Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 52

раствора прибавляют 10 мл-0,02 моль/л рас-

твора едкого натра и измеряют на ФЭКе при

длине волны 400—420 нм (фиолетовый свею

фильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08;

если экстинкция больше 0,08, необходимо уда-

лить свободный п-нитрофенол. Для этого реак-

тив экстрагируют 2 или 3 раза  р а в н ы м и объема-

ми бутилового спирта и один раз — эфиром.

Затем удаляют следы эфира выдерживанием

на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны

иметь нейтральную реакцию. Если реактив не

выдерживает  у к а з а н н ы й выше тест, то экстра-

гирование повторяют. Хранят раствор в холо-

дильнике в замороженном состоянии R течение

2—3 нед. 4. Аминоуксусная кислота (гликокол,

глицин) ч. д. а. или х. ч. 5. Магния хлорида

6-водный ч. д. а. или х. ч. 6. Натр едкий ч. д. а.

или х. ч.; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не

содержащие углекислого газа. 7. Буферный рас-

твор — 0,05 моль/л глициновый буфер с добав-

лением катализатора хлорида магния — 95 мг/л:

375 мг  г л и ц и н а и 10 мг MgCI

2

 • 6Н

2

О растворяют

в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и дово-

дят объем водой до 100 мл. 8. Субстратно-буфер-

ный раствор готовят смешиванием равных ча-

стей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При
с м е ш и в а н и и 2 мл раствора с 10 мл 0,02  м о л ь / л

раствора едкого натра реактив не должен давать

экстинкцию на ФЭКе более 0,1  ( т о л щ и н а слоя

1 см, длина волны 400—420  н м ) . В противном

случае раствор негоден или подлежит реэкстра-

гированию бутанолом или эфиром. После эк-

стракции необходимо снова установить рН. Хра-

нят в холодильнике в течение 2—3 дней. 9.  н - Н и -

трофенол — калибровочный раствор  5 - 1 0 ~

5

моль/л: 696 мг п-нитрофенола х. ч. растворяют

в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят

этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора

содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая, свободная от гемолиза сыворотка или

плазма крови. Цитрат, оксалат, ЭДТА, гепарин

вызывают интерференцию. При  х р а н е н и и  а к т и в -

ность фермента возрастает.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в

пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного

раствора, прогревают при 37 °С в течение 5 мин,

затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержи-

мое пробирок перемешивают и инкубируют в те-

чение 30 мин при 37 "С. После инкубации про-

бирки переносят в водяную баню со льдом, а за-

тем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора

едкого натра и тщательно перемешивают. Через

5 мин пробы измеряют на ФЭКе при длине

волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр)

в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой

пробы. Холостую пробу ставят так же, как

опытную, но сыворотку добавляют после

инкубации.

Р а с ч е т производят  п о калибровочному

г р а ф и к у .

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Из рабочего калибровочного рас-

твора готовят ряд разведений, как указано  н и -

же, и измеряют оптическую плотность растворов

при условиях, аналогичных опытным, против

0,02 моль/л раствора едкого натра.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 278—830

н м о л ь / ( с - л ) , или 1—3 мкмоль п-нитрофенола,

освобожденного 1 мл сыворотки за 1 ч инкуба-

ции — единицы Бессея — Лоури — Брока. Нор-

мальные величины ЩФ в значительной степени

зависят от возраста.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации равны в среднем 5—9 %.

Л и т е р а т у р а . Bessey О. A., Lowry О. Н.,

Brоck M.~ J. Biol. Chem., 1940, vol. 164, p. 321.

Оптимизированный метод по гидролизу п-ни-

трофенилфосфата.  П р и н ц и п . Измерение пог-

лощения при 405 нм при образовании п-нитрофе-

нола из п-нитрофенилфосфата. Реакция проте-

кает по следующему уравнению:

рН 10,4

= п-нитрофенол + фосфат

Р е а к т и в ы .  1 . 2-Амино-2-метил-1-пропа-

нол  ( 2 А 2 М 1 П ) . 2. HCI, 1 моль/л. 3. 2-Амино-

2-метил-1-пропаноловый буфер, 0,393 моль/л,

рН 10,4: 2А2М1П нагревают при температуре

30—35 °С до получения жидкости. 17,52 г

2А2М1П растворяют в 400 мл воды, доводят

рН до 10,4 раствором HCI 1 моль/л и доводят

объем водой в мерной колбе до 500 мл. Раствор

необходимо предохранять от СО

2

 воздуха; ста-

билен при комнатной температуре в течение

месяца. 4. Магния хлорид 6-водный (MgClj X

Х6Н

2

О), 6,38 ммоль/л: растворяют 0,131 г хло-

рида магния в 60—70 мл воды в мерной колбе

вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.

Раствор стабилен. 5. п-Нитрофениловый эфир

фосфорной кислоты динатриевая соль, имп.

(п-НФФ), 204 ммоль/л: растворяют 0,757 г

п-НФФ в 10 мл 6,38 ммоль/л раствора хлорида

магния. При хранении в посуде из темного стек-

ла раствор стабилен в течение 5—6 ч, поэтому

раствор готовят в необходимом количестве перед

употреблением.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр с термостатированной кюве-

той или биохимический анализатор, позволя-

ющий проводить кинетическое измерение.

207

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед определе-

нием температура растворов и исследуемой сы-

воротки должна быть доведена до температуры

измерения. Определение проводят по следующей

схеме.

В термостатиро-

ванную кювету

приливают

(30 °С)

2А2М1П-буфер

Сыворотка крови

Опытная

проба

(мкл)

920,0

20,0

Конечная

концентрация

веществ

в пробе

2А2М1П-

0,345 моль/л

Перемешивают, оставляют на 5 мин

Раствор п-НФФ

80,0

п-НФФ -

16 ммоль/л

MgCl

2

 — 0,5

ммоль/л

Осторожно перемешивают и точно через 1, 2,

3 мин (или через другие, но равные промежутки

времени) измеряют экстинкцию при длине вол-

ны 405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против

воды.

Расчет активности фермента проводят по

формуле:

активность, моль/(с • м

3

) =нмоль/(с • л) • 10

6

 =

где Vp,c, — объем реакционной смеси, мл;

Усыв — объем сыворотки, мл; / — время реак-

— изменение экстинкции за 1 с;

е — коэффициент молярной экстинкции п-НФ

в растворе 2А2М1П при 30 °С,  м

2

- м о л ь

- 1

(18,8- 10

2

). Коэффициент молярной экстинкции

п-НФ может меняться в зависимости от качества

реактива и условий определения; / — толщина

слоя жидкости в кювете, м (1 • 10

- 2

). 1 МЕ =

= 1 мкмоль/(мин • л) = 16,67  н м о л ь / ( с - л ) .

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы ; 500—1417

н м о л ь / ( с - л ) , или 30—85 ME.

О ц е н к а  а н а л и т и ч е с к о й  н а д е ж -

н о с т и . Коэффициенты вариации составляют

3,2—4,8 %. При сравнении данного метода с ре-

ферентным методом МФКХ r = 0,99. По анали-

тическим качествам его можно использовать

в качестве временного референтного метода.

Л и т е р а т у р а . IFCC. Expert Panel on En-

symes. Part 5 IFCC method for  a l k a l i n e phosp-

hatase (ortho-phosphoric-monoester phospho-

hydrolase,  a l k a l i n e  o p t i m u m EC 3.1.3.1).— Clin.

chim. Acta, 1983, vol. 135, p. 339F — 367F Bo-

wers G. N., McComb R. B.  C l i n . Chem., 1975,

v o l . 21, № 13, p. 1988—1995; Bowers G. N.,

McComb R. В., Upretti A.  C l i n . Chem., 1981,

vol. 27, № 1, p. 135—143; A reference method

for measurement of  a l k a l i n e phosphatase activity

in  h u m a n serum.—  C l i n . Chem., 1983, vol. 29,

№ 5, p. 751—761.

208

Электрофоретическое разделение изофермен-

тов на пленках из ацетата целлюлозы.  П р и н -

ц и п . Фракции ЩФ разделяются путем электро-

фореза на пленках из ацетата целлюлозы при

рН 8,6. Затем пленки инкубируются на геле,

содержащем субстратную смесь.

Р е а к т и в ы . 1. Буфер барбиталовый для

электрофореза, 0,075 моль/л, рН 9,2: 5,5-диэтил-

барбитуровая кислота (веронал) — 2,01 г, 5,5-

диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль

(мединал) — 15,4 г. Навески реактивов поме-

щают в мерную колбу вместимостью 1 л, рас-

творяют и доводят до метки водой. 2. Буфер

боратный для приготовления субстрата, рН 10,5:

борная кислота — 0,309 г, калия хлорид —

0,373 г, натрия гидроокись — 0,176 г, магния

хлорид 6-водный — 0,0005 г. Навески реактивов

помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл,

растворяют и доводят до метки водой. 3. Суб-

стратно-буферная смесь для инкубации пленок:

а-нафтилфосфат натрия — 0,04 г, фиолетовый

быстрый Б (Fast violet В. salt) — 0,04 г. Навес-

ки реактивов растворяют в 20 мл боратного

буфера. 4. Агароза: 0,32 г на 40 мл субстратного

буфера. Заливают сначала половинным коли-

чеством буфера, доводят до кипения, после чего

прибавляют остаток буфера. Смесь второй раз

доводят до кипения. Охлаждают до 60 °С и сме-

шивают с буферно-субстратной смесью  1 : 1 .

5. Раствор для промывания — 50 г/л раствор

уксусной кислоты.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

1. Аппарат для электрофореза на пленках из

ацетата целлюлозы. Можно использовать ЭПАУ-

20-50 отечественного производства. 2. Ацетат-

целлюлозная пленка ТУ 6-05-1696-74.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Нанесение сыво-

ротки: способ нанесения (аппликация) сыво-

ротки имеет немаловажное значение при элект-

рофорезе на ацетатцеллюлозных пленках. Же-

лательно, чтобы аппликатор был фиксирован

и позволял наносить микроколичества сыворот-

ки. Для определения изоферментов ЩФ тре-

буется 1—5 мкл сыворотки (двойная апплика-

ция). Для облегчения трактовки результатов

электрофореграммы на ацетатцеллюлозную

пленку можно наносить равные количества

обычной и предварительно инактивированной

теплом сыворотки.

П р о в е д е н и е  э л е к т р о ф о р е з а .

Ацетатцеллюлозную пленку замачивают в

электрофоретическом буфере в течение 20—

30 мин. Высушивают фильтровальной бумагой,

наносят 1—5 мкл сыворотки и подключают ка-

меру к источнику напряжения. Электрофорети-

ческое разделение проводят в течение 50 мин

при напряжении 270 В и силе тока 15—25 мА.

После электрофореза пленки кладут рабочей

стороной на поверхность геля, содержащего суб-

стратно-буферную смесь  ( 1 : 1 ) , и выдерживают

в термостате при 37 °С до развития окраски.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Непросветлен-

ные высушенные пленки оценивают с помощью

денситометра.

Н о р м а л ь н ы е  з н а ч е н и я . В норме вы-

являются 1—2 фракции ЩФ в зоне а

2

-глобу-

линов.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Значи-

тельное увеличение активности ЩФ в сыворотке

крови наблюдается при костных заболеваниях,

связанных с увеличением количества остеоблас-

тов, или с более интенсивным синтезом ЩФ

в остеобластах. Наиболее высокая активность

(выше нормы в 20 раз и более) наблюдается

при болезни Педжета (деформирующий остит),

менее высокая — определяется при рахите. Зло-

качественные новообразования, поражающие

кости, также вызывают повышение активности

ЩФ в сыворотке крови. При гиперпаратирео-

идизме уровень ЩФ повышается незначитель-

но. Изменения активности ЩФ в сыворотке

крови, помимо костной патологии, характерны

при заболеваниях печени и желчных путей.

Резкое увеличение активности фермента на-

блюдается при заболеваниях, сопровождающих,

ся механической желтухой. В меньшей степени

активность ЩФ увеличивается при гепатите и

циррозе печени. Повышение активности фермен-

та в сыворотке крови при заболевании печени

и желчных путей связано с высвобождением

ЩФ из поврежденных печеночных клеток или

задержкой экскреции ЩФ из желчи, в резуль-

тате чего фермент вновь поступает в кровоток,

а также с индуктивным ее синтезом в желчных

канальцах. При заболеваниях костей ЩФ в сы-

воротке по своим свойствам аналогична кост-

ному ферменту, при болезнях печени — фермен-

ту, который выделяется из печени. Если при

электрофорезе в норме выявляется 1—2 фрак-

ции ЩФ, то при патологии количество фракций

и их расположение при электрофорезе могут

меняться. Наиболее быстро мигрирующей фрак-

цией (от катода к аноду) является печеночный

изофермент. При заболеваниях печени возмож-

но появление второй печеночной полосы ЩФ.

Несколько более медленно по сравнению с пече-

ночной фракцией движется костная фракция

ЩФ. Еще более медленно движется плацент-

ная термостабильная фракция ЩФ. Фракция

ЩФ с очень высокой термостабильностью наз-

вана изоферментом «Реган» по имени больного

раком легкого, у которого он был обнаружен

впервые. Ее появление может быть связано с на-

личием злокачественного новообразования. На-

иболее медленно мигрирующей фракцией явля-

ется кишечная ЩФ.

5.2.12. Кислая фосфатаза,

фракция кислой фосфатазы

Кислая фосфатаза — КФ (фосфогидролаза

моноэфиров ортофосфорной кислоты, кислый

оптимум рН; К. Ф. 3.1.3.2) — содержится почти

во всех органах и тканях человека, особенно

богаты КФ клетки крови, предстательная желе-

за, печень, почки, кости. Активность КФ в пред-

стательной железе в 100 раз выше, чем в других

тканях. КФ не является гомогенным ферментом.

Большинство тканей содержат два или более

изоферментов, отличающихся по своим свой-

ствам.

Ткань предстательной железы содержит два

основных изофермента, которые имеют одинако-

вый оптимум рН, но различаются по действию

на них ряда веществ (ингибиторов), в частности

тартрата (солей винной кислоты). Активность

простатической фракции фермента ингибируют

тартрат, ионы фтора и железа. При использо-

вании 0,02 моль/л раствора тартрата и п-нитро-

фенилфосфата в качестве субстрата ингибиро-

вание составляет 95 %, т. е. простатическая КФ

является тартратлабильной. Специфичностью к

КФ предстательной железы обладают субстраты

п-нафтилфосфат и тимолфталеинфосфат.

Методы определения КФ те же, что и для

ЩФ, но различаются по используемым буфер-

ным системам и значению рН.

Оптимизация условий определения и унифи-

кация методов. В методах определения актив-

ности общей простатической КФ чаще всего

применяется цитратный буфер, обладающий

способностью активировать кислую фосфатазу

предстательной железы. В большинстве стан-

дартных методов, рекомендуемых в различных

странах, и в наборах реактивов в качестве

субстрата используется п-нитрофенилфосфат.

«Лахема» (ЧССР) выпускает набор реактивов

для определения общей и простатической КФ.

Метод по гидролизу п-нитрофенилфосфата

для определения активности общей и простати-

ческой фракций.  П р и н ц и п . КФ гидролизует

п-нитрофенилфосфат в кислой среде с образова-

нием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде

желтое окрашивание. Активность КФ предста-

тельной железы ингибируется L-тартратом.

Р е а к т и в ы . 1. п-Нитрофенилфосфат ди-

натриевая соль (п-нитрофенилфосфат не дол-

жен содержать примеси п-нитрофенола); п-нит-

рофенилфосфат отечественного производства

требует перекристаллизации (см. 5.2.11). 2. Нат-

рия хлорид ч. д. а. или х. ч. 3. Натрия цитрат

трехзамещенный, 1 моль/л, рН 5,5. 4. Калий-

натрий виннокислый ч. д. а. или х. ч. (раствор

ингибитора), 0,12 моль/л раствор в 1 моль/л

растворе цитрата. 5. Раствор А: 80 мл концент-

рированного буферного раствора разбавляют

32 мл воды и в 37 мл этого раствора растворяют

0,09 г п-нитрофенилфосфата и 0,31 г хлорида

натрия. Определение можно проводить по набо-

ру реактивов «Лахема» (ЧССР). 6. Раствор Б:

40 мл концентрированного раствора ингибитора

разбавляют 16 мл воды и в 18,5 мл этой смеси

растворяют 0,045 г п-нитрофенилфосфата и

0,155 г хлорида натрия. Растворы А и Б стабиль-

ны при хранении в холодильнике в посуде из

темного стекла в течение нескольких недель.

7, п-Нитрофенол ч. д. а. 8. Основной калибро-

вочный раствор п-нитрофенола: 16,68 мг п-нит-

рофенола помещают в мерную колбу вмести-

мостью 100 мл и доливают до метки водой. 9.

Натр едкий ч. д. а. или х. ч., 0,1 моль/л.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежая сыворотка или плазма крови, свобод-

ные от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба: в

одну пробирку вносят 0,5 мл раствора А (общая

активность), в другую пробирку — 0,5 мл рас-

твора Б (тартратстабильная фракция) и нагре-

вают до 37 °С в течение 5 мин. Добавляют

в обе пробирки по 0,1 мл сыворотки или плазмы

209

и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем в обе

пробирки добавляют по 2 мл О, I моль/л раствора

гидроокиси натрия. Холостая проба: в пробирку

вносят 0,5 мл раствора А, далее обрабатывают

так же, как опытную, но сыворотку или плазму

добавляют после инкубации. Измеряют экстинк-

цию опытной и холостой пробы при длине волны

405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против

воды.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Из основного калибровочного

раствора готовят рабочие растворы, как указано

ниже.

№

про-

бирки

1

2
3
4
5

Основной

калибро-

вочный ра-

створ п-

нитрофе-

нола, мл

0,1

0,2

0,5

1,0

1,0

Вода ди-

стилли-

рован-

ная, мл

1,9

1,6

2,0

1,0

—

Активность КФ

мкмоль/

( м и н - л )

2,5

5

10

25

50

нмоль/

(с- л)

41,7

83,3

166,7

416,7

833,5

В каждую из 5 пробирок наливают по 0,1 мл

соответствующего рабочего калибровочного

раствора, прибавляют по 2,5 мл раствора NaOH,

перемешивают и измеряют экстинкцию против

воды при тех же условиях, что и экстинкцию

опытной пробы. По полученным значениям

экстинкции строят калибровочный график зави-

симости экстинкции от активности фермента.

Р а с ч е т активности производят по калиб-

ровочному графику. Из экстинкции опытной про-

бы (раствор А) вычитают экстинкцию холостой

пробы; разность экстинкции соответствует эк-

стинкции общей КФ. Из экстинкции опытной

пробы (раствор Б) вычитают экстинкцию хо-

лостой пробы; разность экстинкции соответству-

ет экстинкции тартратстабильной фракции. Для

обеих разностей находят соответствующую ак-

тивность по калибровочному графику. Из вели-

чины активности общей КФ вычитают величину

активности тартратстабильной фракции, полу-

чают активность тартратлабильной фракции КФ

(КФ предстательной железы).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Общая ак-

тивность 67—167  н м о л ь / ( с - л ) , или 4—10 ME;

тартратлабильная фракция 0—16,7 нмоль/

/ ( с - л ) , или 0—1 ME.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации колеблются от 6 до 10 %. Если

полученная величина активности общей КФ пре-

вышает 830  н м о л ь / ( с - л ) , то исследование пов-

торяют при инкубации 10 мин и полученный

результат умножают на 3.

Л и т е р а т у р а . Bessey О. A., Lowry О. Н.,

Brock М. 1. J. biol. Chem., 1946, vol. 164,

p. 321—329; Кислая фосфатаза. Инструкция

210

к набору реактивов для определения активности

кислой фосфатазы в сыворотке крови. Био-Ла-

Тест, «Лахема» (ЧССР).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Определе-

ние активности КФ обычно проводится для диаг-

ноза карциномы предстательной железы. При

этом простатическая фракция КФ имеет боль-

шее диагностическое значение, чем общая КФ.

Определение активности КФ может быть исполь-

зовано для дифференциальной диагностики ме-

тастазов рака предстательной железы в кости

и заболеваний костной ткани, в частности остео-

дистрофий, при которых обычно повышен уро-

вень только щелочной фосфатазы, в то время

как при костных метастазах рака предстатель-

ной железы повышается, как правило, актив-

ность в крови как ЩФ, так и КФ. Массаж пред-

стательной железы, катетеризация, цистоско-

пия, ректальные исследования приводят к повы-

шению активности КФ, поэтому кровь для опре-

деления активности КФ рекомендуется брать не

раньше чем через 48 ч после указанных про-

цедур.

5.2.13. Фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза

Альдолаза — АЛД (В-фруктозо-1,6-бисфос-

фат D-глицеральдегид-З-фосфат-лиаза; К. Ф.

4.1.2.13) относится к классу лиаз. АЛД явля-

ется ферментом гликолиза. О.  W a r b u r g ,

W. Christian выделили впервые фермент в 1943 г.

из скелетных мышц крыс. АЛД состоит из трех

изоформ: мышечной, печеночной, мозговой,

различающихся по субстратной специфич-

ности.

Мышечный фермент (фруктозе-1,6-дифосфа-

тальдолаза) катализирует гидролиз фруктозо-

1,6-дифосфата значительно быстрее, чем фрук-

тозо-1-монофосфата; он отличается малой ор-

ганной специфичностью, наибольшая актив-

ность его обнаруживается в скелетной муску-

латуре, в сердечной мышце и печени. Печеноч-

ный тип (фруктозо-1-фосфатальдолаза) катали-

зирует реакцию расщепления фруктозе-1-моно-

фосфата на глицериновый альдегид и диокси-

ацетонфосфат, содержится исключительно в пе-

чени.

В норме в сыворотке крови активность

фруктозо-1-фосфат-альдолазы не определяется.
Для целей диагностики чаще определяют фрук-

тозо-1,6-дифосфат-альдол азу.

Методы определения. Для определения ак-

тивности АЛД в сыворотке крови применяют

спектрофотометрические методы по непрямому

оптическому тесту Варбурга; фотометрические

методы, основанные на определении фосфора

фосфотриоз по реакции с параоксидифенилом;

динитрофенилгидразиновые методы (Сибли-Ле-

нинжер, 1949). Шапиро (1960) был предложен

динитрофенилгидразиновый метод для опреде-

ления активности фруктозе-1-фосфатальдолазы

в сыворотке крови. Определение АЛД по не-

прямому оптическому тесту протекает по сле-

дующим реакциям.