Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 46

Для достижения максимальной скорости

ферментативной реакции концентрация субстра-

та должна во много раз (50 и более) превышать

константу Михаэлиса. На практике не исполь-

зуют слишком высокую концентрацию субстра-

та, так как субстрат или его продукт может

тормозить активность фермента. Если для реак-

ции взять концентрацию субстрата, в 10 раз

превышающую константу Михаэлиса, то ско-

рость реакции составит 90 % от максималь-

ной, что достаточно для практических целей.

Эмпирически также можно определить необхо-

димую субстратную концентрацию по кривой

изменения скорости реакции при увеличении

концентрации субстрата. Вид буфера может ока-

зывать значительное влияние на активность

ферментов, особенно ЩФ. Все ферменты имеют

оптимальную область рН действия. В качестве

активаторов для многих ферментов могут слу-

жить органические и неорганические соедине-

ния. Например, активатором для КК являются

сульфгидрильные соединения, для ЩФ — ионы

магния. При определении активности ферментов

чаще приходится иметь дело с ингибиторами.

Ингибиторы ферментов могут находиться в ис-

следуемом материале и в реактивах. В моче,

например, много ингибиторов ЛДГ. Ионы тяже-

лых металлов органических и неорганических

реактивов являются ингибиторами для боль-

шинства ферментов.

На практике для каждого фермента экспери-

ментально должна подбираться концентрация

субстрата, оптимум рН, вид буфера и его кон-

центрация. Оптимизация условий определения

активности ферментов повышает аналитическую

надежность результатов исследования и их

диагностическую информативность, поэтому оп-

ределение активности ферментов предпочтитель-

нее проводить в оптимизированных условиях

относительно концентрации субстрата, буфера,

активаторов и величины рН.

Методы определения активности ферментов.

Существует большое количество методических

принципов определения активности ферментов,

различающихся по технике исполнения, анали-

тическим качествам, способу измерения актив-

ности ферментов. По способу измерения разли-

чают: непрерывное кинетическое измерение,

двухточечное измерение, измерение по конечной

точке. Преимущество кинетического измерения

состоит в возможности прямого непрерывного

измерения скорости ферментативной реакции

в начальной линейной части кривой при оптими-

зированной концентрации реактивов. С этой

точки зрения наиболее точными и приемлемыми

являются методы, основанные на оптическом

тесте. Оптический тест был разработан Вар-

бургом в 30-х годах. Принцип теста Варбурга

основан на разнице поглощения при определен-

ной длине волны (340 нм) восстановленной

(NADH) и окисленной  ( N A D ) форм никотина-

мидадениндинуклеотида. При длине волны

340 нм NADH имеет максимальную абсорбцию,

тогда как NAD не имеет поглощения при данной

длине волны. Качество реактива имеет большое

значение для получения правильных результа-

тов. Поэтому коэффициент молярной абсорбции

рекомендуется проверять в лаборатории, он не

должен быть  н и ж е 5 - 1 0

2

  м о л ь

- 1

- м

2

. Различают

прямой и непрямой оптические тесты. Прямой

оптический тест применяется для определения

активности дегидрогеназ. Непрямой оптический

тест включает, помимо измерительной, индика-

торную и вспомогательную реакции. Например,

прямой оптический тест для определения актив-

ности ЛДГ:

При непрямом оптическом тесте требуется

введение в реакцию ферментов. Активность фер-

ментов измеряют на спектрофотометре предпоч-

тительно с термостатированной кюветой, а так-

же на биохимических анализаторах, позволя-

ющих измерять кинетику ферментативной реак-

ции. К преимуществам методов, основанных на

оптическом тесте, относятся возможность опре-

деления активности ферментов при оптимизиро-

ванных условиях, в начальной линейной части

кривой, при кинетике нулевого порядка. К фак-

торам, снижающим специфичность данных ме-

тодов, относится влияние метаболитов эндоген-

ного происхождения. В редоксиндикаторных ме-

тодах NADH восстанавливает синий тетразолий
или другие вещества с образованием окрашен-

ных соединений. Промежуточным продуктом

служит феназинметасульфат.

Флуориметрические методы определения ак-

тивности ферментов более чувствительны, чем

спектрофотометрические. Сравнительно новыми

и еще более  ч у в с т в и т е л ь н ы м и являются хемилю-

183

Т а б л и ц а 39. Уменьшение активности фермен-

тов в сыворотке крови при хранении [Berg-

meyer Н. U., 1983|

* д — день.

минесцентные методы с применением люцифе-

рин-люциферазной системы. Из перечисленных

методов наиболее широкое клиническое приме-

нение находят спектрофотометрические методы.

Оптический тест Варбурга лежит в основе мето-

дических принципов, заложенных в большинство

выпускаемых коммерческих наборов реактивов.

Для определения активности ферментов при-

меняют фотометрические методы, основанные на

образовании окрашенных соединений с продук-

тами ферментативной реакции. Как правило,

измерение проводят по конечной точке, что явля-

ется недостатком методов этой группы, и точ-

ность их ниже, чем методов, основанных на опти-

ческом тесте Варбурга. Исключение составляют

методы, в которых в ходе реакции непосред-

ственно из субстрата образуется окрашенное

соединение.

Материал исследования. Наиболее часто ак-

тивность ферментов определяют в сыворотке,

плазме, моче, клетках крови. Для большинства

ферментов не имеет принципиального значения,

определяется ли активность фермента в плазме

или сыворотке крови. Это имеет значение для тех

ферментов, которые содержатся в тромбоцитах,

как, например, КФ, АЛД, ЛДГ, так как при

свертывании крови указанные ферменты будут

освобождаться из тромбоцитов, поэтому актив-

ность ЛДГ, АЛД в сыворотке крови будет выше,

чем в плазме. Важно также знать содержание

ферментов в эритроцитах. Те ферменты, которые

содержатся в эритроцитах, при гемолизе попа-

дают в сыворотку и активность их в сыворотке

будет значительно выше. В табл. 39 представ-

лены данные о стабильности ряда ферментов.

Практически важен также вопрос о разведении

сыворотки при высокой активности фермента.

Для ряда ферментов (АсАТ, КК) известен эф-

фект разведения, т. е. при разведении сыворотки

154 ммоль/л раствором NaCI активность фер-

мента не снижается пропорционально разведе-

нию. Это объясняется  р а з л и ч н ы м и  п р и ч и н а м и :

концентрация белка в сыворотке может влиять

на активность фермента во время инкубации;

при разведении нарушается соотношение инги-

биторов и активаторов, что также не дает ожи-

даемого результата от разведения, поэтому при

определении активности ферментов предпочти-

тельнее не разводить сыворотку, а уменьшать

время инкубации.

Множественные формы ферментов. Множе-

ственность молекулярных форм ферментоп мо-

жет быть обусловлена различными  п р и ч и н а м и .

Она может быть закодирована генетически,

тогда такие множественные формы называют

изоферментами, и может быть обусловлена ге-

терогенностью полипептидных цепей (например,

ЛДГ), различием в аминокислотном составе

фермента (например, для АсАТ). Множествен-

ность молекулярных форм — более широкое по-

нятие, чем изоферменты, она может быть обу-

словлена различным строением небелковой

части молекулы (например, ЩФ), конформа-

ционной изомерией  ( н а п р и м е р , МДГ) и другими

факторами. Изоферментами обозначают группу

ферментов из организма одного и того же биоло-

гического вида, обладающих одним типом суб-

стратной специфичности, но отличающихся по

физико-химическим и иммунологическим свой-

ствам. Изоферменты отличаются друг от друга

по кинетическим свойствам (отношение к инги-

биторам, активаторам, сродство с субстратом).

Для большинства ферментов установлено су-

ществование множественных форм. Важность

изучения изоферментов для диагностики была

впервые установлена в 1957 г. для ЛДГ. Изо-

ферменты способны образовывать комплексы с

иммуноглобулинами,  л и п и д а м и , липопротеина-

ми и  д р у г и м и компонентами сыворотки, что

может менять их электрофоретическую подвиж-

ность.

Методы определения изоферментов. К  н и м

относятся электрофоретические методы на раз-

личных носителях, хроматографические, им-

мунологические; методы, основанные на опреде-

лении субстратного оптимума изоферментов;

термическое инактивирование; ингибирование

различными веществами; методы, основанные на

различном сродстве изоферментов к субстратам.

Наиболее распространены электрофоретические

методы определения изоферментов на различ-

ных носителях: бумаге, крахмальном геле, плен-

184

Рис. 8. Схема расположения некоторых изоферментов сыворотки крови при электрофорезе на бумаге

или ацетатцеллюлозе.

1,2,3,4,5 — соответствующие изоферменты ЛДГ — ЛДГ

1

. ЛДГ

2

, ЛДГ

3

, ЛДГ

4

, ЛДГ

5

; П — печеночный изо-

фермент ЩФ; ММ —  м ы ш е ч н ы й изофермент К.К; ВВ — мозговой изофермент К.К; Мнт — митохондриальный

изофермент АсАТ; Ц — цитоплазматический изофермент АсАТ; Пж — поджелудочный изофермент а-ами-

лазы; Сл — слюнной изофермент а-амилазы.

ках из ацетата целлюлозы, полиакриламидном

геле (рис. 8). Хроматографические методы осно-

ваны на разной степени адсорбции изофермен-

тов.

Иммунологическая дифференциация изо-

ферментов предусматривает применение специ-

фических антисывороток. Электрофореграммы

различных ферментов представлены на рис. 8.

Стандартизация и унификация методов опре-

деления активности ферментов предусматривает

выбор и оценку унифицированных методов для

практической работы в клинико-диагностиче-

ских лабораториях, разработку наиболее точ-

ных, референтных (эталонных) методов. Рефе-

рентные методы предназначаются для оценки

аналитической надежности унифицированных

методов, для оценки качества рефе-

рентных и контрольных материалов, они

также могут быть использованы для прак-

тической работы в клинико-диагностических

лабораториях. Референтные методы для фер-

ментов разрабатываются на основе: оптимиза-

ции параметров реакции, стандартизации усло-

вий измерения; установления необходимой

степени чистоты реактивов и калибровочных

материалов, требований к точности приборов;

оценки аналитической надежности методов.

Международной федерацией клинической  х и м и и

(МФКХ) разработаны общие требования к из-

мерению активности ферментов и референтные

методы для ряда ферментов, а также требова-

ния к референтным материалам для измерения

активности ферментов '. В рамках рабочей

группы экспертов стран — членов СЭВ также

разработаны правила определения активности

ферментов.

Согласно разработанным рекомендациям

номенклатура ферментов должна употребляться

в соответствии с рекомендациями (1972) Комис-

сии Международного биохимического союза по

номенклатуре и классификации ферментов (с до-

полнениями по 1975 г.); определение активности

ферментов рекомендуется проводить в оптимизи-

рованных условиях с кинетическим измерением;

предпочтительная температура измерения 30 °С,

колебания ее не должны превышать ± 0,05 °С.

Активность ферментов выражается в моль/

/(с • л); мкмоль/(с • л); нмоль/(с •  л ) . Между-

народная единица (ME)  — м к м о л ь / ( м и н • л)

соответствует 16,67  н м о л ь / ( с - л ) ; единица,

используемая в унифицированных методах —

мкмоль/(ч • мл) соответствует 278 нмоль/(с • л).

1

 IFCC. Committee on Standarts. Expert

Panel on Enzymes, 1975, 1976, 1977, 1979.

IFCC. Scientific Committee. Expert Panel on

Enzymes, 1980, 1981.

185

Комиссия по величинам и единицам МФКХ

и Международного союза теоретической и при-

кладной химии предложила именовать величину

нмоль/(с • л) каталом. Поскольку присвоение

производным единицам собственных наименова-

ний может производиться только в соответствии

с решением Генеральной конференции по мерам

и весам, то до такого решения наименование

катал — неприемлемо.

Вопросами выбора методов определения

активности ферментов успешно занимаются, по-

мимо международных организаций, многие на-

циональные комитеты. Созданы Комиссии по

ферментам Американской ассоциации Клиниче-

ской химии (США), Немецкого общества клини-

ческой  х и м и и (ФРГ), Скандинавский комитет

по ферментам, Английская рабочая группа по

ферментам. Комиссии по ферментам работают

в Австрии, Канаде, Франции, Италии, Японии.

Помимо выбора метода, важным направле-

нием в деятельности вышеуказанных организа-

ций является разработка референтных материа-

лов для методов определения активности фер-

ментов, определение их стабильности, чистоты

и возможность их применения для проведения

межлабораторных экспериментов и проверки ка-

чества методов.

Л и т е р а т у р а . Номенклатура ферментов.

Рекомендации (1972) Международного биохи-

мического союза по номенклатуре и классифи-

кации ферментов, а также по единицам фермен-

тов и символам кинетики ферментативных ре-

акций.—М.: ВИНИТИ, 1979.—320; Вилкинсон

Д.  ( W i l k i n s o n J. Н.). Принципы и методы ди-

агностической энзимологии/Пер. с англ.—

М.: Медицина, 1981.—624 с.

5.2.2. Аминотрансферазы

Аспартатаминотрансфераза — АсАТ (L-ac-

партат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза;

К. Ф. 2.6.1.1) катализирует обратимый перенос

аминогрупп с L-аспарагиновой кислоты на а-ке-

тоглутаровую.

Аланинаминотрансфераза — АлАТ (L-ала-

нин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза; К. Ф.

2.6.1.2) катализирует обратимый перенос амино-

групп с L-аланина на а-кетоглутаровую кислоту.

Реакция, катализируемая АсАТ:

Ферменты открыты советскими учеными А. Е.

Браунштейном и М. Г. Крицман. АсАТ и АлАТ

обнаружены во всех исследованных к настояще-

му времени тканях человека и животных. АсАТ

состоит из изоферментов: цитоплазматического

и митохондриального, каталитические свойства

которых различны. Митохондриальная форма

фермента имеет более высокие величины К», для

а-кетоглутарата и более низкие для L-acnap-

тата.

Методы определения аминотрансфераз осно-

ваны главным образом на определении скорости

образования пировиноградной и щавелево-

уксусной кислот, так как нет простых способов

определения L-аспарагиновой, а-кетоглутаро-

вой кислот и L-аланина. Для определения актив-

ности АсАТ и АлАТ наиболее распространен-

ными являются спектрофотометрические и коло-

риметрические методы.

Первые спектрофотометрические методы,

основанные на оптическом тесте, были предло-

жены для АсАТ А. Кагтеп в 1955 г., для

АлАТ — F. Wroblewski, J. La Due в 1956 г.

В последующем эти методы были модифициро-

ваны и оптимизированы.

Первый динитрофенилгидразиновый метод

определения АсАТ и АлАТ описан N. Н. Tongasi

186

с соавт. Наиболее распространенным динитро-

фенилгидразиновым методом является метод

Райтмана — Френкеля (1956), в котором опре-

деляют окрашенные динитрофенилгидразоны

щавелевоуксусной и пировиноградной кислот без

экстракции их толуолом в отличие от метода

Тонгази. Метод Бабсона, принцип которого

основан на образовании щавелевоуксусной кис-

лотой с солями диазония окрашенного продукта

реакции, прост по исполнению, дает надежные

результаты, но пригоден только для определения

АсАТ. Методы определения глутаминовой кисло-

ты с помощью бумажной хроматографии трудо-

емки и применяются главным образом в научных

исследованиях. Манометрические методы трудо-

емки и не применяются в клинических лабора-

ториях. Флуориметрические методы высокочув-

ствительны и точны, но требуют специального

оборудования. Методы с в-гидроксибензальде-

гидом и ванилином не нашли применения из-за

низкой специфичности.

Оптимизация условий определения и унифи-

кации методов. В большинстве стран в качестве

стандартного предлагаются методы, основанные

на оптическом тесте. Различия в национальных

рекомендациях по стандартизации методов ка-

саются не принципа метода, а оптимизирован-