Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 48

5.2.3. а-Амилаза

а-Амилаза (1,4-а-D-глкжан глюканогидро-

лаза, К. Ф. 3.2.1.1) — один из первых открытых

ферментов; катализирует эндогидролиз а-1,4-

глюкозидных связей крахмала, гликогена и род-

ственных им полисахаридов до мальтозы,

декстринов и других полимеров. У человека

а-амилаза секретируется поджелудочной и слюн-

ными железами, небольшая ее активность об-

наруживается в тканях печени и скелетной

мускулатуры. Молекулярная масса а-амилазы

относительно низкая (~ 48000); в отличие от

большинства ферментов она фильтруется в

клубочках почек и содержится в моче. а-Амила-

за состоит из двух изоферментов: панкреати-

ческого (Р-тип) и слюнного (S-тип), каждый

из которых делится на несколько фракций.

Изоферменты происходят соответственно из под-

желудочной и слюнной желез. Существует

также макроамилаза, которая не выделяется

почками из-за большой величины молекулы, но

может встречаться в сыворотке крови в норме

и при патологии. У здоровых людей в сыворотке

крови около 70 % амилолитической активности

приходится на слюнной изофермент, в моче

приблизительно такой же процент приходится

на панкреатическую изоамилазу. Два изофер-

мента а-амилазы имеют почти идентичные ката-

литические и иммунологические свойства, незна-

чительно отличаются по электрофоретической

подвижности, но разделяются при гель-фильтра-

ции на ДЭАЭ-сефадексе.

Методы определения а-амилазы в биологи-

ческих жидкостях.основаны на различных прин-

ципах: сахарифицирующие или редуктометри-

ческие методы — на определении образующихся

из крахмала Сахаров (метод Энгельгардта —

Герчука, 1925); амилокластические — на опре-

делении остатка нерасщепленного крахмала по

степени интенсивности его окраски с йодом (ме-

тоды Самоги, Смита — РОЭ, Каравея). Амило-

кластические методы более чувствительны и

специфичны, чем редуктометрические, но также

не лишены недостатков: точность их во многом

зависит от качества крахмала и оптимизации

условий определения.

Вискозиметрические методы основаны на

измерении вязкости суспензии крахмала. Они

не отличаются высокой точностью и редко при-

меняются. Методы с применением хромогенных

субстратов основаны на использовании. ком-

плексов субстрат-краситель, которые под дей-

ствием а-амилазы распадаются с образованием

водорастворимого красителя. К новым методам

определения активности а-амилазы относятся

методы, основанные на сопряженных фермент-

ных реакциях.

Наиболее перспективными являются фото-

метрические методы с применением субстра-

тов — п-нитрофенилмальтозида или п-нитрофе-

нилмальтогептозида.

Зарубежными фирмами выпускаются наборы

реактивов с применением хромогенных субст-

ратов; реже наборы реактивов, основанные на

сопряженных ферментных реакциях. Для опре-

деления изоферментов а-амилазы наиболее

точными являются электрофоретические

методы.

Оптимизация условий определения и унифи-

кация методов. В качестве субстрата в методах

определения а-амилазы чаще всего применяют

крахмал. Крахмал-полисахарид, состоящий на

10—20% из амилозы, имеющей 1,4-глюкозид-

ные связи и растворимой в воде, и амилопек-

тина, нерастворимого в воде, имеющего, кроме

того, 1,6-глюкозидные связи. Содержание

амилозы в различных препаратах крахмала

варьирует, поэтому качество крахмала имеет

большое значение. Предпочтительнее использо-

вать крахмал, обладающий лучшей раствори-

мостью и дающий  н а и в ы с ш у ю интенсивность

окраски с иодом. В качестве субстрата мшгут

быть использованы также амилоза, мальто-
триоза. Оптимум рН действия фермента на-

ходится в пределах значений от 6,5 до 7,5.

Активность фермента значительно возрастает в

присутствии ионов хлора. В молекулу а-амилазы

входит атом кальция. Ионы кальция не только

активизируют а-амилазу, но и предохраняют

ее от потери активности и распада под влиянием

протеолитических ферментов.

Ингибирование активности а-амилазы фто-

ридами, цитратом, оксалатом и ЭДТА объясня-

ется связыванием ионов кальция. Вид буфера

не влияет на активность фермента. В большинст-

ве стран применяются в качестве стандартных

амилокластические методы. В СССР в 1972 и

1974 гг. утверждены в качестве унифицирован-

ных два амилокластических метода: Смита —

Роя и Каравея.

Унифицированный амилокластический метод

со стойким крахмальным субстратом (Каравея).

П р и н ц и п. а-Амилаза гидролизует расщепле-

ние крахмала с образованием конечных про-

дуктов, не дающих цветной реакции с йодом.

Об активности а-амилазы судят по уменьше-

нию  и н т е н с и в н о с т и окраски.

191

Р е а к т и в ы .  1 . Бензойная кислота ч.д.а.

или х.ч. 2. Натрия фосфат двузамещенный без-

водный (Na

2

HPO

4

) ч.д.а. 3. Крахмал раствори-

мый для нефелометрии или крахмал по Lintner.

Крахмал по  L i n t n e r выпускается зарубежными

ф и р м а м и специально для использования его

в качестве субстрата при определении а-амила-

зы. 4. Натрия хлорид, 0,154 моль/л. 5. Субстрат-

но-буферный раствор рН 7,0: 13,3 г Na

2

HPО

4

и 2 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл

0,154 моль/л хлорида натрия и доводят до

кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крах-

мала в небольшом количестве холодной воды

и вводят в  к и п я щ и й буферный раствор. Кипятят

1  м и н , охлаждают и доводят водой до 500 мл.

Стабилен при хранении при комнатной темпера-

туре в течение 10—12 дней. Субстратно-буфер-

ный раствор должен быть прозрачным. 6. Калия

йодид ч.д.а., х.ч. 7. Калий йодноватокислый

ч.д.а., х.ч. 8. Калия фторид ч.д.а. 9. HCI кон-

центрированная, х.ч. 10. 0,01 н. раствор йода:

0,036 г йодноватокислого калия и 0,45 г йодида

калия растворяют в 40 мл воды и медленно при

помешивании добавляют 0,09 мл концентри-

рованной НС1. 5 г фторида калия растворяют

в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу,

приливают 40 мл раствора йода и доливают

водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного

стекла. Годен в течение месяца. Если в рабочий

раствор йода не добавляют фторид калия, то

его следует готовить ежедневно.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая сыворотка или плазма крови, моча или

дуоденальное содержимое, предварительно раз-

веденное 154 ммоль/л раствором хлорида натрия

в 100 раз.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  М и к р о в а р и а н т .

Опытная проба: 0,5 мл субстратно-буферного

раствора помещают в пробирку, нагревают

5 мин при 37 °С, добавляют 0,01 мл биологи-

ческой жидкости. Инкубируют 7,5 мин при

37 °С. Время  и н к у б а ц и и следует строго отсчиты-

вать по секундомеру с момента добавления био-

логической жидкости в крахмальный субстрат.

Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл

0,1 н. раствора йода и доводят объем водой

до 5 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщи-

ной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм

(красный светофильтр) против воды.

Холостую пробу ставят так же, как опытную,

биологическую жидкость добавляют поело

инкубации вместе с 0,1 н. раствором йода. Изме-

ряют при тех же условиях, что и опытную

пробу, против воды.

М а к р о в а р и а н т . Ход определения

опытной и холостой проб тот же, что и при

микроварианте, но объем всех реактивов и ис-

следуемой жидкости увеличивают в 5—10 раз.

Р а с ч е т . Активность а-амилазы выражают

в миллиграммах или граммах крахмала, гидро-

лизованного 1 л биологической жидкости за

1 с  и н к у б а ц и и при 37 °С. Расчет производят

по формуле:

активность а-а.милазы,  м г / ( с • л) =

где Е

1

 — экстинкция холостой пробы; Е

2

 —

экстинкция опытной пробы; С — количество

к р а х м а л а , введенного в опытную и холостую

пробы (0,2 мг в микроварианте); / — коэффи-

циент пересчета на 1 с  и н к у б а ц и и ; К — коэф-

фициент пересчета на 1 л биологической жид-

кости с учетом разведения.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Сыворотка

крови: 3,3—8,9 мг/(с • л), или 12—32  м г / ( ч • мл).

Моча: до 44  м г / ( с •  л ) , или до 120  м г / ( ч • мл).

Дуоденальное содержимое: 1,7 -4,4  г / ( с •  л ) ,

или 6—16  г / ( ч • мл). Коэффициент пересчета

в единицы СИ —  м г / ( с • л) — равен 0,278.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициент

вариации 5—10 %. Линейность реакции сохра-

няется в течение 10 мин.

Л и т е р а т у р а . Caraway W. Т. Атег. J.

d i n .  P a t h o l . , 1959, vol. 32, p.'97.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Гиперами-

лаземия и гиперамилазурия наблюдаются при

многих заболеваниях, но наиболее выражены

при остром панкреатите, при котором активность

увеличивается в основном (до 90 % и более)

за счет панкреатического изофермента. При дан-

ном заболевании наибольший подъем содержа-

ния амилазы в крови и моче отмечен в первые

1—3 сут. Гиперамилазурию панкреатического

происхождения вызывают также такие заболе-

вания, как вирусный гепатит, рак поджелудоч-

ной железы. К гиперамилаземии непанкреати-

ческого происхождения относят поражение

слюнных желез,  п о ч е ч н у ю недостаточность.

П р и ч и н а м и повышения а-амилазы в крови

являются нарушение секреции желез, содержа-

щих а-амилазу, недостаточность выделения

почками  а м и л а з ы из организма. Имеется ряд

заболеваний, при которых трудно объяснить
наличие гиперамилаземии: холецистит, перито-

н и т , ожог, острый аппендицит.

Гиперамилаземию вызывают многие фарма-

кологические вещества — кортикостероидные

п р е п а р а т ы , силицилаты, тетрациклин, фуросе-

мид, гистамин. Для а-амилазы крови характер-

ны широкие внутри- и межиндивидуальныс

вариации. Наиболее информативным с диагно-

стической точки зрения является определение

панкреатической изоамилазы.

5.2.4. у-Глутамилтрансфераза

у-Глутамилтрансфераза [ (5-глутамил) -

пептид: аминокислота 5-глутамилтрансфераза,

у-глутамилтранспептидаза; К.Ф. 2.3.2.2] откры-

та в 1950 г.; выделена и очищена в 1963 г.

Фермент катализирует реакцию переноса у-глу-

тамилового остатка глутамиловой кислоты на

акцепторный пептид или на L-аминокислоту.

у-ГТФ содержится почти во всех органах чело-

века, наибольшая удельная активность опре-

деляется в ткани почек. Фермент не является

гомогенным, в зависимости от вида патологии

количество фракций может меняться.

Методы определения активности у-ГТФ

различаются по используемому субстрату. В пер-

вых методах применялись физиологические суб-

192

страты, например глутатион. Методы этой груп-

пы трудоемки, малочувствительны и имеют

лишь историческое значение. Позднее стали

применяться методы, в которых использовались

следующие субстраты: L-y-глутамилнафтила-

мид; L-v-глутамил-п-нитроанилид (методы
Орловского и др.); L-y-глутамиланилид (метод

Гольдберга и др.). Наиболее распространены
методы с применением в качестве субстрата

Ь-у-глутамил-п-нитроанилида. Позднее был

описан более быстрорастворимый субстрат —
производное Ь-у-глутамил-п-нитроанилида —

Ь-у-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид. Дан-

ный субстрат используется в наборах реактивов
фирмы «Boehringer  M a n n h e i m » (ФРГ). В ка-
честве буферов могут применяться трис-буфер,

глицил глициновый, 2-амино-2-метил-1,3-про-

пандиоловый. Вид буфера почти не оказывает

влияния на активность фермента. Преимуще-

ство глицилглицинового буфера состоит в том,
что он одновременно является и буфером, и
акцептором у-глутамилового остатка.

В СССР в 1979 г. в качестве унифицирован-

ного утвержден метод с субстратом L-y-глута-
мил-п-нитроанилидом и глицилглициновым бу-
фером.

Унифицированный метод с субстратом L-y-

глутамил-п-нитроанилидом.  П р и н ц и п . у-ГТФ

катализирует реакцию переноса L-y-глутами-

лового остатка с L-y-глутамил-п-нитроанилида

на глицилглицин. Количество освобожденного

в ходе реакции n-нитроанилина измеряется
и служит мерой активности у-глутамилтрансфе-
разы:

в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят

до метки водой и растворяют. Для определе-

н и я активности у-ГТФ можно пользоваться

набором реактивов «Лахема» (ЧССР).

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я . Сы-

воротка или плазма крови. Гемолиз не влияет
на активность фермента.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в

пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и

помещают в водяную баню при температуре

37 °С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; со-
держимое перемешивают и инкубируют точно

15 мин при 37 °С. Затем прибавляют 3 мл

раствора уксусной кислоты и перемешивают.
Холостую пробу ставят так же, как опытную,

но сыворотку добавляют после инкубации. Изме-

ряют на спектрофотометре при длине волны

410 нм или на ФЭКе при длине волны 400—

500 нм (фиолетовый или синий светофильтр)

в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой
пробы. Окраска стабильна в течение нескольких
часов.

Р а с ч е т активности производят по кали-

бровочной кривой. Построение калибровочной
кривой: из основного калибровочного раствора

готовят рабочие растворы, как указано ниже.

№ калиб-

ровочного

раствора

1

2
3

4

5

6

Калибровоч-

ный раствор

п-нитроани-

лина, мл

0,25

0,50

1,00

1,00

1,50

2,00

Дистилли-

рованная

вода, мл

3,75

3,50

3,00

1,00

0,50

—

Активность

у-ГТФ,

нмоль/

(с-л)

417

833

1 667

3334

5001
6668

В каждую из 6 пробирок наливают по 0,05 мл

рабочих калибровочных растворов № 1—6,

прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кис-

лоты,перемешивают и измеряют экстинкцию

против раствора уксусной кислоты при тех же
условиях, что и опытную пробу. По полученным

з н а ч е н и я м экстинкции строят калибровочную

кривую. Линейность калибровочного графика

сохраняется до активности 5000  н м о л ь / ( с • л).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Мужчины:

250—1767  н м о л ь / ( с - л ) , или 15—106 ME; жен-
щины: 167—ПО  н м о л ь / ( с - л ) , или 10—66 ME

при 37 °С.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты  в а р и а ц и и 1—4 %.

С п е ц и ф и ч н о с т ь . Расщепление у-глу-

тамиловых пептидов другими пептидами не-

известно.

Л и т е р а т у р а . Инструкция к набору

реактивов Био-Ла-Тест для определения актив-

ности у-глутамилтранспептидазы в сыворотке
крови, «Лахема» ЧССР.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Несмотря

на высокую активность у-ГТФ в почках, опре-

7 п/р В. В. Меньшикова

193

Р е а к т и в ы .  1 . L-y-Глутамил-п-нитроани-

лид. 2. Натрия хлорид ч.д.а., х.ч. 3. Глицил-

глицин, 0,55 моль/л, рН 8,3 : 3,63 г глицилгли-

цина помещают в мерную колбу вместимостью

50 мл, доливают до метки водой и растворяют

(буферный раствор). 4. Субстратно-буферный

раствор: в пробирку наливают 10 мл воды и

добавляют 0,028 г L-y-глутамил-п-нитроанили-
да и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая

мешать, растворяют содержимое пробирки на
кипящей водяной бане в течение 60 с. Затем

раствор охлаждают до 37 °С и добавляют 2,5 мл
буферного раствора. Приготовленный раствор

субстрата во время работы хранят в водяной
бане при 37 "С. Неиспользованный раствор суб-

страта можно хранить в холодильнике в течение

недели. Субстрат плохо растворим и при комнат-

ной температуре выпадает в осадок. Поэтому

перед употреблением выкристаллизовавшийся
субстрат растворяют нагреванием в кипящей

водяной бане. Нагревание и растворение суб-
страта можно повторить не более 2 раз. 5. Уксус-

ная кислота ледяная ч.д.а., х.ч., раствор 100 г/л:

10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.

6. Основной калибровочный раствор п-нитро-

а н и л и н а : 0,0829 г n-нитроанилина помещают

деление активности фермента в сыворотке крови

проводят преимущественно для диагностики за-

болевания печени и желчных путей. Повыше-

ние активности у-ГТФ наблюдается при забо-

леваниях желчных путей с явлениями обтура-

ции, при гепатитах, опухолях и метастазах

в печень. Активность у-ГТФ в сыворотке крови

увеличивается, как правило, параллельно увели-

чению активности щелочной фосфатазы, но

активность у-ГТФ увеличивается раньше, дер-

жится на повышенных цифрах более длительное

время и относительное увеличение активности

фермента в несколько раз выше, чем щелочной

фосфатазы.

Наркотики, седативные средства, этанол

индуцируют активность у-ГТФ печени. Поэтому

у-ГТФ является чувствительным тестом для

диагностики алкогольно-токсических заболера-

ний печени. Исследование изоферментов у-ГТФ

не имеет большого диагностического значения.

При острых панкреатитах активность фермента

повышена незначительно.

5.2.5. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (d-глюко-

зо-6-фосфат: NADP 1-оксидоредуктаза; К.Ф.

1.1.1.49) впервые была изолирована Варбургом

из эритроцитов. Наибольшая активность фер-

мента определяется в эритроцитах, менее богаты

Г-6-ФДГ печень, поджелудочная железа, почки,

легкие.

Методы определения. Применяют оптический

тест, а также качественные методы, основан-

ные на восстановлении NADP и 2,6-дихлорфено-

линдофенола в присутствии феназина метасуль-

фата; оптимум рН фермента между рН 7,4 и

8,6. Определение активности фермента можно

проводить в фосфатном, триэтаноламиновом,

глицилглициновом буферах и трис-буфере.

Ионы магния активируют фермент. Описанный

ниже метод утвержден в качестве унифициро-

ванного в 1974 г. Активность фермента опре-

деляют в эритроцитах.

Проба Бернштейна (унифицированный ме-

тод).  П р и н ц и п . Глюкозо-6-фосфат в при-

сутствии Г-6-ФДГ эритроцитов и NADP окис-

ляется с образованием NADPH. NADPH вос-

станавливает феназин метасульфат, который в

свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенол-

индофенол. Феназина метасульфат действует в

этой реакции как активный переносчик электро-

нов от NADP к краске.

Р е а к т и в ы .  1 . Никотинамидадениндинук-

леотидфосфат (NADP). 5,75 мг NADP раство-

ряют в 2,5 мл воды. Раствор стабилен в те-

чение 4 нед при хранении в холодильнике.

2. D-Глкжозо-б-фосфорной кислоты динатрие-

вая соль: 38 мг глюкозо-6-фосфата растворяют

в 2,5 мл воды. В продаже чаще имеется бариевая

соль глюкозо-6-фосфата; перевод ее в динатрие-

вую соль осуществляется следующим образом:

60 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата раство-

ряют в I мл воды, добавляют 0,2 мл насыщен-

ного раствора сульфата натрия, центрифуги-

руют. Отбирают весь надосадочный слой и

прибавляют к нему 1,3 мл воды. Раствор исполь-

зуют для определения активности фермента.

Хранят в холодильнике. 3. Феназина метасуль-

фат, 0,02 г/л. Раствор нестабилен, готовят перед

употреблением. 4. НС1, 1 моль/л. 5. Трис-буфер,

0,74 моль/л, рН 8,0: 44,8 г трис-(оксиметил)-

аминометана растворяют в 200 мл воды, при-

бавляют 1 моль/л раствор HCI до получения

рН 8,0 и доводят водой до 500 мл. Хранят

в холодильнике. 6. Раствор 2,6-дихлорфенолин-

дофенолята натрия в трис-буфере. К 5,8 мг

2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибав-

ляют 40 мл 0,7 моль/л трис-буфера рН 8,0.

Хранят в холодильнике. 7. Смесь реактивов,

состоящая из 1 части раствора NADP, 1 части

раствора глюкозо-6-фосфата, 2 частей раствора

феназина метасульфата, 16 частей раствора

2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Смесь

реактивов нестабильна, готовят перед упот-

реблением.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в

пробирку наливают 1 мл воды, добавляют

0,02 мл крови и после наступления полного

гемолиза (через 6—10 мин) прибавляют 0,5 мл

смеси реактивов. При проведении массовых ис-

следований прибавление смеси может быть

проведено одновременно в 35—40 пробах. Время

от момента взятия крови до прибавления реакти-

вов не должно превышать 45 мин. Через 30 мин

производят оценку результатов.

Контрольную пробу ставят так же, как опыт-

ную, для исследования берут кровь практически

здорового человека.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . При отрица-

тельной реакции (в норме) происходит полное

обесцвечивание краски; при сомнительной —

явное обесцвечивание, но по сравнению с конт-

рольной пробой остается зеленоватый оттенок;

при положительной реакции обесцвечивания

краски не происходит или происходит очень

незначительно.

I

П р и м е ч а н и я . 1. При работе в экспе-

диционных условиях заранее приготовляют

навески реактивов в зависимости от количе-

ства исследований, запланированных на

один раз. 2. Сомнительные реакции не должны

приниматься в расчет при массовом обследо-

вании населения; плохо вымытая пробирка

может симулировать сомнительную реак-

цию. При массовых обследованиях имеют

значение резко положительные и положи-

тельные реакции. 3. Сомнительные реакции

следует принимать во внимание и проверять

активность фермента количественным мето-

дом у женщин с подозрением на гемолити-

ческую анемию, обусловленную дефицитом

активности фермента, особенно после приема

лекарств, вызывающих гемолитические кри-

зы у этих больных.

Л и т е р а т у р а . Идельсон Л. И., Кото-

ян Э. Р. Лаб. дело, 1970, № 7, с. 428; Bern-

stein R. Е. Nature, 1962, vol. 194, p. 192.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Дефицит

активности Г-6-ФД эритроцитов относится к

наиболее распространенным наследственным

аномалиям; наследуется дефицит Г-6-ФД доми-

нантно, клинически проявляется как гемолити-

194