Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 27

эритроцитов и лейкоцитов в настоящее время за-

менены пробирочным методом, так как он точнее,

проще и удобнее при мытье посуды.

В целях более точного разведения крови

(в 200 раз) пипетку после выдувания крови

несколько раз промывают раствором, находя-

щимся в пробирке.

7. Для подсчета лейкоцитов кровь берут пи-

петкой до метки (0,02 мл) и выдувают ее в про-

бирку с раствором 4, промывают несколько раз

в растворе уксусной кислоты (разведение крови

в 20 раз). Для взятия крови у одного пациента

можно пользоваться одной пипеткой вмести-

мостью 0,02 мл, но обязательно набирать кровь

для лейкоцитов в последнюю очередь (так как

уксусная кислота гемолизирует эритроциты).

8. Для исследования лейкоцитарной фор-

мулы, морфологии эритроцитов, лейкоцитов,

тромбоцитов готовят мазки крови: вытирают

место укола сухим шариком ваты и наносят

каплю крови на сухое обезжиренное предметное

стекло, затем быстро готовят тонкие мазки с по-

мощью шлифованного стекла, краем которого

быстрым движением продвигают по предмет-

ному стеклу каплю крови (см. 3.3.2).

Для профилактики сывороточного гепатита

запрещается брать кровь одной микропипеткой

у нескольких лиц. При недостаточном количе-

стве микропипеток рекомендуется применять ча-

совые стекла или лунки, при атом у каждого

пациента кровь берут стерильным индивидуаль-

ным капилляром от аппарата П'анченкова, поме-

щают в часовое стекло или лунку, из которых

быстро набирают кровь для соответствующего

разведения, необходимого для того или иного

исследования.

В настоящее время в связи с появлением ге-

матологических автоматов стали шире исполь-

зовать для общего клинического анализа веноз-

ную кровь. Кровь из вены берут либо в специ-

альные пластиковые пробирки одноразового

пользования с порошком ЭДТА, либо в стеклян-

ные пробирки с другим антикоагулянтом. Необ-

ходимо тотчас после взятия крови закрыть про-

бирку пробкой и несколько раз тщательно пере-

мешать кровь, не взбалтывая ее (опрокидывая

пробирку сначала пробкой вниз, затем пробкой

вверх). Тщательное перемешивание крови по-

зволяет избежать образования сгустков, нали-

чие которых искажает результаты исследования.

Л и т е р а т у р а . Бейер Б. А. Краткое пособие

по гематологии. 2-е изд.— Л., 1967, с. 219; При-

каз Министерства здравоохранения СССР

№ 300 от 08.04.77 г.

3.2. ГЕМОГЛОБИН

Гемоглобин — основной дыхательный пиг-

мент эритроцитов, относящийся к хромопротеи-

дам и обеспечивающий ткани кислородом; со-

стоит из белка — глобина и тема — соединения

протопорфирина IX с железом. Последний при-

дает гемоглобину характерную окраску. Присое-

динение к тему различных химических групп со-

провождается изменением окраски, на этом ос-

новано и определение концентрации гемогло-

бина в крови.

3.2.1. Содержание гемоглобина

Исследование содержания гемоглобина в

крови (гемоглобинометрия) включает определе-

ние гемоглобина и его дериватов, которые при-

сутствуют в крови здоровых людей или появ-

ляются при различных патологических состоя-

ниях. У здоровых в крови гемоглобин находится

главным образом в виде оксигемоглобина, вос-

становленного гемоглобина и в небольшом ко-

личестве — метгемоглобина, карбоксигемогло-

бина и вердоглобина.

Для определения содержания гемоглобина в

крови предложено много различных методов.

Наибольшее распространение получили колори-

метрические, основанные на колориметрии про-

изводных гемоглобина. Наиболее простым и ши-

роко распространенным в прошлом методом

была колориметрия солянокислого гематина, на

котором основан метод Сали. Метод чрезвы-

чайно прост и быстро выполним, но недоста-

точно точен.

Поданным М. С. Кушаковского (1968), при

суммировании различных погрешностей этого

метода ошибка при определении гемоглобина

составляет ±30 %. Поэтому в настоящее время

метод не может быть рекомендован.

В качестве унифицированного метода в на-

шей стране принят гемнглобинцианидный метод

с применением ацетонциангидрина.

Унифицированный гемиглобинцианидный ме-

тод (1974).  П р и н ц и п . Гемоглобин окисляют

в метгемоглобин (гемиглобин) железосинероди-

етым калием (красная кровяная соль); образую-

щийся с ацетонциангндрином окрашенный циан-

метгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют

колориметрически.

Р е а к т и в ы . 1. Трансформирующий раст-

вор: ацетонциангидрин — 0,5 мг; калий железо-

синеродистый — 0,2 г; натрия гидрокарбонат —

I г; дистиллированная вода — до 1 л. Раствор

желтого цвета, прозрачный. При обесцвечива-

нии или появлении осадка непригоден. Стабилен

в течение нескольких месяцев при хранении в

посуде из темного стекла при комнатной темпе-

ратуре. 2. Калибровочный раствор гемиглобин-

цианида. Можно использовать стандартный

раствор фирмы «Имуна> (ЧССР) с концентра-

цией гемиглобинцианида 61,23 мг/100 мл и

фирмы сРеанал» (ВНР) с концентрацией веще-

ства 59,75 мг/100 мл. Это соответствует концент-

рации гемоглобина в крови 15,4 г/100 мл и

15 г/100 мл при разведении ее в 251 раз. Стан-

дартные растворы хранят в холодильнике (в не-

замороженном виде) в защищенном от света

месте.

107

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Фо-

тоэлектроколориметр (ФЭК-56М или другой).

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку к 5 мл

трансформирующего раствора добавляют

0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Содержи-

мое пробирки тщательно перемешивают и

оставляют стоять на 10 мин. Измеряют на фото-

электроколориметре при длине волны 500—

560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с тол-

щиной слоя 1 см против холостой пробы (транс-

формирующий раствор). Измеряют при тех же

условиях стандартный раствор.

Расчет содержания гемоглобина производят

по калибровочному графику (см. ниже), по-

строенному по стандартному раствору гемигло-

бинцианида, или по формуле:

стннкция стандартного раствора; С — концент-

рация гемнглобинцианнда в стандартном раст-

воре, мг%; К — коэффициент разведения крови;

0,001 — коэффициент для пересчета мг/100 мл

в г/100 мл.

характерно для острой кровопотери, гипопла-

стической анемии, гемолитической анемии в ста-

дни гемолитического криза, рецидива В|2-дефи-

цитной анемии (5—8 г/100 мл, или 50—80 г/л).

Следует, однако, иметь в виду, что диагностика

анемии ни в коей мере не может быть проведена

лишь на основании определения концентрации

гемоглобина в крови. Это исследование устанав-

ливает только факт наличия малокровия. Для

уточнения его характера необходимо исследо-

вание количества эритроцитов, цветового пока-

зателя, других расчетных индексов эритроцитов,

морфологии эритроцитов.

Повышение концентрации гемоглобина в

крови может наблюдаться при миелопролифера-

тивных заболеваниях и симптоматических эрит-

роцитозах, сопутствующих различным состоя-

ниям. Среди миелопролиферативных заболева-

ний наиболее характерно повышение гемогло-

бина при эритремин, концентрация которого

может быть в пределах 18—21 г/100 мл (180—

210 г/л). Для диагностики эритремии важно

исследование и количества эритроцитов, лейко-

цитов, тромбоцитов в крови, которые, как пра-

вило, при этом заболевании повышаются.

Симптоматические реактивные эритроцитозы

могут быть абсолютными (обсусловлены проли-

ферацией элементов эритропоэза) и относитель-

ными (гемокониентрацнонные). Физиологиче-

ское увеличение содержания гемоглобина свой-

ственно новорожденным.

Л и т е р а т у р а . Кушаковский М. С. Кли-

нические формы повреждения гемоглобина.—

Л., 1968, с. 22; Грибова И, А. Гематологическая

норма.— В кн.: Руководство по гематологии

/Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Лорие. М.:

Медицина, 1979, с. 52.

Измеряют против «холостой» пробы.

Определение содержания гемоглобина с по-

мощью счетчика к гематологического автомата.

П р и н ц и п см. «Унифицированный гемигло-

бинцианидный метод».

О б о р у д о в а н и е . Счетчик или гематоло-

гический автомат.

Х о д - и с с л е д о в а н и я соответствует ин-

струкции, приложенной к прибору.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоро-

вых людей концентрация гемоглобина в крови

составляет 13,2—16,4 г/100 мл (132—164 г/л

в международной системе единиц — СИ) у муж-

чин и 11,5—14,5 г/100 мл (115—145 г/л) у жен-

щин [Грибова И. А., 1979].

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Снижение

концентрации гемоглобина в крови является

основным лабораторным симптомом анемии.

При этом содержание гемоглобина варьирует

в широких пределах в зависимости от формы

анемии и ее степени. Так, при наиболее частной

форме малокровия — железодефицитной ане-

мии — у большинства больных отмечается от-

носительно умеренное снижение гемоглобина

(8,5—11,4 г/100 мл, или 85—114 г/л), а более

выраженное уменьшение (6—8,4 г/100 мл, или

60—84 г/л) наблюдается реже. Значительное

снижение концентрации гемоглобина в крови

3.2,2. Фракции гемоглобина

У здорового человека имеется три основных

типа гемоглобина: примитивный — Р, феталь-

ный — F и взрослый А, каждый из которых де-

лится на подтипы. Гемоглобин Р, характерный

для ранней эмбриональной стадии, состоит из

подтипов Говер I я Говер П. В составе гемогло-

бина Р, кроме основной, выделены еще две фор-

мы: 1) Фессаса и Папаспиру и 2) Александра:

Гемоглобин А имеет несколько фракций: A

I

,

А

2

, А

З

. У здорового взрослого человека фрак-

ция A

1

 является основной, составляя %—98 %;

фракция А

2

 не превышает 3 %,А

3

 — в виде сле-

дов, гемоглобин F не более 2 %. Фракция A

I

 де-

лится на несколько подфракций: A

I а

, А

1б

, А

1с

,

А

1d

. У плода до 3-месячного возраста преобла-

дает тип Р, который затем заменяется гемогло-

бином F, а у новорожденного последний состав-

ляет всего 20 %, остальной представлен типом А.

В дальнейшем гемоглобин F продолжает умень-

шаться и к 4—5 мес достигает величин взрослого

человека (1—2%).

Гемоглобин F отличается от А значительной

устойчивостью к действиям щелочи. Химическое

различие состоит в структуре полипептидных

цепей глобина: в гемоглобине А имеются 2а-

108

и 2в-цепи (а

2

, в

2

), в гемоглобине F в-цепи заме-

нены у-цепями (а

2

, у

2

).

Метод Зингера [Singer et al., 1951].

П р и н ц и п . Определение основано на щелоче-

устойчивости гемоглобина F; с помощью щелочи

проводят денатурацию гемоглобина A, a F опре-

деляют спектроскопически.

Р е а к т и в ы . 1. Раствор едкого натра 1/12 н.

(рН 12,7); хранят в парафинированном сосуде

в холодильнике. 2. Раствор сульфата аммония;

к 350 г аммония (NН

4

)

2

SO

4

 добавляют 500 мл

дистиллированной воды, дают постоять и сме-

шивают 400 мл этого раствора с равным объе-

мом дистиллированной воды. Затем к 800 мл

полунасыщенного раствора добавляют 2 мл 10н.

НС1. 3. 5 % раствор цитрата натрия.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Спектрофотометр.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Приготовление ге-

моглобинового раствора — гемолизата: 0,2—1 мл

исследуемой крови помещают в пробирку с 3 мл

5 % раствора цитрата натрия, перемешивают и

центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Верхний слой отсасывают и повторно 2—3 раза

отмывают эритроциты с центрифугированием до

полного обесцвечивания надосадочного слоя.

Затем добавляют к осадку равный объем дистил-

лированной воды, хорошо перемешивают, Цент-

рифугируют 15—20 мин при 6000 об/мин. Отоб-

ранный верхний слой исследуют. Гемолизат

можно хранить в холодильнике несколько недель.

В 1 мл дистиллированной воды разводят

0,2 мл гемолизата с приблизительной концент-

рацией 10 г% (100 г/л). Определяют общее со-

держание гемоглобина (A + F) на спектрофото-

метре при длине волны 541 нм в кювете с толщи-

ной слоя 1 см.

Для изоляции гемоглобина F в пробирку с

3,2 мл 1/12 н. раствора едкого натра, предвари-

тельно помещенную в водяную баню на 10 мин

при 20 °С, быстро вливают 0,2 мл гемолизата,

сильно взбалтывают в водяной бане в течение

10 с, затем включают секундомер. Через 1 мин

добавляют 6,8 мл раствора сульфата аммония.

Смесь хорошо Перемешивают, переворачивая

пробирку до 6 раз, и затем фильтруют через

двойной слой обеззоленных фильтров. На фильт-

ре остается гемоглобин А, а фильтрат содержит

гемоглобин F, который определяют спектроско-

пически в тех же условиях, что и раствор общего

гемоглобина.

Проводят также и «холостой» опыт — оп-

ределяют экстинкцию смеси 3,2 мл 1/12 н. едкого

натра, 6,8 мл раствора сульфата аммония н

0,2 мл воды.

Расчет проводят по формуле:

где Е1 — зкстинкция общего раствора гемогло-

бина; Е2 — экстинкция раствора гемоглобина F;

Ез — экстинкция «холостой» пробы.

Менее точное представление о содержании

гемоглобина F дает цитохимическое исследова-

ние (метод Бетке) (см. 3.3.9).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние гемоглобина F является важным критерием

для диагностики Р-талассемии, при которой одно-

временно повышается и содержание гемоглоби-

на A2. Особенно высокие цифры гемоглобина F

могут быть при гомозиготной в-талассемии до

20—90 %. При гетерозиготной в-талассемии со-

держание гемоглобина F может быть нормаль-

ным или умеренно повышенным (2,5—7 %).

Однако надо иметь в виду, что повышение

гемоглобина F не является специфичным для

Р-талассемии. Оно встречается при различных

формах малокровия: других гемолитических

анемиях, железодефицитной анемии, гипопла-

стической анемии, лейкозах и других состояниях,

сопровождающихся гипоксией. Возможно, что

повышение гемоглобина F при этих заболева-

ниях развивается компенсаторно.

Гемоглобин А2 отличается от гемоглобина А

более медленной миграцией при электрофорезе,

на этом основаны методы его определения. Хи-

мическая структура полипептидных цепей гло-

бина у гемоглобина А2 характеризуется нали-

чием двух цепей а и двух цепей б (а

2

, б

2

). Иссле-

дование гемоглобина А

2

 наиболее информативно

при использовании электрофореза на ацетатцел-

люлозе (см. исследование белков).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние содержания гемоглобина А

2

 характерно для

р-талассемии; при гетерозиготной форме болез-

ни содержание As составляет 4,2—8,9 %.

Л и т е р а т у р а . Kunkel Н. С., Wal-

lenius G — Sciense, 1955, vol. 122, p. 288; Sin-

ger K., ChernoffA., Singer L.— Blood, 1951, vol.

6, p. 413; Vella F.— Nature, 1959, vol. 184, p. 272.

3.2.3. Патологические формы

гемоглобина

К настоящему времени известно, более 200

форм патологических гемоглобинов, отличаю-

щихся от нормальных структурой полипептид-

ной цепи глобина, когда одна или несколько

аминокислот заменены другими или отсутст-

вуют,

Наиболее частой наследственной патологией

является гемоглобинопатия S (серповиднокле-

точная анемия), которая может быть подтвер-

ждена пробами на серповидность эритроцитов

(см. 3.3.2). Исследование патологических гемо-

глобинов является трудоемким и проводится в

специализированных лабораториях.

109

3.3. ЭРИТРОЦИТЫ

Эритроциты — наиболее многочисленные

форменные элементы крови, основное содержи-

мое которых составляет гемоглобин. Мембрана

клеток имеет двойной слой липидных и белко-

вых компонентов и содержит большой набор

ферментов. Зрелые эритроциты человека и мле-

копитающих двояковогнутой формы, не имеют

ядра. Эритроциты обладают антигенными свой-

ствами, участвуют в гемостазе, но основная роль

их — снабжение тканей кислородом и участие

в транспорте углекислоты.

3.3.1. Подсчет количества

В качестве унифицированных методов под-

счета эритроцитов в крови приняты два метода;

подсчет в счетной камере и в автоматическом

счетчике.

Унифицированный метод подсчета в счетной

камере (1972).  П р и н ц и п . Подсчет эритроци-

тов под микроскопом в определенном количе-

стве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл

крови, исходя из объема квадратов и разведе-

ния крови.

Р е а к т и в ы. 0,9 % раствор хлорида натрия

или раствор Гайема: ртуть хлористая 0,5 г, на-

трия сульфат 5 г, натрия хлорид 1 г, вода ди-

стиллированная до 200 мл.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

1. Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Разводят иссле-

дуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую про-

бирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипет-

кой набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вы-

тирают фильтровальной бумагой или марлей и

кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тща-

тельно промывают в верхнем слое жидкости,

повторно набирая ее и выдувая в пробирку,

содержимое пробирки перемешивают и остав-

ляют стоять до момента счета (рекомендуется

считать эритроциты в ближайшие 2—3 ч после

взятия крови, а при гемолитических и В12-дефи-

цитных анемиях — сразу после взятия, так как

эритроциты могут разрушиться). Недопустимо

оставлять взятую кровь с несосчитанными эри-

троцитами на следующий день, так как эритро-

циты частично разрушаются.

Подготавливают счетную камеру: протирают

насухо камеру с сеткой и покровное стекло, за-

тем покровное стекло притирают к камере, слегка

надавливая на стекло таким образом, чтобы по

краям его появились радужные полосы (это сви-

детельствует о требуемой высоте камеры —

0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной

кровью: предварительно несколько раз тщатель-

но встряхивают содержимое пробирки, затем

пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой

отбирают каплю разведенной крови и подносят

ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы

она равномерно без пузырьков воздуха запол-

нила всю поверхность камеры с сеткой, не зате-

кая в бороздки. Заполненную камеру оставляют

в горизонтальном положении 1 мин (для оседа-

ния эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов, не меняя гори-

зонтального положения камеры, помещают ее

на столик микроскопа и с помощью малого уве-

личения микроскопа (объектив 8Х, окуляр

10Х) находят верхний левый край сетки (для

лучшего контрастирования следует опустить

конденсор и прикрыть диафрагму). Счет произ-

водят в 5 больших квадратах, разделенных на 16

малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекоменду-

ется считать клетки в квадратах сетки, располо-

женных по диагонали. Для того чтобы одни и те

же эритроциты, лежащие на линиях, не попали

дважды в счет, принято для каждого квадрата,

кроме элементов, лежащих внутри квадрата,

считать расположенные на определенных двух

линиях (например, на левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови

производят, исходя из разведения крови (200),

числа сосчитанных квадратов (80) и объема

I малого квадрата ( мюп , последующей

формуле:

где X — число эритроцитов в 1 мкл крови; а —

число сосчитанных эритроцитов.

В результате сокращения Х = а-10 000.

Подсчет эритроцитов в счетной камере явля-

ется трудоемким и недостаточно точным мето-

дом. На результатах подсчета сказываются ма-

лейшая неточность при взятии крови в пипетку,

неудовлетворительная градуировка пипеток, не-

равномерное заполнение камеры, любое отклоне-

ние от правил подготовки счетной камеры, ее

заполнения и подсчета клеток.

Унифицированный метод автоматического

подсчета эритроцитов (1972) с помощью счет-

чика форменных элементов облегчает выполне-

ние этого исследования и делает его более произ-

водительным. Отечественный гематологический

комплекс КГ-2, а также многочисленные зару-

бежные образцы—«Пикоскел» (ВНР), «Tur»

(ГДР), «Celloscope» (Швеция), "Cell-Counter»

(ФРГ), СС-1006 (Япония) и др.— предусматри-

вают в своей программе подсчет количества

эритроцитов в крови.

Помимо счетчиков форменных элементов,

подсчет эритроцитов включен в программу всех

существующих гематологических автоматов:

«SMA-7a», "Гемалог-8» фирмы «Technicon»

(США), «Coulter Counter S» фирмы «Coult-

ronics France SA» (Франция) и др.

При использовании счетчиков разведение

крови (подготовка пробы для подсчета) осуществ-

ляется вручную. При использовании гематологи-

ческих автоматов отбор пробы крови и ее разве-

дение происходят автоматически.

П р и н ц и п работы большинства счетчиков

основан на кондуктометрическом методе. Опреде-

110