Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 45

NaOH при 500—560 нм (зеленый светофильтр).

Величину экстинкции альбуминов умножают

на 2. Определяют сумму экстинкции всех фрак-

ций,  п р и н и м а я ее за 100 %, и вычисляют долю

каждой фракции.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы у  в з р о с -

л ы х: альбумины 50—70 %; глобулины: он 3—

6 %; а

2

 9—15; в 8—18 %; у 15—25 %.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Диагно-

стическое значение определения альбумина

представлено выше. Увеличение содержания <х-

глобулинов в сыворотке крови характерно для

острых воспалительных процессов, так как в

данную фракцию входят белки острой фазы

(С-реактивный белок, а

1

-гликопротеид, а

1

-анти-

трипсин, а2-макроглобулин, церулоплазмин,

гаптоглобулин и др.). Во фракцию а-глобулинов

входит большинство гликопротеидов. Содержа-

ние а-глобулинов увеличивается также при

различных хронических заболеваниях, злока-

чественных новообразованиях, метастазирова-

н и и опухолей, травмах, ревматизме, инфаркте

миокарда.

Повышение в-глобулинов в сыворотке крови

чаще наступает при гиперлипопротеидемиях

различного происхождения, что связано с нали-

чием в данной фракции липопротеидов. Фрак-

ция у-глобулинов увеличивается при патологи-

ческих состояниях, связанных с интенсифика-

цией иммунологических процессов, так как

фракция у-глобулинов состоит главным образом

из иммуноглобулинов. Увеличение содержания

у-глобулинов может наступать за счет образо-

вания патологических белков — парапротеинов,

относящихся к иммуноглобулинам.

Гипогаммаглобулинемии могут носить вро-

жденный характер или могут быть обуслов-

лены наличием различных заболеваний или па-

тологических состояний, сопровождающихся ис-

тощением иммунной системы. К таким заболева-

н и я м относятся злокачественные опухоли, хро-

нические воспалительные процессы, аллергиче-

ские заболевания.

5.1.4. Осадочные пробы

Применение осадочных проб с диагности-

ческой целью основано на изменениях устойчи-

вости белков плазмы при некоторых заболева-

ниях. В норме белки в плазме крови находятся

в коллоидном состоянии и отличаются высокой

устойчивостью. При постановке осадочных проб,

которые сопровождаются химическим или физи-

ческим вмешательством, наступает преципита-

ция белков, приводящая к помутнению или об-

разованию хлопьев.

Основные осадочные пробы. Пробы с приме-

нением реакции Таката (проба Таката, проба

Гросса, сулемовая проба); тимоловая проба;

кефалин-холестериновая проба; цинк-сульфат-

ная (Кункеля) проба; реакция Вельтмана; зо-

лото-коллоидальная проба. Наибольшее диагно-

стическое значение при заболевании печени име-

ет тимоловая проба. Тимоловая проба предло-

жена в 1944 г. Маклаганом. Тимоловый реактив

представляет собой насыщенный водный рас-
твор тимола в буфере. Химическая сущность

тимоловой пробы окончательно не выяснена.

Считают, что проба является положительной

при уменьшении альбуминов и увеличении (3- и

у-глобулинов.

Способ приготовления тимолового реактива

и вид буфера могут влиять на результаты. Тимо-

ловый реактив в вероналовом буфере, предло-

женный Маклаганом, неустойчив. Повысить ус-

тойчивость реактива можно различными спосо-

бами. Хуэрго и Поппер предложили модифици-

ровать оригинальный реактив Маклагана, изме-

н и в способ его приготовления (тимол добавля-

ется к вероналовому буферу в форме концентри-

рованного спиртового раствора).

Позднее было предложено заменить верона-

ловый буфер трис-буфером, который в сочета-

нии с НС1 и малеиновой кислотой увеличивает

стабильность реактива. Немаловажное значение

имеет оптимизация условий определения. Реак-

ция более чувствительна при рН 7,55 и темпе-

ратуре 23—25 °С.

Оценку помутнения, возникшего в ходе реак-

ции, можно проводить визуально или турбиди-

метрически. Предложены различные суспензии

для построения калибровочной кривой. Чаще

других применяют бариево-сульфатный реактив.

Тимоловая и сулемовая пробы и проба Вельт-

мана утверждены в качестве унифицированных

в 1972 г.

Тимоловая проба (унифицированный метод).

П р и н ц и п . При взаимодействии сыворотки

с тимолово-вероналовым раствором появляется

помутнение вследствие образования глобулино-

тимоло-липидного комплекса.

Р е а к т и в ы . 1. Тимол, 100 г/л спиртовой

раствор: 10 г очищенного тимола растворяют

в 96 % этиловом спирте в мерной колбе вме-

стимостью 100 мл. Очистка тимола: 100 г тимола

ч. растворяют в 100 мл 96 % этилового спирта,

фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холод-

ной воды, сильно встряхивают и оставляют сто-

ять на 20 мин. Затем фильтруют; кристаллы,

оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза хо-

лодной водой, сушат до постоянной массы вна-

чале на фильтровальной бумаге, затем в течение

2—3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом

кальция. 2. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота

(веронал), фарм. 3. 5,5-Диэтилбарбитуровой ки-

слоты натриевая соль (мединал), фарм. 4. Бу-

ферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г меди-

нала растворяют и доводят до 1 л водой. Хранят

в холодильнике; при появлении осадка раствор

негоден к употреблению. 5. Тимолово-веронало-

вый буфер рН 7,55—7,6: в мерной колбе вмести-

мостью 100 мл смешивают 80 мл буферного

раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора

тимола, встряхивают и доливают буферным рас-

твором до метки. Проверяют рН. 6. Бария хло-

рид ч. д. а. или х. ч. 7. Калибровочный раствор.

а) Раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида

бария (ВаСl

2

-2Н

2

О) растворяют и доводят до

100 мл водой, б) Серная кислота х. ч.,0,1 моль/л.

Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хло-

рида бария наливают в мерную колбу вмести-

мостью 100 мл и доводят объем до метки

179

0,1 моль/л раствором серной кислоты при тем-

пературе 10 °С (при этой температуре размеры

частиц преципитированного сульфата бария

дают относительно стабильный результат). Сус-

пензию сульфата бария готовят перед употреб-

лением.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 6 мл тимолово-

вероналового буферного раствора прибавляют

0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и

затем измеряют оптическую плотность при дли-

не волны 630—690 нм (красный светофильтр)

против тимолово-вероналового буфера в кюве-

тах с толщиной слоя 1 см. Реакцию проводят

при комнатной температуре.

Р а с ч е т ведут по калибровочному гра-

фику.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а : из калибровочного раствора суль-

фата бария (суспензии) готовят разведения,

соответствующие единицам помутнения по
Шенк — Хогланд. Калибровочные растворы хо-

рошо встряхивают и тотчас при длине волны

630—690 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см

против воды измеряют.

Суспензия

BaSO

4

, мл

1,35

2,7

5,4

0,1 моль/л раст-

вор НаSО

4

, мл

4,65
3,3
0,6

Единицы

помутнения

5

10

20

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 0—4 ед.

П р и м е ч а н и е . Можно использовать го-

товый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоло-

вая проба» («Лахема», ЧССР), в состав которо-

го входят трис-буфер и малеиновая кислота.

Л и т е р а т у р а . Huerga J., Popper H.

J. Lab.  c l i n . Med., 1949, vol. 34, p. 877; Shank R.,

Hoagland C. J. biol. Chem., 1946, vol. 162, p. 33.

Сулемовая проба (унифицированный метод).

П р и н ц и п . Сулема в присутствии мелкодис-

персных коллоидов (белков) образует коллои-

дальный раствор солей ртути. Нарушение дис-

персности белковых фракций сыворотки крови

вызывает осаждение грубодисперсных частиц.

Р е а к т и в ы . 1. Сулема, 1 г/л раствор:

0,1 г двухлористой ртути растворяют в воде

в мерной колбе вместимостью 100 мл. 2. Натрия

хлорид, 154 ммоль/л.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,5 мл сыворотки

добавляют 1 мл 154 ммоль/л раствора NaCl

и титруют 1 г/л раствором сулемы. После появ-

ления первоначально обратимого помутнения

титруют медленно с интервалом 20—30 с до

стойкого помутнения (через вертикальный слой

жидкости нельзя прочитать газетный текст).

Результаты сулемовой реакции выражают в ко-

личестве миллилитров раствора сулемы, пошед-

ш и х на титрование.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 1 , 6 — 2 , 2  м л

сулемы.

Л и т е р а т у р а . Grinstedt F. Acta med

Scand., 1948, vol. 131, p. 66.

Проба Вельтмана (унифицированный ме-

тод).  П р и н ц и п . При добавлении к сыворотке

крови раствора хлорида кальция и нагревании

происходит нарушение коллоидальной устойчи-

вости сыворотки.

Р е а к т и в ы .  1 . Кальция хлорид 0,5%.

Готовят из 10 % раствора хлорида кальция

(СаСl

2

 • 6Н

2

О), что соответствует 5 % раствору

безводного хлорида кальция. Точно определить

массу хлорида кальция невозможно из-за его

гигроскопичности, поэтому концентрацию раст-

вора определяют по относительной плотности;

5 % раствор безводного хлорида кальция имеет

относительную плотность 1,040. Для приготовле-

ния 10 % раствора хлорида  к а л ь ц и я 99,14 г
СаСl

2

 • 6Н

2

О доводят до 1 л бидистиллированной

водой и растворяют, затем измеряют относитель-

ную плотность и путем дальнейшего разведения

доводят относительную плотность до 1,040.

Из полученного раствора, разведя его в 10 раз,

готовят 0,5 % раствор хлорида кальция. Для

приготовления 0,5 % раствора можно использо-

вать ампулированный раствор хлорида каль-

ция. Если относительная плотность ампулиро-

ванного раствора 1,040, то 0,5 % раствор гото-

вят разведением ампулированного раствора

в 10 раз.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 0,1 мл сыворотки

прибавляют 4,9 мл воды, перемешивают, опро-

кидывая пробирку, и прибавляют 0,1 мл 0,5 %

раствора хлорида кальция, встряхивают и на-

гревают пробирку над пламенем до однократ-

ного закипания смеси. Охлаждают пробирку и

смотрят на свету. Если хлопьев нет, то в эту же

пробирку добавляют еще 0,1 мл хлорида каль-

ция и вновь кипятят. Процедуру повторяют,

пока не выпадут хлопья.

Результаты оценивают, подсчитывая общее

количество пошедшего на реакцию хлорида

кальция.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В норме

коагуляция наступает при прибавлении 0,4—

0,5 мл раствора хлорида кальция.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Результа-

ты осадочных проб могут быть патологическими

при заболеваниях печени, а также при других

заболеваниях, сопровождающихся диспротеине-

миями. Поэтому их следует расценивать в соче-

тании с другими лабораторными тестами и кли-

ническими симптомами. Наиболее специфичной

для поражения печени является тимоловая про-

ба, она бывает положительной раньше появле-

ния желтухи. Сулемовая проба чаще бывает

положительной при циррозе печени, токсических

поражениях печени, силикозе. В пробе Вельт-

мана коагуляция наступает при прибавлении

меньшего количества раствора хлорида кальция

при паренхиматозном поражении печени, маля-

180

р и и . Коагуляция мри прибавлении большего

количества раствора хлорида кальция наблюда-

ется при ревматизме, туберкулезе  л е г к и х .

Л и т е р а т у р а . Weltmann О, Med. Klin.,

1930, vol. 26, p. 240; Weitmann O. Wicn.  k l i n .

Wschr., 1930, vol.  1 1 , p. 1301.

5.2.  Ф Е Р М Е Н Т Ы

5.2.1. Общая часть

В основе многих болезней лежат  н а р у ш е н и я

нормального функционирования ферментатив-

ных процессов. Изменения в специфических фер-

м е н т а т и в н ы х реакциях можно идентифициро-

вать как  п р и ч и н у или следствие различных пато-

логических состояний. Эта взаимосвязь наибо-

лее отчетливо выявляется при некоторых врож-

денных нарушениях метаболизма. Большинство

ферментов, катализирующих химические реак-

ции, протекающие в живом организме, нахо-

дятся в клеточной среде, тем не менее на основа-

нии результатов анализов внеклеточных жид-

костей (особенно плазмы или сыворотки крови)

можно сделать заключение об изменениях,

происходящих внутри клеток разных органов

и тканей.

Определяемая в норме активность ферментов

в сыворотке крови есть результат сбалансиро-

ванности скорости, с которой ферменты синте-

зируются внутри клеток и выходят из них, со

скоростью удаления ферментов из внеклеточной

жидкости путем инактивации и разрушения и их

экскреции. Изменения активности ферментов в

биологических жидкостях при заболеваниях мо-

гут быть обусловлены рядом  п р и ч и н .

Повышение активности может быть резуль-

татом ускорения процессов синтеза (например,

ЩФ при рахите, гепатите), некроза клеток

( н а п р и м е р , КК, АсАТ при инфаркте миокарда),

понижения выведения (например, ЩФ, ЛАП

при закупорке желчных путей), повышения про-

ницаемости клеточных мембран (например,

Ал AT, АсАТ при вирусном гепатите).

Понижение активности вызывается уменьше-

нием числа клеток, секретирующих фермент

(например, ХЭ при циррозе печени), недоста-

точностью синтеза (например, церулоплазмин

при болезни Вильсона), увеличением выведения

фермента (например, церулоплазмин при неф-

розе), торможением активности (например, ак-

тивности трипсина антитрипсином).

Наиболее важны с диагностической точки

зрения те изменения, которые обусловлены на-

рушением скорости образования ферментов или

высвобождением ферментов из поврежденных

или омертвевших клеток. Многие факторы спо-

собны повышать проницаемость мембран для

белков и таким образом вызывать «утечку»

внутриклеточных ферментов: уменьшение до-

ставки кислорода в клетку, истощение запаса

глюкозы в крови, лекарственные и химические

вещества. Если началось выделение ферментов

из клетки, то на скорость появления ферментов

в сыворотке крови воздействуют следующие

факторы: концентрационный градиент внутри

клетки и в сыворотке крови (например, для гепа-

тоцита соотношение концентраций равно 3000:

1 для ЛДГ и 10000:1 для АсАТ и  А л А Т ) ;

размер и форма молекул ферментов и величина

молекулярной массы; внутриклеточная локали-

зация ферментов. Важно также время полу-

распада фермента в плазме; оно может коле-

баться от нескольких часов до нескольких дней.

Ферменты, поступающие в плазму, могут быть

с п е ц и ф и ч н ы м и для плазмы и выполнять в ней

определенные физиологические функции. Их ак-

тивность в плазме больше, чем в клетках или

т к а н я х . К ним относятся: церулоплазмин, псев-

дохоли нэстераза, липопротеиновая липаза. Эти

ферменты синтезируются в печени и постоянно

высвобождаются в плазму. С диагностической

точки зрения они представляют интерес, когда

их активность в плазме ниже нормы за счет

нарушения функции печени.

Вторая группа ферментов, неспецифичных

для плазмы, не выполняет определенных физио-

логических  ф у н к ц и й в плазме. Их активность

в плазме гораздо ниже, чем в клетках и тканях.

К ним относятся: а) секретируемые ферменты;

б) ферменты, связанные с клеточным метабо-

лизмом. К секретируемым ферментам принадле-

жат липаза, а-амилаза, ЩФ. Эти ферменты

секретируются определенными органами (под-

желудочная железа, печень) и выводятся с мо-

чой, желчью. В норме их активность в плазме

относительно низка и постоянна. Однако при

патологии, если блокирован любой из обычных

путей экскреции, активность этих ферментов

в плазме значительно увеличивается (напри-

мер, повышение активности ЩФ в сыворотке

крови при закупорке желчевыводящих путей).

Основная группа ферментов — это ферменты

клеточного обмена, локализованные внутри кле-

ток в цитоплазме и клеточных структурах; в сы-

воротке крови их активность низка или они

вообще отсутствуют.

Основным принципом ферментной диагно-

стики является выбор оптимального спектра

ферментов, изменение активности которых

характерно для патологии определенных орга-

нов или тканей. Спектр ферментов для диагно-

стики заболеваний некоторых органов: сердце —

КК, ЛДГ, АсАТ; скелетные мышцы — КК, АЛД;

кости — ЩФ; кровь — ЛДГ

2

, ЛДГ

3

; поджелу-

дочная железа — а-амилаза, липаза; предста-

тельная железа — КФ; печень (желчные пу-

ти) — АлАТ, ГлДГ, ХЭ, ЩФ, 7-ГПТ. Очень

высокая активность ферментов в крови может

указывать на поражение определенного органа,

например, очень высокая активность АлАТ ука-

зывает на поражение печени. Имеет  з н а ч е н и е

и знание внутриклеточной локализации фермен-

тов, особенно для контроля за течением болезни.

Для ферментной диагностики важны также и

сведения о соотношении активности ферментов,

например, АсАТ к  А л А Т или КК к АсАТ. Опре-

181

деление активности органоспецифйческих фер-

ментов, т. е. ферментов, содержащихся только

в одном органе, например сорбитолдегидроге-

наза (печень), уроканиназа (печень), орнитил-

карбамилтрансфераза (печень), не имеет боль-

шого диагностического значения. Количество та-

ких ферментов ограничено, а активность их

в сыворотке крови очень низкая или они вообще

отсутствуют и не всегда определяются сущест-

вующими методами. Более важно для диагно-

стики определение изоферментов.

Фермент в целом, как правило, содержится

в ряде органов, а отдельные изоферменты орга-

носпецифичны. Особое значение в ферментной

диагностике имеет знание пределов нормальных

величин активности фермента, которые в значи-

тельной степени зависят от метода и условий

определения. В энзиммологии, как ни в какой

другой области, существует большое количество

единиц активности ферментов, несравнимых ме-

жду собой, поэтому стандартизация единиц

в клинической энзимологии — необходимое ус-

ловие для получения диагностически значимых

и сравнимых результатов лабораторных иссле-

дований.

Методические вопросы определения актив-

ности ферментов. Из-за низкой активности фер-

ментов в биологических жидкостях, а также из-

за трудности дифференциации различных фер-

ментов химическим способом на практике, как

правило, не применяется прямое химическое

определение активности ферментов, а измеря-

ется каталитический эффект ферментов путем

измерения скорости реакции, при которой суб-

страт под действием фермента превращается

в продукт реакции. Эта величина известна как

«скорость реакции» и при определенных усло-

виях прямо пропорциональна количеству при-

сутствующего фермента.

Чтобы понять механизм ферментативной ре-

а к ц и и , необходимо иметь представление о ее

кинетике, т. е. о тех законах, которым подчиня-

ется реакция, протекающая под действием

фермента. Строгое математическое описание ки-

нетики ферментативных реакций очень сложно.

Классические кинетические реакции могут иметь

различный порядок. Скорость реакции нулево-

го порядка зависит только от катализатора,

а не от концентрации реагирующих веществ.

Скорость реакции первого порядка зависит

от концентрации одного из реагирующих ве-

ществ. Реже встречаются реакции второго и

третьего порядка, скорость которых зависит от

двух или трех компонентов реакции соответ-

ственно. При высокой концентрации субстрата

скорость ферментативной реакции практически

не зависит от изменения концентрации субстра-

та. При этом в отношении субстрата реакция

приобретает нулевой порядок, происходит насы-

щение фермента субстратом. При этих условиях

скорость реакции зависит только от активности
фермента.

Исследование эффекта насыщения привело

L. Michaelis, M. Menten в 1913 г. к созданию

общей теории кинетики ферментативных реак-

ций, которой установлена зависимость между

скоростью ферментативной реакции и концен-

трацией субстрата согласно уравнению Михаэ-

лиса — Ментен. Константа Михаэлиса (Км)

характеризует степень сродства фермента с суб-

стратом и представляет собой концентрацию

субстрата, при которой скорость ферментатив-

ной реакции равна половине максимальной.

О с н о в н ы е  т р е б о в а н и я ,  п р е д ъ -

я в л я е м ы е к  ф е р м е н т а т и в н о й  р е -

а к ц и и . Активность фермента необходимо оп-

ределять в условиях насыщения фермента суб-

стратом; до конца измерения должна быть из-

расходована только небольшая часть субстрата;

субстрат не должен содержать примесей, влия-

ющих на определение.

Ф а к т о р ы ,  в л и я ю щ и е  н а  а к т и в -

н о с т ь  ф е р м е н т о в . Температура, вид суб-

страта и его концентрация; вид буфера и его

концентрация; рН; наличие активаторов и ин-

гибиторов.

Ферментативная реакция чувствительна к

изменениям температуры. При повышении тем-

пературы энергия теплового движения молекул

увеличивается, в результате чего число молекул,

способных достичь переходного состояния, т. е.

подвергнуться действию фермента, возрастает,

при дальнейшем повышении температуры может

наступать инактивация ферментов. Температур-

ный коэффициент скорости реакции равен при-

близительно 10 % на 1 °С. Это значит, что при

повышении температуры на 1 °С активность

фермента увеличивается на 10 %. Однако при

значительном повышении температуры скорость

реакции снижается из-за денатурации белка.

В 1961 г. Международный биохимический

союз рекомендовал измерять активность фер-

мента при температуре 25 °С, в 1964 г. эти реко-

мендации были изменены на 30 °С. Междуна-

родная согласованность температуры измерения

активности ферментов является предпосылкой

для международной стандартизации методов,

так как при разной температуре оптимальные

значения рН, концентрации буфера, субстрата

и других параметров реакции различны.

Главное свойство ферментов, отличающее их

от других катализаторов,— высокая специфич-

ность; фермент вступает в реакцию только с оп-

ределенным химическим веществом — субстра-

том. Некоторые ферменты обладают почти абсо-

лютной специфичностью по отношению к дан-

ному субстрату. Так, ЛДГ специфична к L-лак-

тату, глутаматдегидрогеназа — к L-глутамату.

Специфичность других ферментов выражена не

столь сильно — их действие простирается обыч-

но на определенную группу веществ. К таким

ферментам относятся фосфатазы, пептидазы.

Для определения активности ферментов в ря-

де случаев применяют синтетические субстраты,

так как иногда бывает трудно определить физи-

ологический субстрат или продукты распада

синтетического субстрата определить легче, чем

физиологического. Как указано ранее, при оп-

ределенной концентрации субстрата достигается

максимальная скорость реакции. Рассчитать

концентрацию субстрата, при которой достига-

ется максимальная скорость реакции, можно

теоретически, исходя из уравнения Михаэли-

са — Ментен.

182