05

0,05

—

0,05

Конечная кон-

центрация ве-

ществ в пробе

Фосфатный бу-

фер -80

м моль/л

L - А с п а р а г и н о -

вая кислота —

200 ммоль/л

0,18 ммоль/л

10000 нмоль/

/ ( с - л )

10000 нмоль/

/ ( с - л )

Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин

при 30 или 37°

 С

Раствор а-ке-

тоглутаровой

кислоты

0,1

0,1

12 ммоль/л

Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) изме-

ряют экстинкцию и одновременно включают

секундомер. Точно через 1, 2, 3  м и н (или через

более короткие, но равные промежутки времени)

измеряют экстинкцию.

Поправку на холостой опыт проводят по

формуле:

Скорректированную величину опытной про-

бы используют в дальнейших расчетах.

Р а с ч е т производят по формуле:

активность, моль/(с • м

3

) =  н м о л ь / ( с - л ) • 10

6

 =

где V

f

 с.— объем реакционной смеси, мл;

Venn— объем сыворотки, мл; / — время реак-

изменение экстинкции за 1 с;

F — коэффициент молярной экстинкции \Л1)Н

кювете в метрах

188

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  о т  3 0  д о

420 нмоль/ (с -л) ((от 2 до 25 ME)] при 30 °С.

П р и м е ч а н и е . Определение активности

фермента можно проводить по микрометоду.

Для этого перед работой готовят смесь ре-

активов, состоящую из субстратно-буферно-

го раствора, растворов NADH, ЛДГ, МДГ

в соотношении 60: 1 : 1 : 1. Опытная проба

включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыво-

ротку — 0,10 мл, а-кетоглутаровую кисло-

ту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так

же, как опытную, но вместо сыворотки до-

бавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия.

Определение проводят по той же схеме, что и

в макрометоде.

АлАТ. Унифицированный метод по оптими-

зированному оптическому тесту. П р и н ц и и

тот же, что для АсАТ.

1. Основная реакция:

Р е а к т и в ы . 1. Калия фосфат однозаме-

щенный  ( K H

2

P O

4

) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат

двузамещенный (К

2

НРО

4

 • ЗН

2

О) ч.д.а. 3. Фос-

фатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г одно-

замещенного фосфата калия и 2,07 г двузаме-

щенного фосфата калия трехводного растворя-

ют в 40—60 мл воды, проверяют рН и доводят

водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при

х р а н е н и и в холодильнике. 4. 1.-а-Аланин. 5.

Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-

аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4:

5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л

фосфатного буфера, проверяют рН и доводят

фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл.

Стабилен в течение 2 мес при хранении в холо-

дильнике. 6. р-Никотинамидадениндинуклеотид

восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л

(коэффициент молярной экстинкции не ниже

5.6 • 10

2

 м

2

 • моль

-1

 при 340  н м ) : 16 мг

N A D H - N a

2

- 4 H

2

O растворяют в 1,5 мл воды.

Раствор стабилен в течение 2 нед при  х р а н е н и и

в темной посуде в холодильнике. 7. Натр едкий,

5 моль/л. 8. а-Кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л:

0,245 г а-кетоглутаровой кислоты растворяют

в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л

раствора едкого натра. Если используют ди-

натриевую соль а-кетоглутаровой кислоты, то

0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор

стабилен в течение 2 нед при хранении в холо-

дильнике. 9. Лактатдегидрогеназа из скелетной

мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50 %

растворе глицерина. Специфическая каталити-

ческая активность выше 8  м м о л ь / ( с •  л ) . При-

меси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %,

АлАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочей)

раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл

воды. Стабилен в течение 3 мес при хранении

в холодильнике. 10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л

(физиологический раствор). Все реактивы

лучше готовить на бидистиллированной воде.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е  т о

ж е, что для АсАТ.

М а т е р и а л  и с с л е д о в а н и я . Свежая

сыворотка или плазма крови, свободные от гемо-

лиза. Фермент стабилен при 4 °С в течение
суток.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определени-

ем температура растворов и сыворотки должна

быть доведена до температуры измерения. Перед

работой можно готовить смесь реактивов, сос-

тоящую из субстратно-буферного раствора,

раствора  N A D H и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1.

Определение проводят по следующей схеме.

В термостати-

рованную

кювету

приливают

Субстратно-бу-

ферный раствор

NADH-раствор

ЛДГ

Сыворотка кро-

ви 154 ммоль/л

раствор хлори-

да натрия

Опыт-

ная

про-

ба, мл

3,0

0,05
0,1

0,5

—

Холо-

стая

про-

ба, мл

3,0

0,05
0,1

—

0,5

Конечная

концентрация

веществ

в пробе

Фосфатный бу-

фер — 80 ммоль/л

L-Аланин —

500 ммоль/л

0,18 ммоль/л

20 000 нмоль/

(с-л)

Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин

при 30 или 37 °С

Раствор а-кето-

глутаровой кис-

лоты

0,1

0,1

15 ммоль/л

Перемешивают, через 60 с (лаг-фаза) изме-

ряют экстинкцию и одновременно включают се-

кундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через

более короткие, но равные промежутки времени)

измеряют экстинкцию. Измерение опытной и

холостой проб проводят против воды при 340 нм

в кювете с толщиной слоя 1 см.

Поправку на холостой опыт проводят по

формуле:

Скорректированную величину опытной про-

бы используют в дальнейших расчетах.

Р а с ч е т производят  п о формуле:

Условные обозначения те же, что для опре-

деления АсАТ.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  о т  3 0  д о

420 нмоль/(с • л) [(от 2 до 25 ME)] при 30 °С.

П р и м е ч а н и е . Определение активности

фермента можно проводить по микрометоду.

Для этого перед работой готовят смесь ре-

активов, состоящую из субстратно-буферно-

го раствора, растворов  N A D H и ЛДГ
в соотношении 60 : 1 : 2. Опытная проба

включает: смесь реактивов — 0,630 мл; сы-

воротку - 0,10 мл; а-кетоглутаровую кисло-

ту — 0,02 мл. Определение проводят по той

же схеме, что и в макрометоде.
О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и  м е т о д о в . Коэффициенты вариации

2—6 %. При использовании реактивов, сво-

бодных от ингибиторов, и точного спектрофото-

метра метод дает правильные результаты.

Реакции для АсАТ и АлАТ линейны до величины

активности 4000 нмоль/(с  - л ) .

Л и т е р а т у р а . Делекторская Л. Н. В. кн.:

У н и ф и к а ц и я лабораторных методов исследова-

ния / Под ред. В. В. Меньшикова.— М., 1978,

вып.  V I I I , с. 83—89; Bergmeycr //. U. (Hrsg.)

Methoden der  e n z y m a t i s c h e n  A n a l y s e . Wein-

h e i m / V e r l a g Chemie, 1974, Bd 1, S. 769—775,
785—792; Karmen A. .}.  C l i n . Invest., 1955,

v o l . 34, p. 131; Wrobtewski F., La Due J. S.

Proc. Soc. exp. biol. Med., 1956, vol. 91, p. 569—

571.

Унифицированный динитрофенилгидразино-

вый метод Райтмана — Френкеля.  П р и н ц и п .

В результате переаминирования, происходящего

под действием АсАТ и АлАТ, образуются щаве-

левоуксусная и пировинОградная кислоты. При

добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в ще-

лочной среде образуются окрашенные гидразо-

ны пировиноградной и щавелевоуксусной кислот.

Р е а к т и в ы . 1. Натрия фосфат двузаме-

щенный (Na

2

HPO

4

), 0,1 моль/л: 14,2 г Na

2

HPO,

доводят до 1 л водой. 2. Калия фосфат одно-

замещенный, 0,1 моль/л: 13,60 г КН

2

РО

4

 до-

водят до 1 л водой. 3. 0,1 моль/л фосфатный

буфер рН 7,4: смешивают 840 мл 0.1 моль/л

раствора Na

2

HPO

4

 и 160 мл 0,1 моль/л раствора

КН

2

РО

4

. Полученный раствор с индикатором

бромтимоловым синим должен давать голубую

окраску. Величину рН буфера доводят под контро-

лем рН-метра. К приготовленному раствору в

качестве консерванта можно добавить 5—10 мл

хлороформа. 4. Натр едкий, 0,05 моль/л; 1 моль/л.

5. Бромтимоловый синий, 0,04 % раствор: 100

мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл

0,05 моль/л раствора едкого натра. После раст-

ворения смывают водой в мерную колбу вмести-

мостью 250 мл и доводят водой до метки. 6. DL-

А с п а р а г и н о в а я кислота или I.-аспарагиновая

кислота *. 7.  D L - А л а н и н или  L - а л а н и н *. 8. а-

* Если берется вместо DL-аспарагиновой

кислоты L-аспарагиновая, а вместо DL-аланина

L-аланин, то навеска уменьшается вдвое.

189

Кетоглутаровая кислота. 9. Субстратный раст-

вор для определения АсАТ: 29,2 мг а-кетоглута-
ровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагиновой

кислоты растворяют в 1 моль/л растворе едкого

натра. Едкий натр следует прибавлять осторож-
но, небольшими порциями, до полного растворе-

ния составных частей и до получения рН 7,4.

Раствор переливают количественно в мерную
колбу вместимостью 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л

фосфатным буфером рН 7,4. Доливают буфер
в колбу до метки, тщательно перемешивают,
прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют

в холодильнике в замороженном виде. Перед

употреблением замороженный раствор должен
полностью оттаять (повторное оттаивание не

рекомендуется). 10. Субстратный раствор для

определения АлАТ: 29,2 мг а-кетоглутаровой

кислоты и 1,78 г DL-аланина отвешивают на

аналитических весах. Дальнейшая работа про-
водится так же, как для субстратного раствора

АсАТ. 11. HCI 1 моль/л. 12. Раствор 2,4-динитро-
фенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилги-

дразина растворяют в небольшом количестве

1 моль/л раствора HCI при нагревании на водя-

ной бане. После охлаждения доводят объем

НС1 до 100 мл. На следующий день реактив

фильтруют. Раствор стабилен при хранении в

холодильнике в посуде из темного стекла. 13. Натр
едкий, 0,4 моль/л, свободный от карбонатов.

Бутыли с реактивом и водой закрывают пробка-

ми с поглотительными трубками,  н а п о л н е н н ы м и
натронной известью. 14. Пировинограднокислый

натрий. Для приготовления калибровочного
раствора 11 мг кристаллического пирувата

н а т р и я (белого цвета) растворяют в небольшом
количестве воды, переносят в мерную колбу

вместимостью 100 мл и доводят объем раствора

до метки водой; 1 мл раствора содержит 110 мкг

пирувата натрия, что соответствует 88 мкг (или

1 мкмолю) пировиноградной кислоты.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я  А с А Т . Опытная

проба: в пробирку вносят 0,5 мл субстратного
раствора для определения АсАТ, нагревают при

37 °С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сы-

воротки и инкубируют при 37 °С 30 мин.
Затем добавляют 0,5 мл раствора

2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в
течение 20 мин при комнатной температуре.

Добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого
натра, тщательно перемешивают и оставляют

для развития окраски на 10  м и н при комнатной
температуре. Измеряют на ФЭКе при длине

волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в

кювете с толщиной слоя 1 см против холостой

пробы.

Холостую пробу ставят так же, как опытную,

но сыворотку добавляют после  и н к у б а ц и и .

Х о д  о п р е д е л е н и я  А л А Т . В пробир-

ку вносят 0,5 мл субстратного раствора АлАТ

и нагревают при 37 °С в течение 5 мин. Затем

вносят 0,1 мл сыворотки и инкубируют при
37 °С 30  м и н .  Д а л ь н е й ш и й ход анализа осу-

ществляют так же, как и при определении

АсАТ,

Р а с ч е т активности ферментов в сыворотке

крови производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из кали-

бровочного раствора готовят ряд разведений,

как указано ниже.

№

про-

бир-

ки

1

2

3

4

5

Калибро-

вочный

раствор

пирувата

натрия,

мл

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Ди-

стил-

лиро-

ван-

ная

мл

0,55

0,5

0,45

0,4

0,35

Пировино-

градная

кислота

мкг

4,4

8,8

13,2
17,6

22,0

М К М л П Ь

0,05
0,1

0,15

0,2

0,25

Активность

фермента,

нмоль/

(с-л)

АсАт, АлАТ

278

556
834

1112

1390

Калибровочные пробы ставят так же, как

опытные, но вместо сыворотки добавляют разве-

денные калибровочные растворы. Измеряют

против холостой пробы, в которую вместо ка-
либровочных растворов добавляют воду. Кали-

бровочная  к р и в а я линейна до величины экстинк-

ции 0,3.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : для АсАТ,

АлАТ 28—190  н м о л ь / ( с - л ) [0,1—0,68 мкмоль/

( ч - м л ) ] при 37 °С.

О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и  м е т о д а . Воспроизводимость: коэф-

фициенты вариации составляют 2—6 % в зави-
симости от условий определения. Правильность
метода зависит в значительной степени от пра-

вильного построения калибровочной кривой и

правильной постановки холостой пробы. Специ-
фичность: абсорбционная способность гидразо-

на щавелевоуксусной и пировиноградной кислот

выше, чем гидразона а-кетоглутаровой кислоты
при 500 нм. Интерференция: ацетилсалициловая

кислота  ( а с п и р и н ) , барбитураты, пенициллин,

опиаты завышают результаты во всех методах.

Л и т е р а т у р а . Reltman S., Frankel S.

Amer. J.  C l i n . Pathol., 1957, vol. 28, p. 56.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Несмотря

на отсутствие органной специфичности, опреде-

ление АсАТ и АлАТ при заболеваниях печени

и сердца имеет большую диагностическую цен-

ность. При инфаркте миокарда активность АсАТ
в сыворотке крови повышена: активность воз-

растает через 4—6 ч после инфаркта миокарда
и снижается до нормы на 3—7-й день.

Особенно важное значение имеет определе-

ние аминотрансфераз для раннего выявления

гепатита. Острый гепатит сопровождается рез-

ким повышением АлАТ; АсАТ при этом также

повышена, но обычно ниже активности АлАТ.
Активность АлАТ начинает увеличиваться уже

в продромальной стадии, когда другие признаки
болезни еще не появились. Коэффициент Де

Ритиса АсАТ/АлАТ < 1. При тяжелом пораже-
нии печени соотношение активности ферментов

меняется.

190