Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 40

тромбопластина и хлорида кальция предвари-

тельно смешивают в соотношении 1 : 1 и к

0,1 мл плазмы добавляют 0,2 мл тромбопла-

стин-кальциевой смеси. 2. При лечении ора-

льными антикоагулянтами уменьшается ак-

тивность не только факторов X,  V I I и II,

отражающаяся на протромбиновом времени,

но и фактора IX, недостаточность ко-

торого не влияет на протромбиновое

время. В связи с этим контроль за

лечением антивитаминами К осуществляется

путем сочетанного определения протромби-

нового времени и АЧТВ (см. 4.4.3), чувстви-

тельного к дефициту фактора IX. 3. Часто ре-

зультаты исследования выдают в виде про-

тромбинового индекса, который представляет

собой выраженное в процентах отношение

протромбинового времени нормальной плаз-

мы к протромбиновому времени исследуемой

плазмы. У здоровых людей он колеблется

в пределах 95—105 %. Уменьшение протром-

бинового индекса имеет такое же значение,

как удлинение протромбинового времени.

Унифицированный метод определения про-

тромбинового времени разведенной плазмы

(1974).  П р и н ц и п тот же.

Р е а к т и в ы те же и дополнительно 0,85 %

раствор хлорида натрия.

О б о р у д о в а н и е  т о же.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Бестромбоцитарная исследуемая и донорская

плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Донорскую плазму

разводят 0,85 % раствором хлорида натрия в

соотношении 1 : 1. В пробирку набирают 0,2 мл

раствора хлорида кальция, добавляют 0,1 мл

суспензии тромбопластина и ставят в водяную

баню. Через 30 с вводят туда же 0,1 мл разве-

денной плазмы, немедленно включают секундо-

мер и отмечают время образования сгустка.

Исследование повторяют и берут средний ре-

зультат. Точно так же определяют протромбино-

вое время исследуемой плазмы.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы примерно

те же, колеблются в зависимости от активности

тромбопластина.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е  т о же.

Унифицированный метод определения про-

тромбинового времени капиллярной крови

(1974).  П р и н ц и п . Определяют время свер-

тывания цитратной капиллярной крови при до-

бавлении суспензии тромбопластина и раствора

хлорида кальция.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. 0,5 % раствор хлорида каль-

ция. 3. 1 % или 2 % суспензия тромбопластина.

О б о р у д о в а н и е .  1 . Водяная баня  н а

37 °С. 2. Секундомеры. 3. Скарификаторы. 4.

Микропипетки вместимостью 0,1 мл.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Цитратная исследуемая и донорская кровь.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В микропипетку

набирают 0,02 мл раствора цитрата натрия.

Мякоть пальца донора протирают спиртом и

после его высыхания делают прокол стериль-

ным скарификатором. Набирают в ту же микро-
пипетку 0,08 мл свободно выступающей крови,

немедленно выдувают содержимое в пробирку

и перемешивают кровь с антикоагулянтом. Точ-

но так же набирают цитратную кровь еще в две

пробирки. Каждую пробирку устанавливают по-

следовательно в водяную баню и через 1 мин

добавляют 0,1 мл суспензии тромбопластина и

0,1 мл раствора хлорида кальция. В момент до-

бавления последнего реактива включают секун-

домер и отмечают время образования сгустка.

Вычисляют средний результат. Точно так же

берут цитратную кровь у обследуемого лица и

определяют ее протромбиновое время.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы примерно

те же, колеблются в зависимости от активности

тромбопластина.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е  т о же.

Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Бар-

каган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лаборатор-

ные методы исследования системы гемостаза.—

Томск, 1980, с. 169—170.

4.4.5. Время свертывания плазмы

при активации фактора X

Относящиеся к этой группе пробы можно

представить как еще две важные модификации

определения времени рекальцификации. В од-

ном случае к плазме перед рекальцификацией

добавляют только активатор фактора X, а в

другом — активатор фактора X и заменитель

тромбоцитарного тромбопластина. Таким обра-

зом, в одном случае обеспечивается стандарт-

ная активация только фактора X, а в другом —

стандартная активация фактора X и стандарт-

ная фосфолипидная активация. В качестве ак-

тиватора фактора X используют яд гадюки Рас-

села (препарат стипвен) или яд отечественной
гюрзы (препарат лебетокс), а в качестве заме-

нителя тромбоцитарного тромбопластина —

эритрофосфатид или кефалин. Сопоставление

результатов этих проб между собой и с резуль-

татами определения протромбинового времени

позволяет дифференцировать недостаточность

фактора 3 тромбоцитов и дефицит плазменных

факторов  V I I и X. На основе лебетокс-эритро-

фосфатидного (стипвен-кефалинового) времени

разработан количественный метод определения

активности фактора X.

Метод определения лебетокс-времени (стип-

вен-времени).  П р и н ц и п . Исследуется время

рекальцификации тромбоцитарной плазмы в ус-

ловиях стандартной активации фактора X.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8% раствор цитрата

натрия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хло-

рида кальция (см. 4.4.2). 3. Раствор лебетокса

или стипвена («Стаго», Франция, и др.) с актив-

ностью 15—20 с, т. е. в условиях опыта, опи-

сываемых ниже, нормальная плазма должна

свернуться за 15—20 с. 4. 0,85 % раствор хло-

рида натрия или буфер Михаэлиса рН 7,35

(см. 4.3.5).

О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на

37 °С. 2. Секундомеры.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Тромбоцитарная плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В одну пробирку

наливают 0,1 мл исследуемой плазмы и 0,1 мл

159

0,85 % раствора хлорида натрия (буфера Ми-

хаэлиса), а в другую — 0,1—0,15 мл рабочего

раствора лебетокса или стипвена и 0,1—0,15 мл

раствора хлорида кальция. Обе пробирки поме-

щают в водяную баню. Через 1—2 мин из про-

бирки, содержащей смесь растворов лебетокса и

хлорида кальция, 0,2 мл переносят в пробирку

с исследуемой плазмой. В момент добавления

смеси включают секундомер и отмечают время

образования сгустка. Исследование повторяют и

вычисляют средний результат.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 15—20  с .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Удлинение

лебетокс (стипвен)-времени наблюдается при

врожденной недостаточности факторов X, V, II

и I, тяжелых поражениях паренхимы печени,

механической желтухе, нарушениях всасывания

в кишечнике, лечении антивитаминами К, тром-

боцитопениях, тромбоцитопатии с недостаточ-

ностью фактора 3 тромбоцитов, диссемини-

рованном внутрисосудистом свертывании крови

и остром фибринолизе. Нормальное лебетокс

(стипвен)-время в сочетании с удлинением про-

тромбинового времени указывает на недостаточ-

ность фактора VII.

Метод определения лебетокс-эритрофосфа-

тидного (лебетокс-кефалинового, стипвен-кефа-

линового) времени.  П р и н ц и п . Исследуется

время рекальцификации бестромбоцитарной

плазмы в условиях стандартной активации фак-

тора X и стандартной фосфолипидной акти-

вации.

Р е а к т и в ы те же и еще эритрофосфатид

(кефалин) с активностью 60—70 с. Рабочая

его концентрация 0,01 % (см. 4.4.3).

О б о р у д о в а н и е то же.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Бестромбоцитная плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я отличается  о т

предыдущего только тем, что вместо изотони-

ческого раствора хлорида натрия к плазме до-

бавляют эмульсию эритрофосфатида.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 15—20  с .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е такое же,

за исключением того, что недостаточность фак-

тора 3 тромбоцитов не влияет на это время. Уд-

линение лебетокс-времени в сочетании с нор-

мальным лебетокс-эритрофосфатидным време-

нем свидетельствует о дефиците фактора 3 тром-

боцитов.

Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Исследо-

вания системы гемостаза в клинике (методиче-

ские указания).— Барнаул, 1975, с. 132—133;

Caen J., Larrieu М. 1., Samama M. L'hemostase.

Methodes d'exploration et diagnostic pratique.—

Paris, 1968, p. 136—137.

4.4.6. Время свертывания плазмы

при прямой стимуляции превращения

фибриногена в фибрин (тромбиновое

и рептилазовое время)

Методы основаны на способности тромбина

и рептилазы (фермента змеиного яда) индуци-

ровать превращение фибриногена в фибрин без

участия других факторов свертывания крови.

Рептилаза в отличие от тромбина отщепляет от

молекулы фибриногена только 2 фибринопеп-

тида А (тромбин высвобождает дополнительно

2 фибринопептида В), не активирует фактор  X I I I

и не инактивируется комплексом гепарин — анти-

тромбин  I I I . Обе пробы позволяют оценить ко-

нечный этап свертывания крови, поскольку ре-

зультаты зависят лишь от концентрации фибри-

ногена, его свойств (структуры) и  н а л и ч и я в

крови ингибиторов тромбина. Важно отметить,

что гепарин не влияет на рептилазовое время,

поэтому гипергепаринемию легко распознать по

удлинению тромбинового времени в сочетании

с нормальным рептилазовым временем. Продук-

ты деградации фибрина, угнетающие действие

тромбина на фибриноген и замедляющие поли-

меризацию фибрин-мономера, удлиняют как

тромбиновое, так и рептилазовое время.

Метод определения тромбинового времени.

П р и н ц и п . Определяется свертывание плаз-

мы при добавлении раствора тромбина со стан-

дартной активностью.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. Буфер Михаэлиса рН 7,35

(см. 4.3.5). 3. Свежеприготовленный раствор

тромбина с активностью 15—18 с. Обычно 1—3 мг

сухого тромбина с помощью стеклянной палочки

растворяют в 1 мл буфера Михаэлиса и полу-

чают раствор, вызывающий свертывание рав-

ного объема (0,1—0,2 мл) 0,1 % раствора фиб-

риногена или адсорбированной нормальной

плазмы (см. 4.4.10), разведенной в 2—2,5 раза

буфером Михаэлиса, за 5—7 с. Непосредственно

перед работой этот раствор разводят буфером

Михаэлиса так, чтобы он вызвал свертывание

равных объемов вышеупомянутых субстратов за

15—18 с, и ставят в ледяную баню. Все растворы

тромбина готовят и хранят в силиконированных

пробирках. 4. 0,1 % раствор бычьего фибрино-

гена. Готовят на 0,85 % растворе хлорида нат-

рия или буфере Михаэлиса. При взвешивании

сухого фибриногена учитывают весовое соотно-

шение свертываемого белка и буферных солей,

указываемое в сопроводительной инструкции к

препарату. Если, например, известно, что в пре-

парате фибриногена на 1 г свертываемого белка

приходится 2 г буферных солей, то в 100 мл

изотонического раствора хлорида натрия раст-

воряют не 100 мг препарата, а 300 мг.

О б о р у д о в а н и е . Водяная баня  н а

37 °С. Секундомеры.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Тромбоцитная или бестромбоцитная

плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку нали-

вают 0,2 мл плазмы и ставят в водяную баню.

Через 1 мин добавляют 0,2 мл раствора тромби-

на, немедленно включают секундомер и отме-

чают время свертывания плазмы. Опыт повто-

ряют и берут средний результат.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 15—18  с .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Удлинение

тромбинового времени наблюдается при врож-

денной недостаточности фибриногена (афиб-

риногенемия, гипофибриногенемия, дисфибри-

ногенемия), диссеминированном внутрисосуди-

160

стом свертывании крови, остром фибринолизе,

тяжелых поражениях паренхимы печени и на-

л и ч и и в крови ингибиторов тромбина. Опре-

деление тромбинового времени является одним

из распространенных методов контроля за лече-

нием гепарином и фибринолитиками.

Л и т е р а т у р а . Андреенко Г. В., Караба-

сова М. А., Лютова Л. В. и др. Методы исследо-

в а н и я фибринолитической системы крови. М.:

Изд-во Московск. ун-та, 1981, с. 43; Балу-

да В. П., Баркаган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др.

Лабораторные методы исследования системы

гемостаза.—Томск, 1980, с. 185—186, 300—301.

Метод определения рептилазового времени.

П р и н ц и п. Исследуется время свертывания

плазмы при добавлении раствора рептила?,ы со

стандартной активностью.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. Раствор рептилазы с актив-

ностью 15—17 с («Стаго», Франция; «Пента-

фарм», Швейцария и др.).

О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на

37 °С. 2. Секундомеры.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Тромбоцитная или бестромбоцитная

плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку наби-

рают 0,2 мл исследуемой плазмы и ставят в во-

дяную баню. Через 1 мин добавляют 0,1 мл

раствора рептилазы, немедленно включают се-

кундомер и отмечают время появления сгустка.

Определение повторяют и вычисляют средний

результат.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы :  1 5 —  1 7  с .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Рептила-

зовое время удлиняется при врожденной недо-

статочности фибриногена (афибриногенемия,
гипофибриногенемия, дисфибриногеиемия), дис-

семинированном внутрисосудистом свертывании,

фибринолизе, тяжелых поражениях  п а р е н х и м ы

печени и  н а л и ч и и в крови некоторых ингибито-

ров свертывания. При  г и п е р г е п а р и н е м и и репти-

лазовое время не изменяется.

П р и м е ч а н и е . Действие, подобное реп-
тилазе, оказывает яд ямкоголовои змеи, средне-

азиатского щитомордника. Тест с этим ялом
проводят так же, как и пробу с  р е п т и л н з о й .

Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Барка-

ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные
методы исследования системы гемостаза.- -

Томск, 1980, с. 186—189.

4.4.7. Тромбоэластография

П р и н ц и п . С помощью прибора тромбо-

эластографа (гемокоагулографа, гемокоагуло-

метра) регистрируют начало свертывания и из-

менения упругости сгустка крови во времени.

Метод позволяет определять образование, рет-

ракцию и лизис (растворение) сгустка крови.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. Раствор хлорида кальция (кон-

центрация указывается в инструкции к при-

бору).

О б о р у д о в а н и е . Тромбоэластограф (ге-

мокоагулограф, гемокоагулометр).

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Цельная нестабилизированная кровь (в этом

случае реактивы не требуются), цитратная

кровь, цитратная плазма.

Х о д  о п р е д е л е н и я соответствует ин-

струкции (в зависимости от типа тромбоэластог-

рафа).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Устанав-

ливаются эмпирически для каждого прибора.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . С по-

мощью тромбоэластографа (гемокоагулографа)

могут быть выявлены и количественно оценены

хронометрическая и/или структурная гипокоа-

г у л я ц и я (замедленное свертывание и/или об-

разование недостаточно упругого сгустка кро-

в и ) , хронометрическая и/или структурная ги-

перкоагуляция (ускоренное свертывание и/или

образование чрезмерно упругого сгустка крови),

гипоретракция и гиперретракция сгустка крови

( п о н и ж е н н о е или повышенное  н а п р я ж е н и е рет-

рактильных  с и л ) , а также гипофибринолиз и

гинерфибринолиз (замедленное или ускоренное

уменьшение упругости образовавшегося сгустка

достижения максимальных значений).

П р и м е ч а н и е. Наряду с традицион-

ным способом расшифровки тромбоэласто-

г р а м м ы  ( г е м о к о а г у л о г р а м м ы ) , описываемым

в инструкции к прибору и основанным на

а н а л и з е ряда графических параметров с точ-

ки зрения их длительности или амплитуды,

разработан и внедрен способ, базирующийся

на оценке физической и биологической сущ-

ности явлений, регистрируемых на тромбо-

эластограмме (гемокоагулограмме). Этот

способ позволяет оценивать ряд параметров

сгустка в конкретных физических единицах

(напряжение ретрактильных сил, плотность

сгустка, структурная вязкость сгустка и др.).

Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Барка-

ган 3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные

методы исследования системы гемостаза.—

Томск, 1980, с. 222—230; Якунин Г. А. Современ-

ные методы  а н а л и з а громбодинамограммы (ме-

тодическое пособие). Ч. 1.- М., 1973.

4.4.8. Электрокоагулография

П р и н ц и п . С помощью прибора электро-

коагулографа регистрируются начало свертыва-

ния и изменения электрического сопротивления

сгустка крови во времени. Метод позволяет

определять образование, ретракцию и лизис

сгустка крови.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. Раствор хлорида кальция (кон-

центрация указывается в инструкции к при-

бору).

Оборудование. Коагулограф Н-334.
М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Цельная нестабилизированная кровь (в этом

случае реактивы не требуются), цитратная

кровь, цитратная плазма.

6 п/р В. В. "Меньшикова

161

Рис. 7. Аутокоагулограмма и ее параметры. На оси ординат — свертывающая активность гемо-

лизат-кальциевой смеси (ГКС) в процентах; на оси абсцисс —- время инкубации ГКС в минутах.
А — свертывающая активность гемолизат-калышевой смеси (ГКС) на 2-й минуте инкубации; МА — макси-

мальная свертывающая активность ГКС; T1 — время достижения '/2 максимальной свертывающей актив-

ности ГКС; Т2 — время достижения максимальной свертывающей активности ГКС; Т — время от начала

инкубации ГКС до момента, когда ее свертывающая активность в процессе снижения вновь достигает '/2

максимальной свертывающей активности.

Х о д  о п р е д е л е н и я соответствует ин-

струкции.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Устанав-

ливаются эмпирически для каждого прибора.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . С по-

мощью электрокоагулографа (коагулографа)

могут быть выявлены и количественно оценены

хронометрическая и/или структурная гипокоагу-

ляция (замедленное свертывание и/или образо-

вание сгустка с недостаточно высоким электри-

ческим сопротивлением), хронометрическая и/

или структурная гиперкоагуляция (ускоренное

свертывание и/или образование сгустка с чрез-

мерно высоким электрическим сопротивлением),

а также гипофибринолиз и гиперфибринолиз

(замедленное или ускоренное уменьшение элект-

рического сопротивления образовавшегося сгуст-

ка крови после достижения максимальных зна-

чений).

Л и т е р а т у р а . Ватмахер У. А., Толстопя-

това И. А., Пьянкова Т. И. Коагулограф — но-

вый портативный прибор для исследования

системы свертывания крови.— Лаб. дело, 1969,

№ 8, с. 496—499.

4.4.9. Аутокоагуляционный тест

Исследуется динамика нарастания и после-

дующего снижения тромбопластин-тромбино-

вой активности в испытуемой плазме при ее

рекальцификации в присутствии гемолизата эрит-

роцитов обследуемого (рис. 7). Аномальные ре-

зультаты регистрируются при дефиците факто-

ров  X I I , XI, X, IX, VIII, II и I, а также при из-

бытке быстро и медленно действующих анти

тромбинов. Метод применяется главным обра-

зом в научных исследованиях.

Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Исследова-

ние системы гемостаза в клинике (методические

указания).—Барнаул, 1975, с. 83—87; Сятков-

ский В. А., Василенко Л. П., Применение ауто-

коагуляционного теста в клинических лабора-

торных исследованиях.— Лаб. дело, 1981, № 8

с. 459—462.

4.4.10. Тест генерации тромбопластнна

Тест Биггс — Дугласа (модифицированный).

П р и н ц и п . Определяется активность тромбо-

пластина, образующегося в смеси ингредиентов,

приготовленных из исследуемой крови, и кор-

рекция выявленных нарушений аналогичными

ингредиентами нормальной крови. При нормаль-

ном содержании в крови факторов V и X, что

устанавливается путем дополнительного опре-

деления протромбинового времени, этот тест

позволяет выявлять и дифференцировать недо-

статочность плазменных факторов  V I I I , IX и

XI + ХП, а также фактора 3 тромбоцитов.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата нат-

рия (см. 4.1). 2. 0,025 моль/л раствор хлорида

кальция (см. 4.4.2). 3. 0,85 % раствор хлорида

натрия. 4. Нитратная нормальная пул-плазма,

162