Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 55

Уреазный метод по салицилатно-гипохлорит-

ной реакции.  П р и н ц и п . Тот же. Вместо фе-

нола применяют салицилат натрия.

Р е а к т и в ы .  1 . Этилендиаминтетрауксус-

ная кислота, динатриевая соль ЭДТА. 2. Азид

натрия. 3. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

4. Гипохлорит натрия. 5. Йодид калия, 50 г/л.

6. НС1, 6 моль/л. 7. Нитропруссид натрия,

2,69 ммоль/л. 8. Буферный раствор: ЭДТА —

26,9 ммоль/л; HCI — 20 ммоль/л; азид нат-

рия — 15,4 ммоль/л, рН 6,5. 10 г ЭДТА, 1 г

азида натрия растворяют в 800 мл воды с 20 мл

1 моль/л раствора едкого натра. Доводят рН до

6,5 и доливают водой до 1 л. Раствор стабилен,

хранят в закрытом виде. 9. Салицилат натрия,

1060 ммоль/л: 170 г салицилата натрия рас-

творяют в воде и доводят объем до 1 л. Рас-

твор стабилен, хранят в закрытом виде. 10. Ги-

похлорит натрия, раствор: 70 ммоль/л гипохло-

рита натрия и 2500 ммоль/л натра едкого. При-

готовление раствора гипохлорита и определение

активности хлора см. предыдущую методику.

11. Уреазный реактив: 200 мг препарата уреазы

с активностью 5000 Сигма ед.* растворяют в

1 л буферного раствора. Хорошо перемешивают,

профильтровывают. Раствор стабилен в течение

недели при хранении в холодильнике. 12. Сали-

цилатный реактив — 1060 ммоль/л салицилата

натрия и 2,69 ммоль/л нитропруссида натрия:

800 мг нитропруссида натрия растворяют в 1 л

раствора салицилата натрия, фильтруют. Стаби-

лен в течение недели.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Плазма, сыворотка крови.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Реакцию проводят

при 37 "С. Опытная проба: к 10 мкл сыворотки

добавляют 0,1 мл воды или 154 ммоль/л рас-

твора хлорида натрия, 0,5 мл уреазного реакти-

ва. Смесь инкубируют в течение 3—3'/2 мин

(время инкубации должно быть постоянным!)

при температуре 37 °С, затем добавляют 2 мл

салицилатного реактива, перемешивают. Через

48 с инкубации при 37 °С добавляют 2 мл гипо-

хлоритного реактива. Через 5—6 мин инкубации

при 37 °С измеряют оптическую плотность рас-

твора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм

при длине волны 500—560 нм (зеленый свето-

фильтр) против холостой пробы на реактивы.

Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу на реактивы ставят так же,

как опытную, но вместо сыворотки берут воду.

Холостую пробу на сыворотку ставят так же,

как опытную, но уреазный реактив добавляют

после салицилатного реактива перед гипохло-

ритом. Измеряют против холостой пробы на

реактивы.

Калибровочную пробу обрабатывают так же,

как опытную, но вместо сыворотки берут калиб-

ровочный раствор мочевины. Измеряют в тех

же условиях, что и опытную, против холостой

пробы на реактивы.

* Сигма ед. соответствует активности уреа-

зы, катализирующей образование 1 мг азота

аммиака в течение 5 мин при 20 °С.

где Еоп -- экстинкция опытной пробы, измерен-

ная против холостой пробы на реактивы;

Е

х о л

,

 сыв

 — экстинкция холостой пробы на сыво-

ротку, измеренная против холостой пробы на

реактивы; С

к

 — концентрация мочевины в ка-

либровочном растворе, ммоль/л.

Линейность калибровочной кривой до

75 ммоль/л.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы  т е же, что

и в предыдущем методе.

Л и т е р а т у р а . Richterich R. KHnische

Chomie. Thcorie und Praxis. 3 AuFl.— Basel etc.:

S. Karger, 1971, S. 286—289.

Автоматический селективный анализатор

GSA-II фирмы «Greiner» (Швейцария). Методы

исследования с. 1—5.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Отклоне-

ния от нормального содержания мочевины в сы-

воротке крови зависят от скорости процессов

синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение

содержания мочевины в сыворотке крови явля-

ется одним из главных признаков нарушения

функции почек. Из фракций остаточного азота

раньше всего повышается уровень мочевины,

причем уровень мочевины достигает более высо-

ких цифр по сравнению с другими фракциями

остаточного азота. При почечной недостаточ-

ности азот мочевины может составлять до 90 %

фракций остаточного азота. Повышение уровня

мочевины сыворотки крови может носить и вне-

почечный характер: при потере жидкости (обез-

воживание, рвота, понос), при усиленном рас-

паде белков (острая желтая атрофия печени,

тяжелые заболевания). Уменьшение содержа-

ния мочевины в сыворотке крови может наблю-

даться при заболеваниях печени (паренхима-

тозная желтуха, цирроз печени) из-за наруше-

ния синтеза мочевины в печени.

5.3.2. Креатинин

В синтезе эндогенного креатина принимают

участие аминокислоты — аргинин, глицин, мети-

онин. Креатин при фосфорилировании превра-

щается в креатинфосфат, из которого образу-

ется креатинин (ангидрид креатина). Этот про-

цесс в живом организме необратимый.

219

Креатин и креатинфосфат являются важны-

ми азотистыми веществами мышц, участву-

ющими в химических процессах, связанных

Р а с ч е т производят по следующей фор-

муле:

концентрация мочевины, ммоль/л =

с  м ы ш е ч н ы м и сокращениями. В сыворотке крови

содержится в основном креатинин. Суточное

выделение креатинина'для каждого человека —

величина относительно постоянная, которая за-

висит главным образом от массы мышечной

т к а н и и мало зависит в отличие от мочевины

от питания. Содержание креатинина в сыворот

ке крови уменьшается с возрастом.

Методы определения. Большинство методов

определения креатинина основаны на реакции

Яффе, описанной в 1886 г., в основе которой

лежит реакция ароматических нитровеществ (на-

пример, пикриновая кислота) с веществами, со-

держащими активную метиленовую (=СН

2

)

или метиновую (=СН) группы. В крови многие

хромогены, производные креатинина — глюко-

циамид, 5-метилглюкоциамид, 5-метилкреати-

н и н , а также аскорбиновая кислота, пировино-

градная кислота, ацетон, глюкоза и другие ве-

щества — реагируют с пикриновой кислотой

аналогично креатинину, что обусловливает низ-

кую специфичность методов, основанных на ре-

акции Яффе. По скорости образования окра-

ш е н н ы х соединений в реакции Яффе различают

три группы веществ: группу очень быстро реа-

гирующих хромогенов (30—40 с), креатинин

и группу медленно реагирующих веществ (после

15—20  м и н ) .

Совершенствование методов, основанных на

реакции Яффе, направлено главным образом на

повышение их специфичности. Для повышения

специфичности рекомендуется применять устра-

нение мешающих хромогенов; отделение креати-

нина от остальных хромогенов с помощью бу-

мажной хроматографии, электрофореза; экс-

тракцию креатинина тетрафенилборатом нат-

рия; сорбенты — бентонит, сефадекс, реактив

Ллойда.

В автоанализаторах различного типа дей-

ствия возможно кинетическое измерение креа-

тинина в сыворотке крови без предварительного

осаждения белков с разделением на три пере-

ч и с л е н н ы е выше  г р у п п ы веществ, дающих поло-

жительную реакцию Яффе. Депротеинизации

в таких методах можно избежать путем добавле-

н и и детергентов — тритона Х-100 или доде-

цилсульфата натрия.

На аналитические качества реакции Яффе,

повышение ее специфичности, чувствительности

влияет ряд факторов: температура реакции ре-

комендуется не ниже 30 "С, разница температур

в опытной и калибровочных пробах не должна

превышать 3—5 "С. Оптимальное время реакции

15—20 мин, тем  с а м ы м удается избежать влия-

ния медленно реагирующих хромогенов. Опти-

мальной является величина рН в интервале

12,3—12,5, что в значительной степени повышает

специфичность реакции и правильность метода.

К проблеме, окончательно еще не решенной,

относится выбор способа депротеинизации и его

влияние на правильность метода. Способами

выбора являются осаждение белков трихлор-

уксусной и пикриновой кислотами.

Для определения креатинина значительно

реже применяется реакция с 3,5-динитробензой-
ной кислотой. Образующаяся в ходе реакции

окраска мало стабильна. Методы с применени-

ем о-нитробензальдегида и реакции Сакагучи

трудоемки. Ферментативные методы определе-

ния креатинина с применением ферментов —

аминогидролазы, креатинкиназы, пируваткина-

зы, лактатдегидрогеназы — дорогостоящие и

неабсолютно специфичные.

Наиболее правильные результаты дает метод

масс-фрагментографии, сочетающий газовую

хроматографию и масс-спектрометрию; данный

п р и н ц и п может быть положен в основу рефе-

рентного метода.

Унификация методов. В качестве унифици-

рованного в 1972 г. утвержден метод, основан-

ный на реакции Яффе (метод Поппера).

В основу набора Био-Ла-Тест «Креатинин»

(народное предприятие «Лахема», ЧССР) поло-

жена реакция Яффе с осаждением белков сыво-

ротки трихлоруксусной кислотой. Концентрация

реактивов дана в таком соотношении, которое

дает возможность получить величину рН реак-

ционной смеси 12,4.

Унифицированный метод по цветной реакции

Яффе (метод Поппера).  П р и н ц и п . Креати-

нин реагирует с пикриновой кислотой в щелоч-

ной среде с образованием окрашенных соеди-

н е н и й .

Р е а к т и в ы .  1 . Пикриновая кислота, насы-

щенный раствор. Товарная пикриновая кислота

содержит 15—20 % влажности; кислоту не су-

шить! Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют

2 г пикриновой кислоты при нагревании в горя-

чей бане. После этого раствор оставляют стоять

на 24 ч, периодически перемешивая. Затем рас-

твор фильтруют. Реактив стабилен. Хранят в

темной посуде. 2. НС1, 0,1 моль/л. 3. Основной

калибровочный раствор креатинина, 10ммоль/л:

113,1 мг креатинина доводят до 100млО,1 моль/л

раствором HCI. Хранят в холодильнике в посуде

с притертой пробкой. Для определения креати-

нина в сыворотке крови рабочий калибровочный

раствор получают разведением основного раст-

вора водой в 100 раз; 1 мл раствора содержит

0,1 ммоль  к р е а т и н и н а . 4. Натр едкий, 2,5 моль/л.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка крови, моча. В качестве консервантов

для мочи можно использовать тимол и толуол.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  О п р е д е л е н и е

к р е а т и н и н а в  с ы в о р о т к е  к р о в и :

2 мл сыворотки смешивают с 6 мл насыщен-

ного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин

пробирку помещают на 15—20 с в кипящую

водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл

центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л рас-

твора едкого натра и тщательно смешивают.

Иногда после подщелачивания раствор мутнеет

вследствие выпадения фосфатов. В этом слу-

чае раствор еще раз центрифугируют. Затем рас-

твор доводят до объема 10 мл водой. Через

10 мин (не позже 20  м и н ) измеряют в кювете

с толщиной слоя 2 см при длине волны 500—

560 нм (зеленый светофильтр) против холостой

пробы.

Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора

пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раство-

ра едкого натра доводят до объема 10 мл водой.

Р а с ч е т производят  п о калибровочному

графику.

220

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а : из рабочего калибровочного рас-

твора креатинина готовят разведения, как ука-

зано ниже.

Через 10 мин производят измерения при тех

же условиях, что и опытные пробы. Калибровоч-

ная кривая линейна до 260 мкмоль/л креати-

нина.

О п р е д е л е н и е  к р е а т и н и н а в  м о -

ч е . В мерной колбе или цилиндре вместимостью

100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного

количества) с 3 мл раствора пикриновой кис-

лоты. Смесь тщательно встряхивают и добав-

ляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра.

Выдерживают при комнатной температуре в те-

чение 10 мин. Доводят объем до 100 мл водой.

Измеряют на фотометре в кювете с толщиной

слоя 1 см при длине волны 500—600 нм (зеле-

ный светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба: 3 мл раствора пикриновой

кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого

натра доводят водой до объема 100 мл.

Р а с ч е т производят по формуле при срав-

нении с калибровочной пробой.

К а л и б р о в о ч н а я  п р о б а . К 0,5  м л

основного калибровочного раствора прибавляют

3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл

2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы

обрабатывают так же, как опытные.

где К — количество креатинина в суточной моче,

мкмоль, С

к

 — количество креатинина в калибро-

вочной пробе, 50 мкмоль; Е

оп

 — экстинкция

опытной пробы; Е

к

 — экстинкция калибровоч-

ной пробы; а — суточное количество мочи; б —

количество мочи, взятой для анализа.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В сыво-

ротке крови: у женщин 0,044—0,088 ммоль/л,

или 44—88 мкмоль/л (0,5—1 мг/100 мл); у

мужчин 0,044—0,1 ммоль/л, или 44—

100 мкмоль/л. Содержание креатинина в суточ-

ной моче 4,4—17,7 ммоль/сут, или 0,5—2 г/сут.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации составляют 5—6 %.

Л и т е р а т у р а . Popper H., Mandel F.,

Mayer H.— Biochem. Z., 1937, vol., 291, p. 354.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Определе-

ние креатинина проводят для исследования

функции почек. Содержание его в сыворотке кро-

ви увеличивается при значительном ухудшении

функции почек. Концентрация креатинина в сы-

воротке крови здоровых людей относительно

постоянна, мало зависит от пола, возраста,

диеты, и связано это с тем, что образование

креатинина как конечного продукта метабо-

лизма креатина в мышцах относительно по-

стоянно. Это является важным условием для

исследования клиренса эндогенного креатинина

как меры клубочковой фильтрации.

5.3.3. Мочевая кислота

Мочевая кислота является конечным про-

дуктом распада пуриновых оснований. Обра-

зовавшаяся мочевая кислота выделяется поч-

ками.

Методы определения. Первый метод опреде-

ления мочевой кислоты был предложен О. Folin,

W. Denis в 1912 г. Он основан на способности

мочевой кислоты восстанавливать фосфорно-

вольфрамовую кислоту с образованием окра-

шенных соединений. Впоследствии метод под-

вергался многочисленным модификациям и до

настоящего времени остается одним из наиболее

распространенных. К другим веществам, кото-

рые восстанавливаются мочевой кислотой и при-

меняются для ее определения, относятся мышья-

ковомолибденовая кислота, железосинероди-

стый калий. Однако эти методы не являются

специфичными. Ряд веществ (цистеин, трипто-

фан, тирозин) вызывают интерференцию в дан-

ном методе. Повысить специфичность методов

можно предварительным применением ионооб-

менной хроматографии.

Наиболее специфичными являются фермен-

тативные, уриказные методы. Они основаны на

расщеплении мочевой кислоты уриказой до ал-

лантоина, СО2 и Н

2

О

2

 с последующей индика-

торной реакцией. Результаты реакции можно

измерить следующими способами: измерением

потребления кислорода, что требует специаль-

ной аппаратуры; измерением абсорбции мочевой

кислоты при 293 нм (образовавшийся в резуль-

тате реакции аллантоин не поглощает света при

293  н м ) ; измерением образовавшейся перекиси

водорода. На ферментативном принципе осно-

ван флуорометрический метод определения мо-

чевой кислоты, а также потенциометрический

метод с иммобилизованной уриказой.

Прямое спектрофотометрическое определе-

ние мочевой кислоты в сыворотке крови основано

на измерении поглощения, обусловленного моче-

вой кислотой при 282—295 нм. Максимум погло-

щения зависит от рН среды. Наиболее рас-

пространенным методом определения мочевой

кислоты в практических лабораториях явля-

ется фосфорновольфрамовый метод, который

утвержден в 1979 г. в качестве унифицирован-

ного.

Унифицированный метод по реакции с фос-

форновольфрамовым реактивом.  П р и н ц и п .
Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-

221

вольфрамовый реактив с образованием соеди-

нения голубого цвета.

Р е а к т и в ы . 1. Серная кислота, 0,35 моль/л:

к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрирован-

ной серной кислоты отн. плотности 1,84 и дово-

дят объем водой до 500 мл. 2. Натрий вольфра-

мовокислый двухводный (Na

2

WO

4

-2H

2

O) ч.д.а.,

100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого

натрия в небольшом количестве воды и доводят

объем до 500 мл. 3. Натрия карбонат ч.д.а.,

103 г/л: растворяют 51,5 г натрия карбоната в

небольшом количестве воды и доводят объем

до 500 мл. 4. Ортофосфорная кислота, 85 %,

ч.д.а. 5. Лития сульфат (Li

2

SO

4

-Н

2

O) ч.д.а.

6. Лития карбонат (Li

2

СОз) ч.д.а. 7. Фосфор-

новольфрамовый реактив; в круглодонную колбу

вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамово-

кислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл

85 % ортофосфорной кислоты и несколько стек-

лянных бусинок. Осторожно кипятят в течение

2 ч на песочной или глицериновой бане с обрат-

ным холодильником. Охлаждают до комнатной

тепературы и доливают водой до 1 л. Добавляют

32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хра-

нении в холодильнике. 8. Мочевая кислота, имп.

9. Формалин, не менее 37,5 %, фарм. 10. Основ-

ной калибровочный раствор мочевой кислоты,

6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития

в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 °С.

Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в

предварительно нагретую колбу вместимостью

1 л, вливают теплый раствор карбоната лития

и быстро встряхивают. После растворения мо-

чевой кислоты колбу охлаждают до комнатной

температуры, добавляют 20 мл раствора фор-

малина, наливают 300—350 мл воды. Добав-

ляют несколько капель раствора метилового

оранжевого, затем встряхивают, медленно до-

бавляют 20—22 мл 0,35 моль/л серной кислоты

до изменения цвета в розовый. Доливают колбу

до метки водой. Раствор стабилен при хранении

в холодильнике в посуде из темного стекла;

1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой

кислоты.  1 1 . Рабочий калибровочный раствор

мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного

калибровочного раствора доводят до 200 мл

водой. Стабилен в течение 2 нед при хранении

в холодильнике.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Сыворотка, свободная от гемолиза.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Опытная проба:

к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл

0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают.

Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамо-

вокислого натрия и тщательно перемешивают.

Через 5—10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата

добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната,

перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфор-

новольфрамового реактива, перемешивают, пе-

реворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют

в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны

590—700 нм (красный светофильтр) против хо-

лостой пробы. Холостую пробу ставят так же,

как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл

воды.

Р а с ч е т ведут по формуле при сравнении

с калибровочной пробой.

Калибровочную пробу ставят и измеряют

так же, как опытную, но вместо фильтрата берут

3 мл рабочего калибровочного раствора.

Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л =

где Е

ОП

 — экстинкция опытной пробы; Е

К

 —

экстинкция калибровочной пробы; С

к

 — кон-

центрация рабочего калибровочного раствора,

0,03 ммоль/л; 10 — пересчет на объем сыворотки

(в опытную пробу берут 0,3 мл, т.е. в 10 раз

меньше, чем в калибровочную пробу).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Мужчины:

0,24—0,50 ммоль/л, или 4,0—8,5 мг/100 мл;

женщины: 0,16—0,4 ммоль/л, или 2,8—

7,5 мг/100 мл.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь . Коэффициен-

ты вариации находятся в пределах 3—5 %.

Л и т е р а т у р а . Henry R. J., Sobel С.,

Kim J. Amer. J. din. Pathol., 1957, vol. 28, p. 152.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние содержания мочевой кислоты в крови наблю-

дается при нарушении ее выделения из орга-

низма (заболевания почек, ацидоз, токсикоз

беременности); повышенном образовании пури-

нов (некоторые гематологические заболевания,

прием пищи, богатой  п у р и н а м и ) .

5.3.4. Аминокислоты и пептиды

В крови содержатся свободные аминокис-

лоты экзогенного и эндогенного происхождения.

Концентрация их в сыворотке крови невелика.

С диагностической целью определяют как от-

дельные аминокислоты, так и общий аминный

азот. Наибольшее клиническое значение имеет

определение таких аминокислот, как фенилала-

нин, оксипролин, цитруллин. Для определения

свободных аминокислот применяют: хромато-

графию на бумаге, ионообменную хроматогра-

фию и фотометрические методы. Чаще всего оп-

ределение аминокислот проводят на аминокис-

лотных анализаторах в соответствии с прилагае-

мой к прибору инструкцией.

Кровь содержит также в небольшом коли-

честве полипептиды, которые поступают из ки-

шечника при переваривании белков и образуют-

ся эндогенно как продукты распада белков тка-

ней.

Многие из полипептидов, циркулирующие в

биологических жидкостях, относятся к биологи-

чески активным веществам, и их определение

имеет большое клиническое значение. Методы

их определения будут описаны соответственно

в других главах.

Хроматографическое разделение на бумаге

по Боде—Гири.  П р и н ц и п . В основе разде-

ления лежат различия в степени адсорбции

аминокислот и растворимости их в соответст-

вующем растворителе. После разделения амино-

кислоты с нингидрином в слабокислой среде

дают синее окрашивание с последующим прев-

222