Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 43

предварительной обработки исследуемого мате-

риала (инкубации с плазмином, стрептокина-

зой, проактиватором) или стандартных  п л а с т и н

фибрина (прогревания), тромбоэластографиче-

скими, казеинолитическими. амидолитическими

(см. введение перед 4.4.11), иммунологически-

ми, иммунохимическими и некоторыми другими

методами.

О фибринолитической активности крови

можно судить также по содержанию в ней про-

дуктов деградации фибриногена/фибрина

(ПДФ). Повышение уровня ПДФ рассматри-

вается как один из основных лабораторных

признаков гиперфибринолиза. Наибольшее кли-

ническое значение имеют общеоценочные ме-

тоды, методы фибриновых пластин и методы

определения в крови ПДФ.

4.5.1. Время лизиса

эуглобулиновых сгустков

Унифицированный метод (1974).  П р и н -

ц и п . Измеряется время спонтанного лизиса

сгустка, получаемого из эуглобулиновой фрак-

ции бестромбоцитной  п л а з м ы при добавлении

к ней раствора хлорида  к а л ь ц и я .

Р е а к т и в ы . 1. 1,34% раствор оксалата

натрия или 3,8 % раствор цитрата натрия

(см. 4.1.). 2. 1 % раствор уксусной кислоты.

3. Боратный буфер рН 9,0; растворяют 1 г буры

(Na

2

B

4

O

7

- 10Н

2

О) и 9 г NaCI в 1 л дистиллиро-

ванной воды. 4. 0,025 моль/л раствор хлорида

кальция (см. 4.4.2). 5. Дистиллированная вода.

О б о р у д о в а н и е . Водяная баня на 37°С.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Бестромбоцитная плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку нали-

вают 8 мл дистиллированной воды, 0,15 мл

уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы.

Перемешивают содержимое и ставят в холодиль-

ник (4 °С) на 30 мин. Смесь центрифугируют

в течение 5 мин при 1500 об/мин, сливают над-

осадочную жидкость и удаляют остатки жид-

кости опрокидыванием пробирки на фильтро-

вальную бумагу. Вводят в пробирку 0,5 мл

боратного буфера и, осторожно помешивая

палочкой, растворяют осадок эуглобулинов. Две

пробы по 0,2 мл переносят в 2 другие пробирки,

ставят их в водяную баню и добавляют в каж-

дую пробирку по 0,2 мл раствора хлорида каль-

ция. Через несколько минут в пробирках обра-

зуются сгустки, и с этого момента начинают от-
счет времени растворения сгустков. В ответе

приводят средний результат.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 3—5  ч .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Укороче-

ние времени растворения сгустков указывает на

повышение фибринолитической активности, уд-

линение — на снижение.

П р и м е ч а н и е . Метод может применять-

ся в качестве общеоценочного и для изуче-

ния способности фибринолитической системы

к активации. В последнем случае опреде-

ляют время лизиса эуглобулиновых сгустков

до и после венозного стаза. Венозный стаз

осуществляется путем наложения манжеты

сфигмоманометра на плечо и поддержания

в ней минимального артериального давления

(обычно 80 мм рт. ст.) в течение 10—20  м и н .

Вторую пробу крови берут из локтевой вены

руки, на которую наложена манжета, не-

посредственно перед ее снятием. Время ли-

зиса эуглобулиновых сгустков после веноз-

ного стаза укорачивается в норме в 1,5—2

раза в зависимости от длительности стаза.
Л и т е р а т у р а . Андреенко Г. В., Кара-

басова М. А., Лютова Л. В. и др. Методы иссле-

дования фибринолитической системы крови.—

М.: Изд-во Московск. ун-та, 1981, с. 40—42.

4.5.2. Методы, основанные

на применении фибриновых пластин

Эти методы используются для исследования

активности отдельных компонентов системы

фибринолиза. Наибольшее их число может быть

определено путем одновременного изучения ли-

зиса стандартных непрогретых и прогретых

фибриновых пластин под действием плазмы и ее

эуглобулиновой фракции, подвергавшихся и не

подвергавшихся обработке стрептокиназой.

Определение активности плазмина и актива-

тора плазминогена но Аструпу и соавт. П р и н-

ц и п. Измеряется зона (площадь) лизиса стан-

дартного слоя фибрина (фибриновой пластины)

на месте нанесения плазмы и/или ее эуглобу-

линовой фракции.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. 0,85 % раствор хлорида натрия.

3. 0,3 % раствор бычьего фибриногена в 0,85 %

растворе хлорида натрия (см. 4.4.6). 4. Раствор

тромбина в 0,85 % растворе хлорида натрия с

активностью 8—10 с (см. 4.4.6).

О б о р у д о в а н и е . 1. Столик с уровнем.

2. Чашки Петри.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Бестромбоцитная плазма и/или ее эуглобули-

новая фракция (см. 4.5.1).

П р и г о т о в л е н и е  ф и б р и н о в о й

п л а с т и н ы . Наливают в пробирку или кол-

бочку 9 мл 0,85 % раствора хлорида натрия,

взвешивают нужное количество фибриногена,

высыпают его в пробирку (колбочку) с 0,85 %

раствором хлорида натрия и ставят пробирку
на 1 ч в термостат при 37 °С. Периодически про-

бирку достают из термостата и осторожно вст-

ряхивают, добиваясь полного растворения фиб-

риногена. После этого в пробирку с раствором

фибриногена добавляют 0,2 мл раствора тром-

бина и быстро выливают содержимое в чашку

Петри, установленную на ровной горизонталь-

ной поверхности. Под действием тромбина фиб-

риноген превращается в фибрин и застывает

тонким слоем. Через 1 —1'/2 ч после образова-

ния фибрина пластины пригодны для работы.

Их можно хранить в течение 7—10 дней при

4—6 °С на ровной поверхности, проложив меж-

ду чашкой и крышкой увлажненную водой

фильтровальную бумагу.

А .  Х о д  о п р е д е л е н и я  с у м м а р н о й

а к т и в н о с т и  п л а з м и н а и  а к т и в а -

171

т о р а п л а з м и н о г с н а. На фибриновую

пластину наносят 0,03 мл плазмы (эуглобули-

ноиой  ф р а к ц и и ) , закрывают чашку Петри крыш-

кой, выстланной изнутри увлажненной фильтро-

в а л ь н о й бумагой, и помещают чашку на 18—

24 ч в термостат при 37 °С. После чтого изме-

ряют площадь лизиса, которая и отражает ак-

тивность плазмина и активатора плазминогена.

Площадь лизиса обычно характеризуется произ-

ведением двух перпендикулярных диаметров и

выражается в квадратных миллиметрах.

Б .  Х о д  р а з д е л ь н о г о  о п р е д е л е -

н и я  а к т и в н о с т и  п л а з м и н а и  а к т и -

в а т о р а  п л а з м и н о г е н а . Готовят одно-

временно две фибриновые пластины, после чего

одну из пластин прогревают в течение 30 мин

при 85 "С, что приводит к разрушению  п л а ч -

миногена, содержащегося в этой  п л а с т и н е .

Таким образом, одна из пластин лишается суб-

страта для действия активатора плазминогена,

имеющегося в исследуемом материале. Затем
на обе пластины наносят по 0,03 мл плазмы

(эуглобулиновойфракции) и, как описано ранее,

определяют фибринолитическую активность ис-

следуемых образцов на обеих пластинах. За ак-

тивность плазмина п р и н и м а е т с я площадь лизиса

на прогретой пластине, а за активность актива-

тора плазминогена — разность между площа-

дями лизиса на непрогретой и прогретой пла-

стинах.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Актив-

ность активатора плазминогена в крови состав-

ляет 25—35  м м

2

, а  а к т и в н о с т ь  п л а з м и н а - 8-

15 мм

2 .

К л и н п ч с с к •.) е з и а ч с н и с. Уменьше-

ние зон лизиса  у к а з ы в а е т на  с н и ж е н и е актив-

ности определяемых компонентов, а увеличе-

ние на

 повышение.

Л и т е р а т у р а . Андреепко Г. В., Карабч

сова М. А., Лютооа Л. В. и др. Методы иссле-

дования фибринолитической системы  к р о в и .

М.: Из-во Московск. ун-та, 1981, с. 43—45;

Коваленко А. Н. Дополнительные возможности

метода  с т а н д а р т н ы х фибриновых пластин.—

Лаб. дело, 1980, № 10, с. 615—618.

4.5.3. Продукты деградации

фибрина  ( П Д Ф )

Описаны неиммунологические и иммуноло-

г и ч е с к и е методы определения содержания ПДФ

в сыворотке крови. Первые основаны на осаж-

дении ПДФ  ( н а г р е в а н и е м , охлаждением, прота-

м и п а сульфатом), на способности ПДФ инду-

цировать склеивание стафилококков или на

антиполимеризационном и антитромбиновом

д е й с т в и и ПДФ. Иммунологические методы осно-

ваны на применении антифибриногеновой сы-

воротки или сыворотки, содержащей антитела

к отдельным фрагментам фибрина. Пред-

ложены иммунодиффузионные, иммуноэлектро-

форетические, радиоиммунные и т. п. методы, а

также методы, основанные на исследовании аг-

глютинации частиц латекса, г е м а г г л ю т и н а п и и и

торможении гемагглютинации.

Проба с протамина сульфатом для обна-

ружения ПДФ в крови. П р и н ц и п. Наблю-

д а ю т зa образованием осадка в сыворотке крови

после добавления к ней 1 % раствора  п р о т а м и н а

сульфата, обладающего способностью осаждать

р а н н и е ПДФ.

Р е а к т и в ы . 1 % раствор протамина суль-

фата.

О б о р у д о в а н и е .  1 . Водяная баня  н а

37 "С. 2. Секундомер.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая сыворотка крови (см.  4 . 1 ) .

Х о д о п р е д е л е н и я. В пробирку наби-

рают 0,4 мл сыворотки и добавляют 0,1 мл рас-

твора  п р о т а м и н а сульфата. Перемешивают со-

л с р ж и м о е и ставят пробирку в водяную баню.

Через 5 мин пробирку вынимают и читают ре-

зультат. Образование геля, нитей или хлопьев

у ч и т ы в а ю т как положительный результат («1»),

а помутнение или зернистость — как отрица-

тельный результат («О»).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы. Помутне-

ние или зернистость (отрицательный резуль-

тат

 - «О»).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . 11оложи-

тельный результат («1») указывает на увеличе-

ние содержания ПДФ в сыворотке, что явля-

ется одним из лабораторных критериев патоло-

гического внутрисосудистого свертывания кро-

ви. Проба становится положительной при кон-

ц е н г р а ц и и ПДФ 0,015 г/л (15  м к г / м л ) и более.

Л и т е р а г \ р а. ГиПитов С. 3., Ворони-

на И. Е., Литвинов Р. И. Два простых способа

о б н а р у ж е н и я  п р о д у к т о в деградации фибрина

в кровию - Лаб. дело, 1982. ,№6 с. .454 - 356.

Иммунодиффузионный метод определения

ПДФ. П р и н ц и н. Наблюдают за образовани-

ем дуг  п р е ц и п и т а ц и и в агаровой пластине, на

которую наносят на определенном расстоянии

друг от друга исследуемую и антифибриногено-

вую сыворотки.

Р е а к т и в ы .  I . Агар-агар волокнистый.  2 .

Веронал-ацетатный буфер рН 8,6,  и о н н а я сила

0,5 ц. В небольшом количестве доведенной до

к и п е н и я дистиллированной воды растворяют

9,25 г диэтилбарбитуровой кислоты, охлаждают

раствор, добавляют 6,5 г ацетата  н а т р и я и 1,88 г

NaOH и доводят дистиллированной водой общий

объем до 1 л. Если рН отличается от 8,6, путем

добавления слабых (0,1 моль/л) растворов HCI

или NaOH доводят его до этой величины. 3. Ан-

тифибриногеновая сыворотка. 4. Фибриноген че-

ловека или бестромбоцитарная плазма с извест-

ной концентрацией  а н т и г е н а фибриногена.

О б о р у д о в а н и е .  Ч а ш к и Петри и трубча-

тые резцы, позволяющие сделать в агаровой

пластине одно центральное отверстие диаметром

8 мм и 6 периферических отверстий диаметром

4 мм, расположенных на одинаковом расстоянии

от центрального отверстия и друг от друга.

Расстояние между центральным и периферичсг

ким отверстием должно составлять не менее

7 мм.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая сыворотка крови (см.  4 . 1 ) .

172

П р и г о т о в л е н и е  а г а р о в о й  п л а -

ст и н ы. В пробирке или колбочке готовят 1,5 %

раствор агара на веронал-ацетатном буфере

с добавлением мертиолата в концентрации

1:10000, разогревают его в бане с  к и п я щ е й

водой до гомогенного состояния, после чего

10 мл расплавленного агара выливают в чашку

Петри, установленную на ровной горизонталь-

ной поверхности. Когда агар станет твердым,

в нем делают трубчатыми резцами отверстия

(обычно в чашке Петри делают 14 отверстий:

2 центральных и вокруг каждого из них по 6 пе-
риферических).

О п р е д е л е н и е  ч у в с т в и т е л ь н о -

с т и  а н т и ф и б р и н о г е н о в о й  с ы в о -
р о т к и . Готовят 0,2 % (2 г/л) раствор очищен-

ного фибриногена человека в веронал-ацетатном

буфере. Разводят его веронал-ацетатным буфе-

ром, готовят растворы с  к о н ц е н т р а ц и я м и фибри-

ногена 1; 0,5; 0,25; 0,125 и т.д. до 0,008 г/л

(8  м к г / м л ) . В центральные отверстия вносят

по 0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пе-

риферические — по 0,05 мл приготовленных рас-

творов фибриногена. Агаровые пластины остав-

ляют на сутки при комнатной температуре во

влажной камере, а затем определяют наимень-

шую концентрацию фибриногена, образующую

дугу преципитации с антифибрин9геновой сыво-

роткой. Эта концентрация и характеризует чув-

ствительность антифибриногеновой сыворотки.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Исследуемую сыво-

ротку разводят в 2; 4; 8; 16 и 32 раза. Вносят

в центральные отверстия агаровой пластины по

0,1 мл антифибриногеновой сыворотки, а в пери-

ферические — исследуемую сыворотку и ее раз-

личные разведения. Через сутки  и н к у б а ц и и чаш-

ки Петри при комнатной температуре опреде-

ляют наибольшее разведение сыворотки, кото-

рое еще образует дугу преципитации. Рассчи-

тывают концентрацию ПДФ по формуле:

С = А • В, где А — чувствительность антифибри-

ногеновой сыворотки  ( м и н и м а л ь н а я концентра-

ция антигена фибриногена, которая может быть

определена с  п р и м е н е н и е м имеющейся антифиб-

риногеновой сыворотки); К - предельное разве-

дение исследуемой сыворотки, при котором еще

образуется дуга преципитации с антифибрино-

геновой сывороткой; С — концентрация ПДФ

в исследуемой сыворотке.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоровых

людей ПДФ этим методом не обнаруживаются,

так как их концентрация находится за предела-

ми чувствительности метода (менее 8  м к г / м л ) .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Увеличе-

ние концентрации ПДФ наблюдается при мас-

с и в н ы х тромбозах или диссеминированном внут-

рисосудистом свертывании крови с вторичным

гиперфибринолизом и при лечении фибриноли-

тическими препаратами.

П р и м е ч а н и я . Чувствительность стан-

дартных антифибриногеновых сывороток, произ-

водимых в ГДР и ЧССР, составляет не менее

0,016 г/л (16  м к г / м л ) , что обеспечивает надеж-

ное  в ы я в л е н и е клинически значимого повыше-

ния уровня ПДФ (>=20 мкг/мл). При отсут-

ствии стандартной антифибриногеновой сыво-

ротки ее можно приготовить в лаборатории,

пользуясь известными методическими рекомен-

дациями.

Л и т е р а т у р а . Елизарова А. И., Федоро-

ва 3. Д. Получение антифибриногеновых сыво-

роток, применяемых для определения продуктов

распада фибриногена и фибрина.— Лаб. дело,

1971, № 12, с. 722- 724; Парадесва И. К..

Жукова И. В. Количественное определение

продуктов деградации фибриногена и фибрина

методом иммунодиффузии.— Лаб. дело, 1979,

№ 10, с. 590—592; Якунин Г. А., Смоляниц-

кий А.  Я . , Кургузое О. П., Грабский М. А.

Определение содержания антигена фибриноге-

на/фибрина в плазме и сыворотке крови методом

радиальной иммунодиффузии.— Лаб. дело,

1982, № 7, с. 24—26.

Р а з д е л 5

МЕТОДЫ  К Л И Н И Ч Е С К О Й  Б И О Х И М И И

5.1.  Б Е Л К И

5.1.1. Общий белок

Белки относятся к высокомолекулярным

соединениям; в их состав входит более 20 видов

а-аминокислот, соединенных между собой пеп-

тидной связью (СО  — N H ) . Различают простые

и сложные белки. Простые белки состоят только

из аминокислот, в сложные входят и другие

вещества: в липопротеиды — липиды, в глико-

протеиды — углеводы, в нуклеопротеиды — нук-

леиновые основания, в хромопротеиды — раз-

личные окрашенные соединения. Плазма крови

человека в норме содержит более 100 видов

белков. Примерно 90 % общего белка составля-

ют альбумин, иммуноглобулины, липопротеиды,

фибриноген, трансферрин; другие белки присут-

ствуют в плазме в небольших количествах.

Большинство специфических свойств белков

зависит от химического строения и пространст-

венной конфигурации макромолекул. Белки об-

ладают гидрофильными свойствами, т. е. имеют

большое сродство к воде, образуя с водой кол-

лоидные растворы, отличающиеся неустойчиво-

стью. Под влиянием разнообразных воздействий

белки легко выпадают в осадок. На этом свой-

стве белковых растворов основаны различные

осадочные пробы. Белки относятся к веществам,

обладающим амфотерными свойствами, т. е.

содержат кислые гидроксильные группы и основ-

ные аминогруппы, поэтому заряд их зависит от

рН раствора, что важно учитывать при электро-

форетическом разделении белков. В состав бел-

ков в среднем входит 16 % азота. В биологи-

ческих жидкостях определяют общий белок,

группы (фракции) белков, близкие по физичес-

ким и химическим свойствам, и индивидуаль-

ные белки. Для определения индивидуальных

белков наиболее чувствительны и специфичны

иммунологические методы, основанные на при-

менении специфических антисывороток.

Методы определения общего белка в сыво-

ротке крови основаны на различных принципах.

Азотометрические — на определении содержа-

щегося в нем азота (первый такой метод пред-

ложен J.  K j c l d c i h l в 1883 г.), весовые (гравимет-

рические) на высушивании белков до постоян-

ной массы и последующем взвешивании на  а н а -

литических весах; спектрофотометрические —

на определении поглощения при 280 нм; фото-

метрические — на измерении окрашенных про-

дуктов реакции; рефрактометрические — на

определении на рефрактометре коэффициентов

рефракции или преломления света.

Наиболее распространены рефрактометри-

ческие и фотометрические биуретовые методы.

Биуретовый реактив был предложен в 1848 г.

Однако эта реакция для определения общего

белка в сыворотке крови стала широко приме-

няться значительно позже. В биуретовой реак-

ции атом меди связывает атомы азота белка

с образованием цветных соединений. Первые

биуретовые реактивы состояли из медного купо-

роса и едкого натра. Концентрация щелочи

может быть различной. Наибольшее распростра-

нение получил биуретовый реактив Вейксель-

баума с концентрацией щелочи 0,2 моль/л.

Включение тартрата калия и натрия в биурето-

вый реактив повысило его стабильность. Замена

тартрата калия и натрия на динатриевую соль

ЭДТА не дает особых преимуществ по сравне-

нию с реактивом Вейксельбаума, так же как и

использование предложенного Kingsley трифос-

фатбиуретового реактива с заменой едкого нат-

ра трифосфатом натрия. Увеличение концентра-

ции сульфата меди незначительно влияет на ре-

зультаты определения белка. Биуретовая реак-

ция чувствительна к температуре. Повышение

температуры увеличивает скорость развития ок-

раски, которая достигает максимума через

5 мин. На данном принципе основано определе-

ние общего белка в сыворотке крови в поточных,

дискретных и центрифужных автоанализаторах.

В биуретовом методе Лоури чувствитель-

ность выше за счет сочетания биуретовой реак-

ции с реакцией Фолина с применением реактива

Фолина — Чиокольтео. В фотометрических биу-

ретовых методах для получения правильных

результатов важным является выбор калибро-

вочного материала, учитывая, что общий белок

состоит из индивидуальных белков различного

состава. Некоторые естественные белки,  н а п р и -

мер альбумин человеческой и бычьей сывороток,

могут быть использованы в качестве калибро-

вочных материалов. Белки для калибровочного

материала должны быть хорошо охарактеризо-

ваны и иметь концентрацию не менее 70 г/л.

Унификация методов. Биуретовый метод оп-

ределения общего белка в сыворотке крови был

утвержден в качестве унифицированного в

1972 г. В СССР выпускается «Набор химических

реактивов для определения общего белка в сыво-

ротке крови по биуретовой реакции». Набор со-

здан для унифицированного метода; в качестве

калибровочного материала использован ампули-

174