Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 28

ленное количество разведенной изотоническим

раствором натрия хлорида или другим электро-

литом крови пропускают через микроотверстие.

Проходящая клетка увеличивает сопротивление

между электродами, возникающий импульс пе-

редается на счетное устройство с цифровой ин-

дикацией.

Х о д  и с с л е д о в а н и я соответствует ин-

струкции, приложенной к прибору.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Количест-

во эритроцитов в крови, по данным В. В. Соко-

лова, а также И. А. Грибовой (1979), состав-

ляет 4-10

6

—5,1-10

6

 в 1 мкл (4-10

| 2

/л—5,1 X

Х10

| 2

/л) у мужчин и 3,7-10

6

—4,7-10

6

 в 1 мкл

(или 3,7-10

1 2

/л — 4,7-10

12

/-") у женщин.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Снижение

числа эритроцитов в крови является одним из ос-

новных лабораторных критериев анемии. Однако

степень эритроцитопении широко варьирует при

разных формах малокровия. Так, при наиболее

распространенном заболевании — железодефи-

цитной анемии на почве хронических кровопо-

терь — количество эритроцитов может быть нор-

мальным или нерезко сниженным (3-10

6

 —

3,6-10

6

 в 1 мкл, или 3-10

|2

/л —3,6-10

12

/л).

При острой кровопотере, Вп-дефицитной анемии

(в стадии рецидива), гипопластической анемии,

гемолитических анемиях (в период криза) число

эритроцитов в крови может значительно сни-

зиться и достигнуть 1 • 10

6

 в 1 мкл, или I • 10

|2

/л

и менее.

Повышение количества эритроцитов в кро-

ви — эритроцнтоз — может быть обусловлен

многими причинами. Значительный эритроцитоз

(6,5-10

6

-8,5-10

6

 в 1 мкл, или 6,5.10'

2

/л-

8,5-10'

2

/л крови) является одним из важных

лабораторных симптомов эритремии. Другие ге-

мобластозы миелопролиферативной природы

(сублейкемический миелоз или миелофиброз и

хронический миелолейкоз) реже сопровождают-

ся эритроцитозом и только в начальной стадии

заболевания.

Вторичный (симптоматический) эритроцитоз

может сопутствовать широкому кругу различ-

ных заболеваний и бывает абсолютным (связан-

ный с усилением нормального эритропоэза) и от-

носительным (гемоконцентрационный). Абсо-

лютные эритроцитозы сопутствуют хроническим

обструктивным заболеваниям легких, врожден-

ным порокам сердца, первичной легочной гипер-

тензии, синдрому Пиквика, наследственным ге-

моглобинопатиям, гнпернефроидному раку, ге-

мангиобластоме мозжечка, гепатоме, гормо-

нально-активным опухолям, заболеваниям, со-

провождающимся стенозом почечных артерий,

заболеваниям ЦНС и др. Вторичные относитель-

ные эритроцитозы связаны с нарушением гемо-

концентрации и характеризуются нормальным

объемом циркулирующих эритроцитов при сни-

жении массы циркулирующей крови и массы

циркулирующей плазмы.

Л и т е р а т у р а . Грибова И. А. Гематоло-

гическая норма.— В кн.: Руководство по гема-

тологии / Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Ло-

рие. М.: Медицина, 1979, с. 53.

3.3,2. Исследование морфологии

эритроцитов

Морфологию эритроцитов можно исследо-

вать в световом микроскопе в нативных препа-

ратах и в окрашенных мазках крови. В клини-

ческой практике морфологию эритроцитов обыч-

но исследуют в окрашенных мазках крови,

Приготовление мазков крови унифицирован-

ным методом (1979). Мазки крови готовят на

предметных стеклах, которые предварительно

моют и обезжиривают.

Подготовка стекол. Реактивы. 1. Хозяйствен-

ное мыло — 2 % раствор или раствор стирального

порошка: 20 г растворить в 975 мл воды и доба-

вить 20 мл пергидроля. 2. Смесь Никифорова:

равные части этилового спирта % % и диэтило-

вого эфира.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е  н е

требуется.

Х о д  о б р а б о т к и  с т е к о л . Стекла (но-

вые и бывшие в употреблении) помещают в эма-

лир9ванную посуду в 2 % раствор хозяйствен-

ного мыла или стирального порошка на 8—10 ч.

Кипятят в указанном растворе 5—10 мин, ста-

рые мазки предварительно стирают ветошью или

ватным тампоном. Более длительное кипячение

или использование алюминиевой посуды не ре-

комендуют, так как стекла мутнеют. Промывают

в проточной воде. Насухо вытирают и помещают

в смесь Никифорова на 30—60 мин. Насухо вы-

тирают чистым полотенцем и хранят в широко-

горлой чистой посуде с притертой пробкой. Чи-

стые стекла рекомендуется брать либо пинцетом,

либо за края (соприкосновение пальцев с по-

верхностью стекла оставляет жирные следы).

Т е х н и к а  п р и г о т о в л е н и я  м а з -

к о в . На сухое подготовленное описанным выше

способом предметное стекло наносят мазок кро-

ви следующим образом. На стекло ближе к ко-

роткой стороне наносят стеклянной палочкой

(или непосредственно из места укола пальца)

небольшую каплю крови. Оставляют стекло в го-

ризонтальном положении и размазывают каплю

крови по стеклу с помощью чистого шлифован-

ного стекла, помещая его под углом 45°; корот-

ким ребром, подождав, пока вся кровь расплы-

вется по нему, быстро проводят по предметному

стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло,

так как при этом травмируются форменные

элементы крови.

Мазки высушивают на воздухе и маркируют

(лучше простым карандашом). Высохший мазок

должен быть равномерно тонким, желтоватого

цвета, достаточной величины (располагаться на

I—1,5 см от краев, занимать почти всю длину

стекла) и оканчиваться «метелочкой>. Толстые

(густо-розового цвета) мазки не следует ис-

пользовать, так как в них морфология клеток

плохо различима.

Более качественные мазки крови получаются

при использовании автоматических устройств:

cHemaprep» фирмы «Oplon» (ФРГ), «Slide

Spinner» фирмы «Corning Scientific Instru-

ments:» (США) и др., предназначенных для при-

готовления мазков. Благодаря такому устрой-

111

ству мазки получаются равномерные и имеют

стандартные размер и толщину.

Фиксация и окраска мазков унифицирован-

ным методом (1979). В качестве унифицирован-

ных приняты методы окраски по Нохту и Пап-

пенгейму.

Реактивы для фиксации: метиловый спирт

х. ч. или раствор эозинметиленового синего по

Маю — Грюнвальду.

Р е а к т и в ы  д л я  о к р а с к и  м а з к о в

по  Н о х т у . 1. Основной раствор азура II: 1 г

краски растворяют в 1000 мл дистиллированной

воды. Оставляют в посуде из темного стекла на

12—14 дней при комнатной температуре, после

чего используют. 2. Основной раствор эозина

калия: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистил-

лированной воды. Оставляют в посуде из тем-

ного стекла при комнатной температуре на 12—

14 дней, затем используют. 3. Фосфатный буфер

(смесь Вейзе) рН 7,4—7,5: смешивают 0,49 г ка-

лия фосфата однозамешенного безводного

(КН

2

РО4) и 0,909 г натрия фосфата двузаме-

щенного безводного. (Na2HPO4 и дистиллиро-

ванной воды 1000 мл. 4. Рабочий раствор азур-

эозина: перед употреблением смешивают 25 мл

основного раствора азура II, 20 мл основного

раствора эозина калия и 55 мл буферного раст-

вора (пропорции красителей могут варьировать,

их устанавливают опытным путем при приготов-

лении свежих партий основных растворов).

Р е а к т и в ы  д л я  о к р а с к и  м а з к о в

по  П а п п е н г е й м у . 1. Раствор эозин-метиле-

нового синего по Маю — Грюнвальду. При от-

сутствии готового раствора красителя его можно

приготовить, растворив 1 г сухого красителя

в 1000 мл метилового спирта. Раствор готов к

употреблению через 4 дня. 2. Рабочий раствор

азур-эозина по Нохту.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Кювета для фиксации и окраски мазков со шта-

тивом-контейнером (при отсутствии используют

эмалированные лотки с установленными для

стекол «рельсами» из пары стеклянных палочек,

соединенных резиновыми трубками).

Ф и к с а ц и я  м а з к о в . Фиксатор мазков

наливают либо в кювету, либо в широкогорлую

посуду с притертой пробкой. Высушенные на

воздухе мазки помещают в контейнер, который

опускают в кювету с фиксатором (или кладут по

одному в посуду) на 5—10 мин. Вынимают кон-

тейнер со стеклами из кюветы (или вынимают

пинцетом стекла и устанавливают в штативе),

оставляют на воздухе до полного высыхания.

О к р а с к а  п о  Н о х т у . Высохшие фикси-

рованные мазки, не вынимая из контейнера, по-

мещают в кювету с рабочим раствором краски

на строго определенное время, подобранное для

каждой партии красителя (от 20 до 45 мин). При

отсутствии кюветы с контейнером стекла поме-

щают горизонтально на «рельсы» (мазком квер-

ху) и наливают высокий слой (3—4 мл на мазок)

рабочего раствора краски. Вынимают контейнер

со стеклами из кюветы с красителем и поме-

щают его в кювету с водопроводной водой (при

отсутствии кюветы краску со стекол смывают,

не снимая их с «рельсов», водопроводной водой).

Высушивают мазки на воздухе.

О к р а с к а  п о  П а п п е н г е й м у . Сухие

нефиксированные мазки помещают в кювету

с раствором Мая—Грюнвальда на 3—5 мин (или

наливают на.мазок, помещенный на «рельсы»

высоким слоем). Контейнер с мазками ополас-

кивают в кювете с дистиллированной водой (или

на мазок, помещенный на «рельсы», не сливая

краситель, добавляют дистиллированную воду

на 1 мин). Помещают контейнер с мазками в

кювету с азур-эозиновой краской по Нохту (или

наливают на мазок краску) на 8—15 мин. Смы-

вают краску водопроводной водой. Мазки высу-

шивают на воздухе.

О к р а с к а  п о  Р о м а н о в с к о м у —

Г и м з е производится так же, как и по Нохту;

в качестве красителя используют готовый раст-

вор Романовского—Гимзы, который перед упот-

реблением разводят из расчета 1 капля краски

на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски

устанавливают опытным путем для каждой но-

вой партии красителя (25—40 мин).

А в т о м а т и ч е с к а я  о к р а с к а  м а з -

к о в может . быть осуществлена с помощью

специальных устройств: «Hematek» фирмы

«Ames» (США), WL-600 фирмы «Veb Kombinat

Medirin und Labortechnik» (ГДР) и др., в кото-

рые ручным способом загружают нефиксирован-

ные мазки. Последующее автоматическое дози-

рование красителей и буферных растворов обес-

печивает стандартную и равномерную окраску

мазков.

Исследование морфологии эритроцитов.

П р и н ц и п . Исследование окрашенных мазков

крови с помощью иммерсионной системы микро-

скопа.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Микроскоп.

Р е а к т и в ы . 1. Иммерсионное масло.

2. Диэтиловый эфир.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Предметное стек-

ло с окрашенным, высохшим на воздухе мазком

крови помещают на столик микроскопа и с по-

мощью малого увеличения (окуляр 7Х, объек-

тив 8Х) находят край мазка. Не меняя положе-

ния стекла, наносят каплю иммерсионного масла

на край мазка на место, расположенное под

объективом. Переводят иммерсионный объектив

в положение, вертикальное к мазку, при этом

объектив погружается в каплю масла.

Осторожно слегка вращают макровинт до

появления изображения в поле зрения микро-

скопа. Затем с помощью микровинта устанавли-

вают четкую видимость препарата (критерием

правильно подобранного для каждого глаза фо-

кусного расстояния будет ясное изображение

клеток с четкими границами и внутриклеточной

структурой). После установки микроскопа при-

ступают к исследованию морфологии эритроци-

тов, обращая внимание на форму, размеры кле-

ток, интенсивность их окраски, наличие внутри-

клеточных включений и пр. Поскольку клетки

имеют определенный объем, для лучшего их

рассмотрения надо постоянно менять фокусное

расстояние с помощью микровинта.

Для получения полного представления о мор-

фологии эритроцитов необходимо просмотреть

несколько полей зрения, передвигая мазок либо

112

Т а б л и ц а 24. Характеристика эритроцитов при некоторых формах анемий

Формы анемий

Железодефицит-

ные

В is- и фолиеводе-

фицитные

Ги попла стические

i

Гемолитические:

наследственный

ми кросфе роцитоз

талассемия

Цветовой

показатель

Гипохромия

Гиперхро-

мня

Нормохро-

мия

>

Гипохромня

Эритроциты

форма

Пойкилоци-

ты

>

>

Сфероциты

Мишене-

вндные

диаметр

Микроциты

Макроцнты,

мегалоциты

Макроциты

Микроциты

»

объем

Нормаль-

ный или

снижен

Резко по-

вышен

Нормаль-

ный или по-

вышен

Повышен

Снижен

Ретику ло-

циты

Нормаль-

ные или

снижены

Снижены

Резко сни-

жены

Резко повы-

шены

Повышены

Ядерные

.формы

Отсутствуют

Часто мега-

лобласты,

нормоблас-

ты

Часто нор-

мобласты

То же

Единичные

нормоблас-

ты

рукой, либо с помощью крестообразного устрой-

ства. Рассматривать морфологию эритроцитов

надо только в тонких местах мазка, где эритро-

циты расположены одиночно, не образуют «мо-

нетных столбиков>.

По окончании микроскопии с .помощью мак-

ровиита поднимают тубус микроскопа, снимают

стекло с предметного стекла, стирают масло

с иммерсионного объектива н предметного стек-

ла марлей, смоченной эфиром,

У здоровых людей эритроциты имеют при-

мерно одинаковый размер. Для более точного

представления о размере клеток проводят эрнт-

роцитометрию— измерение диаметра эритроци-

тов (см. 3.3.3). Эритроцит имеет форму двояко-

вогнутого диска. В окрашенных препаратах

эритроциты круглой формы, розового цвета. Ок-

сифилия клетки обусловлена присутствием гемо-

глобина, поэтому по интенсивности окраски

можно судить о степени насыщенности эритро-

цитов гемоглобином. Эритроциты здоровых лю-

дей имеют равномерную окраску и небольшое

просветление в центре (нормохромня).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Измене-

ния морфологии эритроцитов в виде появления

эритроцитов разного размера (анизоцитоз),

разной формы (пойкилоцитоз), разной окраски

(анизохромия) являются важными морфологи-

ческими симптомами различных форм анемии.

Наиболее часто наблюдается бледная окрас-

ка эритроцитов с более широкой неокрашенной

центральной частью — гипохромия эритроцитов,

которая обусловлена низким насыщением эрит-

роцита гемоглобином и характерна для распро-

страненных форм малокровия, связанных с де-

фицитом железа (постгеморрагические анемии,

анемии беременных, при опухолях, сепсисе и

других тяжелых инфекционных заболеваниях,

заболеваниях желудочно-кишечного тракта и

пр.). При этом гипохромия, как правило, соче-

тается с уменьшением размера эритроцитов —

микроцитозом (табл. 24). Гипохромия эритро-

цитов сопутствует и более редким формам мало-

кровия, не связанным с дефицитом железа;

свинцовому отравлению, талассемии и другим

наследственным повреждениям эритроцитов.

Следует иметь в виду, что гипохромия эритро-

цитов может наблюдаться не только при сни-

жении концентрации гемоглобина и числа эри-

троцитов в крови, но и при нормальных коли-

чественных показателях. Реже встречается уси-

ленная окраска эритроцитов — гиперхролмия,

связанная с повышенным насыщением эритро-

цитов гемоглобином и сочетающаяся с увели-

ченным их размером — макроцитозом, мегало-

цитозом. Эти изменения эритроцитов характер-

ны для дефицита таких факторов кроветворения,

как витамин Ви, фолиевая кислота, и наблю-

даются при анемии Аддисона — Бирмера, дифил-

лоботриозе, органических заболеваниях желуд-

ка, кишечника, алкоголизме, беременности и др.

Изменение окраски в виде полихроматофилии

(эритроциты сероватого цвета) обусловлено

окраской кислыми и основными красителями.

В норме встречаются единичные полихромато-

фильные эритроциты. Их число повышается при

усиленном эритропоэзе (постгеморрагнческие

анемии, гемолитические анемии и др.).

При талассемни и других формах малокро-

вия встречаются так называемые мишеневидные

эритроциты — с окрашенным участком в центре

клетки на фоне неокрашенной зоны.

Появление базофильной пунктации в эритро-

цитах связано с патологическим кроветворением

и характерно для свинцового отравления, но

встречается при других формах анемии. Эритро-

циты с ядром — нормобласты, эритробласты —

встречаются в мазках крови при различных

анемиях. Большое количество нормобластов ха-

рактерно для гемолитических анемий, метаста-

зов опухоли в костный мозг. Гигантские ядерные

эритроциты — мегалобласты — свидетельствуют

113

о патологическом кроветворении, связанном с

дефицитом витамина В12, фолиевой кислоты.

При этих же.состояниях наблюдаются и эритро-

циты с остатками ядер — кольца Кебота, тельца

Жолли. Последние формы постоянно обнаружи-

вают в мазках крови У| больных после удаления -

селезенки.

Шаровидная форма эритроцитов, отличаю-

щаяся уменьшенным диаметром и интенсивной,

без просветлений окраской, — микросфероци-

тоз — является патогномоиичным морфологиче-

ским признаком гемолитической анемии — на-

следственного микросфероцитоза (см. табл. 24).

В небольшом количестве микросфероциты могут

встречаться и при других гемолитических ане-

миях.

Большое диагностическое значение имеет об-

наружение в мазках крови эритроцитов серпо-

видной формы. Этот симптом характерен для

серповидноклеточной анемии, относящейся к

группе наследственных гемоглобинопатии (S-гe-

моглобиноз).

В сомнительных случаях, когда число серпо-

видных эритроцитов в мазках невелико, сле-

дует проводить пробы на серповидность эритро-

цитов, основанные на использовании веществ

(метабисульфит натрия, янусовый зеленый, ме-

тиленовый синий), понижающих содержание

кислорода в препаратах.

На стекле смешивают каплю крови и каплю

одного из указанных веществ, накрывают по-

кровным стеклом. Просматривают под микро-

скопом через 10—15 мин, затем 24—48 ч. В по-

ложительных случаях в препаратах количество

эритроцитов серповидной формы увеличивается.

Л и т е р а т у р а . Циркина А. С.— В кн.;

Справочник по клиническим лабораторным ме-

тодам исследования/Под ред. Е. А. Кост. 2-е

изд.— М.: Медицина, 1975, с. 17.

3.3.3. Эритроцитометрия

(измерение- диаметра эритроцитов)

Унифицированный микроскопический метод с

помощью окуляр-микрометра (1972).  П р и н -

ц и п . Измерение диаметра эритроцитов в окра-

шенном мазке крови с помощью окуляр-микро-

метра.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Микроскоп. 2. Окуляр-микрометр — окуляр, на-

саживаемый на тубус микроскопа, с круглой

стеклянной пластинкой и нанесенной на ней

шкалой, разделенной на 50 делений. 3. Объект-

микрометр — предметное стекло со шкалой дли-

ной 2 мм, разделенной на 200 делений (каждое

деление 10 мкм).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Перед началом ра-

боты определяют цену одного деления шкалы

окуляр-микрометра,, которая зависит от длины

тубуса микроскопа и увеличения объектива. Оп-

ределение проводят с помощью объект-микро-

метра, который устанавливают на столик микро-

скопа таким образом, чтобы шкалы окуляр-ми-

крометра и объект-микрометра сбвпалн. Затем

отсчитывают число делений шкалы окуляр-мик-

рометра, совпадающих с тем или иным коли-

чеством делений шкалы объект-микрометра, 'и

определяют цену одного деления. Например:

40 делений шкалы окуляр-микрометра совпали

с б делениями объект-микрометра, т. е. соот-

60

ветствуют 60 мкм; одно деление -г^.= 1,5 мкм.
Это определение проводят один раз для опреде-

ленного микроскопа, с помощью которого в

дальнейшем производят эритроцитометрию.

На сухой окрашенный мазок наносят каплю

иммерсионного масла, погружают в нее иммер-

сионный объектив и микроскопируют с макси-

мально освещенным полем зрения.

В тонком месте мазка (где эритроциты рас-

положены изолированно) измеряют, диаметр не

менее 100 эритроцитов, отмечая, какое коли-

чество делений шкалы окуляр-микрометра укла-

дывается в эритроцит. Отмечают результат из-

мерения каждого эритроцита (удобно пользо-

ваться 11-клавишным счетчиком, условно ис-

пользуя разные клавиши для определенного

числа делений шкалы).

Зная цену одного деления и количество эрит-

роцитов с одинаковым числом делений, выража-

ют результат в процентах.

П р и м е р : эритроциты с диаметром 4,5 мкм —

5

 %, 6 мкм — 10 %, 7,5 мкм — 70 %, 9 мкм -

11 %, 10,5 мкм — 4 %. Результат можно пред-

ставить и в виде эритроцитометрической кривой

(кривая Прайс-Джонса), при этом на оси абс-

цисс откладывают диаметр в микронах, а на оси

ординат — процент эритроцитов. При необходи-

мости результат выражают в виде среднего

диаметра эритроцитов (см. 3.3.5).

Определение с помощью счетного аппарата.

В счетном аппарате «Целлоскоп» и др. можно

подсчитать число частиц определенного размера

в 1 мкл жидкости.

П р и н ц и п . Подсчет эритроцитов разного

диаметра в 1 мкл крови с помощью дискримина-

тора и при необходимости построение эритро-

цитометрической кривой.

Х о д  о п р е д е л е н и я соответствует ин-

струкции, приложенной к прибору.

При сопоставлении эритроцитометрических

кривых, построенных после подсчета в аппарате

и с помощью окуляр-микрометра у здоровых

людей, обнаружено их совпадение. При патоло-

гии, особенно при различных анемиях, циррозах

печени, гемолитических кризах, выявлены раз-

личия в форме и высоте кривых. Это может быть

связано прежде всего с тем, что эритроцито-

метрическая кривая после использования оку-

ляр-микрометра выведена на 100 эритроцитов,

а в счетном аппарате — на абсолютные вели-

чины эритроцитов в 1 мкл крови; кроме того, не

исключено, что при патологии в морфологически

измененных эритроцитах изменяются свойства

электропроводности, на принципе которой осно-

вано исследование эритроцитов во многих счет-

ных приборах.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоро-

вых нормоциты (эритроциты диаметром 7,5 мкм)

составляют 68 ±0,4%, микроциты (диаметр

6,9 мкм и меньше) — 15,3±0,42 % и макроциты

(диаметр 8 мкм и больше) — 16,9±0,47 %.

114