Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 31

Лейкоциты —  в ы с о к о с п е ц и а л и з и р о в а н н ы е

клетки, обладающие различными защитными

функциями. Благодаря фагоцитарной активно-

сти, участию в клеточном и гуморальном имму-

нитете, обмене гистамина, гепарина, реализу-

ются антимикробные, антитоксические, антите-

лообразующие и другие важнейшие компоненты

иммунологических реакций.

Количество лейкоцитов в крови изменяется

под влиянием различных внешних факторов:

сезонных, климатических, метеорологических,

периодов солнечной активности, а также при

разных физиологических состояниях организма

(возрастные изменения, беременность, фазы

менструального цикла и пр.) и разнообразной

патологии.

Поэтому исследование числа лейкоцитов в

крови — одно из самых распространенных в ла-

бораторной практике. Они проводятся не только

заболевшим (обязательно всем больным в ста-

ционаре и амбулаторным по показаниям), но и

здоровым при профилактических осмотрах дет-

ского населения, рабочих, и служащих некото-

рых производств, диспансеризации и других оз-

доровительных мероприятиях.

3.4.1. Подсчет количества

Подсчет количества лейкоцитов входит в со-

став общего клинического анализа крови, а так-

же «укороченного» анализа (содержание гемо-

глобина, число лейкоцитов, СОЭ), иногда в экст-

ренных случаях исследуют только количество

лейкоцитов (при подозрении на острый воспали-

тельный процесс и др.).

Унифицированный метод подсчета в автома-

тическом счетчике (1972).  П р и н ц и п . Боль-

шинство счетчиков основано на кондуктометри-

ческом методе. Клетки, находящиеся в растворе

электролита, пропущенные через электрическое

поле, изменяют сопротивление электрической це-

пи. Возникший импульс регистрируется счетным

устройством с цифровой индикацией.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Ав-

томатический счетчик.

Р е а к т и в ы и  х о д  о п р е д е л е н и я

соответствуют инструкции, приложенной к при-

бору.

Унифицированный метод подсчета в счетной

камере (1972).  П р и н ц и п . Подсчет лейкоци-

тов под микроскопом в определенном количестве

квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл

крови (или 1 л по системе СИ), исходя из объема

квадратов и разведения крови.

Р е а к т и в ы . 3—5 % раствор уксусной кис-

лоты, подкрашенный несколькими каплями раст-

вора метиленового синего (для окраски ядер

лейкоцитов). Раствор голубого цвета, длительно

годен к употреблению.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

1. Микроскоп. 2. Счетная камера Горяева.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Разводят исследуе-

мую кровь в 20 раз, для этого в сухую пробирку

наливают 0,4 мл уксусной кислоты. Набирают

из пальца 0,02 мл крови (можно использовать

стабилизированную антикоагулянтом венозную

кровь). Кончик пипетки вытирают фильтроваль-
ной бумагой или марлей, следя за тем, чтобы

из пипетки кровь не вылилась. Выдувают кровь

из пипетки на дно пробирки, тщательно переме-

шивают (повторно набирая и выдувая смесь

крови с уксусной кислотой). Маркируют про-

бирку и оставляют до момента счета (допуска-

ется счет лейкоцитов не более чем через 2—4 ч

после взятия крови).

Подготавливают счетную камеру: протирают

насухо камеру с сеткой и покровное стекло,

затем притирают стекло к камере, слегка надав-

ливая его таким образом, чтобы по краям стекла

появились радужные кольца или полосы (это

свидетельствует о высоте камеры — 0,1  м м ) . За-

полняют счетную камеру разведенной кровью:

предварительно встряхивают несколько раз со-

держимое пробирки, затем пастеровской пипет-

кой или стеклянной палочкой отбирают каплю

разведенной крови и подносят ее к краю покров-

ного стекла, следя за тем, чтобы кровь без пу-

зырьков воздуха равномерно заполнила всю

поверхность сетки, не затекая в бороздки. За-

полненную камеру оставляют в горизонтальном

положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов).

Не меняя горизонтального положения камеры,

помещают ее на столик микроскопа и подсчиты-

вают лейкоциты в 100 больших квадратах с ма-

лым увеличением (окуляр 10 X, объектив  8 Х ) .

Для большей точности счет лейкоцитов проводят

по всей сетке в больших квадратах (неразделен-

ных на малые квадраты и полосы), начиная с ле-

вого верхнего угла сетки. Для лучшего контрас-

тирования затемняют поле зрения, опуская кон-

денсор и закрывая диафрагму. Считают клетки,

расположенные внутри квадрата и лежащие на

любых двух линиях (чтобы дважды не подсчи-

тать одну клетку).

Расчет числа лейкоцитов проводят, исходя из

разведения крови (20), числа сосчитанных квад-

ратов (100) и объема одного большого квадрата

( мкл, так как сторона квадрата — мм,

250

 о

где X — число лейкоцитов в 1 мкл крови; а —

число лейкоцитов в 100 больших квадратах.

Практически количество сосчитанных лейко-

цитов умножают на 50.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Количество

лейкоцитов в крови колеблется в пределах

4000—8800 в 1 мкл, или 4- 10

9

—8,8- 10

9

 в 1 л

(по системе СИ). Число лейкоцитов в крови —

наиболее вариабельный лабораторный показа-

тель. Оно может изменяться в течение дня,

в связи с приемом пищи, после физической на-

грузки, под влиянием различных диагностичес-

ких процедур, медикаментозных воздействий.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние количества лейкоцитов — лейкоцитоз —

наблюдается при различных воспалительных

процессах, острых бактериальных инфекциях,

интоксикациях, шоке, острых кровопотерях, ко-

123

матозных состояниях, гемолитическом кризе,

почечной колике, аллергических реакциях, опу-

холях. Резкое увеличение количества лейкоци-

тов в крови (50- 10

9

/л — 100- 10

9

/л и более)

характерно для развернутой стадии хроничес-

кого миелолейкоза и хронического лимфолей-
коза.

Снижение количества лейкоцитов — лейко-

пения — наблюдается при вирусных инфекциях,

некоторых хронических инфекциях, сепсисе,

циррозе печени, хроническом активном гепатите,

аутоиммунных заболеваниях, после приема ци-

тостатических препаратов, антибиотиков, суль-

фаниламидов и других медикаментов. Особенно

резкая лейкопения (2- 10

9

/л и менее) наблюда-

ется при апластической анемии, агранулоцитозе,

после лучевых воздействий.

Л и т е р а т у р а . Грибова И. А. Гематоло-

гическая норма.— В кн.: Руководство по гема-

тологии/Под ред. А. И. -Воробьева, Ю. И. Ло-

рие. М.: Медицина, 1979, с. 53.

3.4.2. Лейкоцитарная формула

Лейкоцитарную формулу (процентное соот-

ношение  р а з л и ч н ы х видов лейкоцитов) подсчи-

тывают в окрашенных мазках крови. Методы

фиксации и окраски мазков крови, а также

микроскопического исследования мазков унифи-

цированы.

Унифицированный метод морфологического

исследования форменных элементов крови с

дифференциальным подсчетом лейкоцитарной

формулы (1979).  П р и н ц и п . Микроскопия

сухих фиксированных и окрашенных мазков

крови с дифференцированием различных форм

лейкоцитов. Этапы исследования, включающие

приготовление мазков крови, подготовку пред-

метных стекол, фиксацию мазков и их окраску,

изложены в разделе 3.3.2.

Р е а к т и в ы . 1. Иммерсионное масло. 2. Ди-

этиловый эфир.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

1. Микроскоп. 2. 11-Клавишный счетчик для

подсчета лейкоцитарной формулы.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . С помощью

объектива 10 X (малого увеличения) находят

край мазка крови. Наносят каплю иммерсион-

ного масла и, не меняя положения стекла, пере-

водят иммерсионный объектив (90 X) таким

образом, чтобы он погрузился в каплю масла.

Подбирают с помощью микровинта соответству-

ющее фокусное расстояние, устанавливая чет-
кую видимость клеток. Приступают к дифферен-

цированию лейкоцитов, отмечают клетки с помо-

щью 1 1-клавишного счетчика; необходимо про-

считать не менее 100 лейкоцитов. Подсчет лей-

коцитов проводят, соблюдая следующее прави-

ло: отступив 2—3 поля зрения от края мазка,

затем 3—5 полей зрения вдоль края мазка, за-

тем 3—5 полей зрения под прямым углом по на-

правлению к середине мазка, снова 3—5 полей

зрения параллельно краю, затем под прямым

углом по направлению к краю и т. д.; таким об-

разом, стекло двигают по зигзагу (линия «меан-

дра»). Просчитав около половины клеток на од-

ном крае мазка, меняют положение стекла и дру-

гую половину клеток считают на противопо-

ложном крае.

При исследовании лейкоцитарной формулы

необходимо дифференцировать неразрушенные

лейкоциты. Если при подсчете 100 лейкоцитов

отмечаются какие-либо отклонения от нормы

(например, увеличение числа палочкоядерных

форм, эозинофилов, лимфоцитов или появление

лейкоцитов, не обнаруживаемых у здоровых

людей), необходимо подсчитать еще 100 лей-

коцитов и вывести средний результат. В табл. 25

представлены основные морфологические осо-

бенности различных лейкоцитов.

Исследование лейкоцитарной формулы с по-

мощью автомата. Современные гематологи-

ческие автоматы для подсчета лейкоцитарной

формулы основаны на двух принципах.

П р и н ц и п  1 . Дифференцировка лейкоци-

тов с помощью микроскопа в окрашенных маз-

ках крови путем сравнения морфологических

характеристик клеток крови со стандартными,

хранящимися в памяти компьютера (автомат

«Hematrak» фирмы «Opton», ФРГ, и др.).

П р и н ц и п  2 . Дифференцировка лейкоци-

тов не в мазках, а в цельной крови в зависи-

мости от размера и цитохимических свойств

клеток с применением селективных окрасок (ав-

томат «Hemalog D» фирмы «Technicon», США).

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Ав-

томат для подсчета лейкоцитарной фбрмулы.

Х о д  и с с л е д о в а н и я соответствует ин-

струкции, приложенной к автомату.

Существующие автоматы для подсчета

лейкоцитарной формулы отличаются не только

принципом работы, но и количеством дифферен-

цируемых лейкоцитов в 1 пробе, по возможности

идентификации патологических форм,  н а л и ч и -
ем контрольного устройства, устройства для

приготовления мазков и их окраски и пр.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В табл.  2 5

представлены процентные и абсолютные значе-

ния различных лейкоцитов и их морфологичес-

кие особенности у здоровых людей.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Изменения

лейкоцитарной формулы сопутствуют многим

заболеваниям и нередко являются неспецифиче-

скими. Тем не менее диагностическое значение

этого исследования велико, оно дает представле-

ние о тяжести состояния, эффективности тера-

пии. При гемобластозах исследование лейкоци-

тарной формулы особенно диагностически зна-

чимо. Обнаружение в крови властных клеток

(см. 3.6) является опорным пунктом для диагно-

за острого лейкоза.

Повышение числа нейтрофилов — нейтрофи-

лез, как правило, сочетается с увеличением об-

щего числа лейкоцитов в крови и наблюдается

при острых воспалительных процессах, интокси-

кациях, шоковых состояниях, при кровотече-

ниях, инфаркте миокарда, гемолитическом кри-

зе. Нередко этим состояниям сопутствует и повы-

шение числа палочкоядерных нейтрофилов, и по-

явление незрелых гранулоцитов (миелоциты, ме-

тамиелоциты) в небольшом количестве (сдвиг

формулы влево). Максимальной степени эти из-

менения достигают при миелопролиферативных

124

ц а 25. Характеристика различных видов лейкоцитов здоровых людей

Вид

Количество
в %

в 1 мкл

Размер

клетки, мкм

Ядро: форма

структура

окраска

Цитоплазма

Зернистость,

ее окраска.

характер

Нейтрофилы

палочкоядерные

1—6

40—300

10—15

Узкое, вытяну-

тое в виде па-

лочки

Неравномер-

ная крупно-

глыбчатая

Темно-фиоле-

товая

Розоватая

Обильная, мел-

кая, бледно -

фиолетовая

сегментоядерные

47—72

2000—5500

10—15

Узкое, состо-

ит из

 3 — 5 сег-

ментов

Неравномер-

ная крупно-

глыбчатая

Темно-фиоле-

товая

Розоватая

Обильная, мел-

кая, бледно-

фиолетовая

Эозинофилы

0,5—5

20—300

12—15

Несколько

шире, чем у

нейтрофи-

ла, состоит

из

 2—3 сег-

ментов

Неравно-

мерная

крупно-

глыбчатая

Фиолетовая

Бледно-

розовая

Обильная,

занимает

всю цито-

плазму,

крупная,

розовая

Базофилы

0—1

0—65
8—12

Неопреде-

ленное,

иногда в

виде листа

растения

Неравно-

мерная

крупно-

глыбчатая

Фиолетовая

Бледно-ро-

зоватая не-

редко с раз-

мытыми

участками

(растворен-

ные грану-

лы)

Необиль-

ная, нерав-

номерная,

фиолетовая

Лимфоциты

19—37

1200—3000

8—10

Округлое

или бобо-

видное

Неравно-

мерная

крупно-

глыбчатая

Темно-

фиолетовая

В виде узко-

го ободка

иногда ши-

рокая зона

голубая

Изредка

единичные

фиолетовые

гранулы

Моноциты

3—11

90—600

15—20

Полиморф-

ное: округ-

лое, бобо-

видное, с

в д а в л е н и я -

ми

Равно-

мерная

сетчатая

Светло-

фиолетовая

Обильная

бледно-го-

лубая или

сероватая

Непостоян-

но, иногда

мелкая

бледно-

фиолетовая

заболеваниях, особенно хроническом миелолей-

козе. При этом резко увеличивается общее коли-

чество лейкоцитов (50- 10

;9

/л — 100 • 10

9

/л и бо-

лее) и в значительном проценте в лейкоцитарной

формуле обнаруживают промиелоциты (3—

5%), миелоциты (до 10%), метамиелоциты

(до 10—15 %) и единичные властные клетки,

при этом число зрелых нейтрофилов существен-

но уменьшается. Такого типа изменения могут

быть и реактивными (лейкемоидные  р е а к ц и и ) ,

и сопутствовать сепсису, туберкулезу, метаста-

зам злокачественных опухолей в костный мозг.

Снижение числа нейтрофилов — нейтропе-

ния — обычно сочетается с лейкопенией и на-

блюдается при вирусных инфекциях, некоторых

хронических инфекциях, после приема различ-

ных медикаментов (особенно цитостатических),

после лучевой терапии. Максимальная степень

нейтропении наблюдается при апластической

анемии, агранулоцитозе.

Увеличение числа эозинофилов — эозинофи-

лия — сопутствует аллергическим реакциям,

глистной инвазии, некоторым детским инфек-

циям, особенно скарлатине, иногда опухолям,

лимфогранулематозу и др. Увеличение числа

базофилов — базофилия — встречается редко и

вместе с эозинофилией может быть признаком

миелопролиферативного заболевания.

Увеличение числа лимфоцитов — лимфоци-

тоз — наблюдается при инфекционном лимфо-

цитозе, коклюше, туберкулезе, после удаления

селезенки. Наибольшей степени лимфоцитоз до-

стигает при хроническом лимфолейкозе (70—

90 %) и сочетается с высоким лейкоцитозом

(50-10

9

/л и выше). Относительный лимфоци-

тоз — явление нередкое и наблюдается во всех

случаях лейкопении с нейтропенией. Увеличе-

ние числа моноцитов — моноцитоз — обнару-

живается при хронических инфекциях, опухо-

лях и особенно резкое — при хронических моно-

цитарных лейкозах.

Л и т е р а т у р а . Золотницкая Р. П. Лаб.

дело., 1983, № 5, с. 36—38.

3.4.3. Лейкоконцентрат

Приготовление и исследование лейкокон-

центрата проводят в случаях выраженных лей--

копений, когда исследование лейкоцитарной

формулы затруднено, а также для обнаружения

патологических элементов, не выявляемых в

мазках крови (например, при алейкемической

125

стадии острых лейкозов, при лимфогранулема-

тозе, миеломной болезни и др.). Лейкоконцент-

рацию можно проводить при неотчетливых ре-

зультатах стернальной пункции. Все существу-

ющие методы лейкоконцентрации основаны на

следующем: 1) гемолиз, 2) центрифугирование

и 3) седиментация.

Наиболее физиологичны методы, основанные

на седиментации форменных элементов крови,

они наиболее распространены.

Метод с трилоном Б.  П р и н ц и п . В связи

с различным удельным весом эритроцитов и лей-

коцитов и добавлением трилона Б, ускоряющего

осаждение эритроцитов, получают плазму, со-

держащую большое количество лейкоцитов.

Р е а к т и в ы . 1. 3% раствор трилона Б.

2. Краска Романовского — Гимзы или азур-

эозина. 3. Метанол для фиксации мазков.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

1. Микроскоп. 2. Термостат на 37 °С. 3. Центри-

фуга.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку с 1 мл

3 % раствора трилона Б вносят 4 мл венозной

крови и осторожно перемешивают. Ставят смесь

крови с трилоном в термостат (можно отстаи-

вать и при комнатной температуре) на 30—

45 мин (за это время над эритроцитами образу-

ется 2—3 мл прозрачной плазмы). С помощью

пастеровской пипетки отсасывают в центрифуж-

ную пробирку слой плазмы, стараясь не захва-

тывать эритроциты. Центрифугируют при

1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную

жидкость удаляют, а из осадка готовят мазки

(помещают каплю осадка пастеровской пипет-

кой на предметное стекло и готовят мазок).

Мазки высушивают на воздухе, фиксируют и ок-

рашивают гематологическими красителями

(см. 3.3.2).

Метод с гепарином может быть использован

при необходимости удаления тромбоцитов.

П р и н ц и п . При центрифугировании плаз-

мы, разведенной холодным изотоническим раст-

вором хлорида натрия, тромбоциты оседают

в осадок, а лейкоциты остаются во взвешенном

состоянии.

Р е а к т и в ы . 1. Гепарин (500 ЕД/мл).

2. 0,85 % раствор хлорида натрия.

О б о р у д о в а н и е то же, что и в методе

с трилоном Б.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку с 1 мл

гепарина добавляют 4 мл крови. Отстаивают

40—45 мин. С помощью пастеровской пипетки

отбирают плазму в центрифужную пробирку,

стараясь не захватить эритроциты. Центрифу-

гируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Над-

осадочную жидкость удаляют, а к осадку добав-

ляют 5 мл холодного 0,85 % раствора хлорида

натрия. Центрифугируют при 500—800 об/мин

в течение 10—15 мин (если в осадке имеется

примесь эритроцитов, то повторно центрифуги-

руют с холодным раствором хлорида  н а т р и я ) .

Из осадка готовят мазки и окрашивают их

гематологическими красителями.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . При иссле-

довании лейкоконцентрата у 50 здоровых людей

Р. А. Поспелова получила следующую лейко-

грамму: нейтрофилы палочкоядерные 1,2±

±0,1 %, сегментоядерные 58,8 ±0,7 %, эози-

нофилы 1,8±0,05%, базофилы 0,7 + 0,08%,

лимфоциты 31,2±1 %, моноциты 7,1 ±0,3%,

плазматические клетки 0,2 ±0,03 %. У одного

человека обнаружено 0,2 % миелоцитов, у 2—

0,2 и 0,4 % метамиелоцитов, у 2— единичные

фрагменты ядер мегакариобластов.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Исследо-

вание мазков лейкоконцентрата имеет сущест-

венные преимущества перед исследованием маз-

ков периферической крови при острых лейкозах,

особенно при лейкопенических формах. Это ис-

следование дает возможность выявить властные

клетки, оценить полноту ремиссии при остром

лейкозе, а также провести цитохимические ис-

следования, имеющие важное диагностическое

значение при острых лейкозах (см. 3.6).

Выявление в мазках лейкоконцентрата ядер

мегакариоцитов наблюдается при миелопроли-

феративных заболеваниях, особенно доброка-

чественном сублейкемическом миелозе, а также

при опухолях различной локализации. Увеличе-

ние плазматических клеток может быть при

лимфогранулематозе, миеломной болезни и дру-

гих опухолях. При лимфогранулематозе могут

быть найдены предстадии клеток Березовско-

го — Штернберга.

Л и т е р а т у р а . Поспелова Р. А. Лейко-

концентрация в клинической практике.— М.,

1973, с. 22.

3.4.4. Исследование

волчаночных клеток (LE-клетки)

Волчаночные клетки служат морфологи-

ческим проявлением иммунологического фено-

мена, характерного для системной красной вол-

чанки. Они образуются в результате фагоцитоза

нейтрофильными лейкоцитами (реже моноцита-

ми) ядер клеток, содержащих деполимеризован-

ную ДНК. Предполагают, что фагоцитируемая

субстанция представляет собой иммунный ком-

плекс, состоящий из волчаночного фактора (ан-

тинуклеарного фактора), остатков ядра лейко-

цитов и комплемента. Морфологически LE-клет-

ки характеризуются наличием в цитоплазме

нейтрофильных лейкоцитов округлого бесструк-

турного образования, напоминающего лизиро-

ванное ядро светло-фиолетового цвета, занима-

ющего центральную часть клетки с оттесненным

к периферии ядром.

Реже такое же образование выявляют в мо-

ноцитах, иногда оно расположено внеклеточно,

может образовывать фигуры «розеток» (образо-

вание, окруженное нейтрофилами). В отличие

от LE-клеток обнаруживают нейтрофилы с фа-

гоцитированной субстанцией не гомогенного ха-

рактера, а с сохраненной структурой хроматина.

Такие клетки относят к клеткам Тарта и рас-

сматривают их как предстадию LE-клеток.

Специфичными для системной красной волчанки

считают  т и п и ч н ы е LE-клетки.

Для исследования LE-феномена предложены

многочисленные методы, в основе которых лежит

инкубация клеток больного в собственной плаз-

ме (метод, предложенный Hargraves, Zimmer,

1948). Рекомендуется дополнительное механи-

126