Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 22

окраска), уровень III — 6 (лимонно-желтый

цвет), уровень IV — 6,8 (стойкий розовый),

среднее арифметическое между III и IV уро-

внем — 6,4.

Для титрования было взято 5 мл желудочно-

го сока; расчет ведется на 100 мл, поэтому

количество щелочи, потраченной на разных эта-

пах титрования, умножают на 20 (если титруют

10 мл сока, то умножают соответственно на 10).

1. Свободная HCI: 5,4 — 4 = 1,4 X 20 =

= 28.

2. Общая кислотность: 6,8 — 4 = 2,8 X

X 20 = 56.

3. Сумма свободной и связанной HCI: 6,4 —

— 4 = 2,4 X 20 = 48.

4. Связанная HCI: 48 — 28 = 20.

5. Кислотный остаток: 56 — 48 = 8.
Унифицированное определение кислотности

методом Тепффера (1974)  . Р е а к т и в ы .  1 . 1 %

спиртовой раствор фенолфталеина. Интервал

перехода окраски при рН 8,2—10,0. 2. 0,5 %

спиртовой раствор 4-диметиламиноазобензола.

Интервал перехода окраски при рН 2,9—4,0.

3. 1 % водный раствор ализаринсульфоновокис-

лого натра. Интервал перехода окраски при

рН 4,3—6,3. 4. 0,1 н. раствор едкого натра.

Х о д  и с с л е д о в а н и я В 2 стакана

отмеривают по 5 мл профильтрованного желу

дочного сока. В первую порцию вносят по 2 кап-

ли диметиламиноазобензола и фенолфталеина

и определяют концентрацию свободной HCI и

общую кислотность. Во вторую порцию желу-

дочного сока прибавляют каплю ализаринсуль-

фоновокислого натра и титруют до перехода

желтой окраски в слабо-фиолетовую. В зоне

перехода этого индикатора нейтрализуются

кислореагирующие вещества, кроме связанной

HCI, которую находят по разности между объ-

емом щелочи, пошедшей на нейтрализацию всех

кислых валентностей желудочного сока (титро-

вание с фенолфталеином), и объемом, пошед-

шим на титрование с ализаринсульфоновокис-

лым натром. Все полученные величины умно-

жают на 20 для пересчета на 100 мл желудочно-

го сока.

Метод определения кислотности в одной

порции желудочного сока с тремя индикаторами.

Р е а к т и в ы . 1. 0,5% спиртовой раствор ди-

метиламиноазобензола. 2. 1 % спиртовой

раствор фенолфталеина. 3. 0,5 г метилового

красного; 0,5 г майгрюнвальда; 100 мл 50 %

спирта. 4, 0,1 н. раствор едкого натра.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . К 5 мл про-

фильтрованного желудочного сока добавляют

по капле реактивов 1 и 2, титруют едким натром

до желто-оранжевой окраски (цвет семги),

затем прибавляют каплю реактива 3, при этом

окраска изменяется на розово-фиолетовую, ти-

труют едким натром до появления зеленого

цвета, а затем до стойкой розовой окраски.

Общую кислотность и свободную HCI рас-

считывают так же, как в описанных выше ме-

тодах, а концентрации связанной НС1 соответ-

ствует количество щелочи, пошедшей на титро-

вание за время изменения зеленой окраски до

стойкой розовой.

Микрохимический способ определения кис-

лотности.  О б о р у д о в а н и е ; микробюретка.

Р е а к т и в ы те же, что и для метода Ми-

хаэлнса.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . В стакан для

титрования помещают 1 мл профильтрованного

сока и 5 мл дистиллированной воды. Титруя

из микробюретки, определяют концентрацию

свободной НС1 и общую кислотность по методу

Михаэлиса.

Р а с ч е т . 1. Содержание свободной HCI

равно количеству щелочи, пошедшей на титро-

вание до желто-оранжевой окраски (цвет семги)

диметиламиноазобензола, умноженному на 100.

2. Общей кислотности соответствует количе-

ство щелочи, пошедшей на все титрование,

уменьшенное на 0,05 (индикаторная поправка)

и умноженное на 100. При низкой кислотности

индикаторная поправка должна быть равна

0,03

 мл.
П р и м е ч а н и е . Метод применяют в тех'

случаях, когда объем полученного желудоч-

ного сока небольшой.
С п о с о б ы  в ы р а ж е н и я  к и с л о т н о -

с т и . Традиционным способом выражения кис-

лотности желудочного сока являются титра-

ционные единицы (ТЕ) —объем 0,1 н. едкого,

натра, необходимый для нейтрализации кислых

валентностей в 100 мл желудочного сока. По-

следние годы концентрацию НС1 в желудочном

соке более принято выражать в миллимолях

на 1 л желудочного секрета. Известно, что

1 мл 0,1 н. раствора едкого натра эквивалентен

1 мл 0,1 н. раствора НС1 (1 ТЕ), или 0,1 ммоль

HCI, отсюда концентрация HCI в 100 мл сока,

выраженная в миллимолях НС1, в 10 раз мень-

ше, чем в титрационных единицах.

П р и м е р . Если концентрация HCI 40 ТЕ,

то это соответствует концентрации 4 ммоль в

100 мл сока, или 40 ммоль в 1 л сока. Таким

образом, числовое значение концентрации HCI,

выраженное в титрационных единицах, совпа-

дает с числовым значением концентрации НС1,

выраженным в миллимолях на 1 л (40 ТЕ =

= 40 ммоль/л НС1).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Общепри-

нятое представление о нормальной концентра-

ции HCi в желудочном соке является весьма

относительным, однако Ю. И. Фншзон-Рысс

в своей монографии приводит наиболее харак-

терные величины концентрации кислоты в зави-

симости от фазы секреторного периода и метода

стимуляции желудочной секреции.

Натощак: общая кислотность — до 40 ТЕ

(40 ммоль/л), свободная HCI — до 20 ТЕ

(20 ммоль/л).

В условиях базальной секреции: общая

кислотность от 40 до 60 ТЕ (40—60 ммоль/л),

свободная НС1 от 20 до 40 ТЕ (20—40 ммоль/л);

при исследовании по методу Н. И. Лепорского

после энтеральной стимуляции капустным отва-

ром концентрация HCI остается такой же, как

и в условиях базальной секреции. При примене-

нии в качестве стимуляции субмаксимальных

доз гистамина концентрация общей HCI от 80

до 100 ТЕ (80—100 ммоль/л), свободной HCI —

87

от 65 до 85 ТЕ (65—85 ммоль/л), а при исполь-

зовании в качестве стимулятора максимальной

дозы гистамина общая кислотность колеблется

от 10.0 до 120 ТЕ (100—120 ммоль/л), а свобод-

ная HCI —от 90 до ПО ТЕ (90—110 ммоль/л).

Определение дебита НС1. Дебит HCI отра-

жает валовое количество выделенной желудком

НС1 за определенный промежуток времени.

Наиболее часто вычисляют за час исследования

в различные фазы желудочной секреции. Разли-

чают дебит: 1) свободной НС1; 2) связанной

НС1; 3) НС1 (кислотная продукция). Последний

показатель определяют, исходя из цифр общей

кислотности. При этом более правильно титро-

вать желудочный сок под контролем рН-метра

до рН 7,0. Дебит-час определяют только при

условии получения всего желудочного содержи-

мого за час.

Величину кислотовыделеиия вычисляют по

двум формулам, которые несколько отличаются

друг от друга в зависимости от выражения

дебита (в миллиграммах или миллиэквивален-

тах, т. е. миллимолях) НС1.

Для расчета дебита НСl в миллиграммах

применяют следующую формулу:

где D — дебит HCI (ммоль), а остальные обо-

значения те же, что и в предыдущей формуле,

так как числовые значения концентрации НС1,

выраженные в титрационных единицах на 100

мл и в миллимолях на I л желудочного сока,

совпадают.

Для облегчения подсчета дебит-часа НС1

можно пользоваться номограммой. Линейкой

соединяют нанесенные на противоположных

ветвях кривой цифры, соответствующие объему

и кислотности данной порции желудочного

сока. В месте пересечения линейки с верти-

кальной линией находят значение дебита, выра-

женное в миллиграммах HCI или в миллимолях

HCI (для HCI числовые значения миллиэкви-

валентов и миллимолей совладают).

В нашей стране принято определять дебит

свободной HCI. За рубежом ориентируются на

дебит, вычисляемый на основании величин

общей кислотности. Часовой дебит HCI базаль-

ной секреции обозначают как ВАО — basal acid

output (базальная кислотная продукция). Ана-

логичный показатель при максимальной гиста-

мнновой стимуляции получил название МАО —

maximal acid output. Есть еще показатель

продукции, получивший название РАО — peak

acid output (пиковая кислотная продукция),

который вычисляют при проведении максималь-

ного гистаминового теста, беря две смежные

порции желудочного сока, полученные за 30 мин

и отличающиеся наибольшей концентрацией

HCI. Показатели 15-минутной продукции скла-

дывают, а полученный результат удваивают

(для пересчета получасового дебита HCI на

часовой).

Вычислять ВАО, МАО и РАО целесообраз-

нее всего на основании данных о концентрации

HCI, полученных при титровании с использо-

ванием рН-метра.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Количество

НС1 натощак не более 2 ммоль, свободной

НС1 не более 1 ммоль. В условиях базальной

секреции дебит-час HCI колеблется от 1,5 до

5,5 ммоль, свободной НС1 — от I до 4 ммоль.

В период стимуляции желудочной секреции по

методу Н. И. Лепорского дебит-час НС1 колеб-

лется от 1,5 до 6 ммоль, свободной HCI —

от I до 4,5 ммоль. При субмаксимальиой стиму-

ляции гистамином дебит-час HCI — от 8 до

14 ммоль, свободной НС1 — от 6,5 до 12 ммоль.

В ответ на максимальную стимуляцию гиста-

мином часовая кислая продукция бывает от

18 до 26 ммоль, а дебит-час свободной HCI —

от 16 до 24 ммоль.

Определение дефицита НС1.  П р и н ц и п .

Определение дефицита HCI основывается на

титровании анацидного желудочного сока 0,1 н.

раствором этой кислоты до появления ее в

свободном виде.

Р е а к т и в ы . 1. 1 % спиртовой раствор

диметиламиноазобензола. 2. 0,1 н. раствор HCI.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . К 5 мл (или

10 мл) желудочного сока добавляют каплю

раствора диметиламиноазобензола и титруют

раствором НС1 до появления розовой окраски.

Полученный результат умножают на 20 или

10 в зависимости от объема титруемого сока.

Количество HCI, затраченное на титрование

100 мл сока, будет соответствовать ее дефициту.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Макси-

мально возможный дефицит НС1 составляет

40 ТЕ. Такой дефицит указывает на полное

прекращение секреции HCI (абсолютная, дей-

ствительная или целлюлярная ахлоргидрия).

Если дефицит выражается меньшей величиной,

то НС1 выделяется, но из-за нейтрализации

не может быть обнаружена (относительная,

мнимая или химическая ахлоргидрия).

Определение молочной кислоты.  П р и н ц и п .

Методы основаны на изменении окраски раст-

вора за счет образования лактата железа.

Проба с карболовой кислотой.  Р е а к т и в ы .

1 . 1 % раствор карболовой кислоты. 2. 10 %

раствор хлорного железа.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . К 2—3 мл раст-

вора карболовой кислоты приливают каплю

хлорного железа; раствор приобретает фиоле-

товое окрашивание. Затем по каплям прили-

вают предварительно профильтрованный желу-

дочный сок, который опускается на дно про-

бирки, где появляется желтоватое окрашивание.

П р и м е ч а н и я . 1. Присутствие свободной

НС1 снижает чувствительность пробы, поэто-

88

где и — дебит HCl (мг); v — объем порции

желудочного сока (мл); Е — концентрация НС1

(в титрационных единицах); 0.0365 — количе-

ство миллиграммов HCI в 1 мл сока при концен-

трации ее, равной 1 ТЕ. Число слагаемых опреде-

ляется числом порций за время исследования.

Для расчета дебита НС1 в миллимолях (для

НС1 эти величины совпадают) применяют дру-

гую формулу:

му при ее наличии следует проводить иссле-

дование с эфирной вытяжкой из желудочного

сока, которую готовят следующим образом:

5—10 мл профильтрованного желудочного

сока тщательно взбалтывают с 3—5 мл эфи-

ра. Эфирный слой отсасывают пипеткой в

химический стаканчик, затем выпаривают

на водяной бане и остаток растворяют

в 2—3 мл воды, с этим раствором проводят

описанную выше пробу. 2. Пробу можно про-

водить без карболовой кислоты, внося только

раствор хлорного железа. В этом случае сла-

бо-желтое окрашивание при наличии молоч-

ной кислоты становится более интенсивным.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Молочная

кислота в желудочном содержимом обычно от-

сутствует, а начинает образовываться в резуль-

тате усиленной жизнедеятельности палочек мо-

лочнокислого брожения при отсутствии или

очень низкой концентрации свободной НС1,

Существует мнение, что она может быть про-

дуктом метаболизма раковых клеток.

Исследование ферментообразующей функ-

ции унифицированным методом Туголукова

(1974).  П р и н ц и п . Определение протеолити-

ческой активности желудочного сока по количе-

ству расщепленного белка.

Р е а к т и в ы .  1 . 2 % раствор сухой плазмы

на 0,1 н. растворе НС1. 2. 10 % раствор трихлор-

уксусной кислоты.

О б о р у д о в а н и е . 1. Центрифужные

пробирки (точно градуированные). 2. Пробирки

химические. 3. Пипетки вместимостью 1; 2 и 10 мл.

4. Микропипетки вместимостью 0,1 мл. 5, Цент-

рифуга. 6. Термостат.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Желудочный сок,

профильтрованный через бумажный фильтр,

разводят в 100 раз (9,9 мл воды н 0,1 мл желу-

дочного сока, отмеренного микропипеткой). В

одну градуированную центрифужную пробирку

помещают 1мл разведенного сока (опыт), в дру-

гую — 1 мл предварительно прокипяченного

разведенного сока (контроль). В обе пробирки

добавляют по 2 мл 2 % раствора сухой плазмы

и ставят их в термостат при 37 °С на 20 ч. По про-

шествии этого времени в каждую пробирку при-

ливают по 2 мл 10 % трихлоруксусной кислоты,

перемешивают стеклянной палочкой до однород-

ной суспензии и центрифугируют 10 мин при

1500 об/мин.

Р а с ч е т . По разнице величин осадка в

контроле и опыте определяют степень перевари-

вания белка с последующим пересчетом на коли-

чество пепсина. Показатель переваривания

субстрата вычисляют по формуле:

Т а б л и ц а 23. Таблица Туголукова для пере-

счета показателей переваривания белкового

субстрата (2 % раствор сухой плазмы) иа содер-

жание пепсина в 0,01 мл желудочного сока или

уропепсина в 1 ил мочи

Показа-

тель пе-

ревари-

вания

1

2

3

4

5

б

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

Содержание

пепсина или

уропепсина

- (мг)

0,005

0,008

0,010

0,015

0,017

0,020

0,025

0,027

0,030

0,035

0,037

0,040

0,045

0,047

0,050

0,055

0,062

0,067

0,075

Показа-

тель пе-

ревари-

вания

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

—

Содержание

пепсина или

уропепсина

(мг)

0,08

0,09

0,10

0,12

0,16

0,20

0,27

0,34

0,42

0,50

0,59

0,68

0,77

0,86

0,96

1,06

1,20

1,50

сока, полученный результат умножают на 10 000

(для выражения концентрации фермента в мил-

лиграмм-процентах) или на 100 (для выражения

концентрации фермента в граммах на  1 л ) .

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы .  П о д а н -

ным В. Н. Туголукова, концентрация пепсина

в желудочном соке натощак составляет 0—

2100 мг % (0—21 г/л), а после стимуляции

энтеральным раздражителем (например, отва-

ром капусты) — 2000—4000 мг % (20—40 г/л).

Фармакопейный препарат пепсина, которым

пользовался В. Н. Туголуков для составления

таблицы, содержит 1 % кристаллического пеп-

сина. Следовательно, истинная концентрация

пепсина натощак 0—21 мг % (0—0,21 г/л), а

после энтеральной стимуляции — 20—40 мг %

(0,2—0,4 г/л). Концентрация пепсина, опреде-

ленная методом Туголукова, при субмаксималь-

ной стимуляции гистамина составляет 50—65 мг %

(0,5—0,65 г/л), а при максимальной — 50—

75  м г % (0,5—0,75 г/л).

Унифицированный метод определения про-

теолнтической активности по Ансоиу и Мирско-

му н модификации М. П. Черникова (1974).

П р и н ц и п . Метод основан на способности пеп-

сина расщеплять белковую молекулу гемоглоби-

на с освобождением тирозина и триптофана, не

осаждаемых трихлоруксусной кислотой.

Р е а к т и в ы . 1. 0,1 М глициновый буфер рН

1,5: глицина 7,505 г и хлорида натрия 6,85 г ра-

створяют в воде, доводя объем до 1 л; к 73 мл

приготовленного раствора добавляют 67 мл 0,1 М

раствора НС1. Тщательно перемешивают, вели-

89

где М — показатель переваривания; А — объем

осадка в контроле; В — объем осадка в опыте;

40 — постоянная величина, установленная

экспериментальным путем.

Пересчет показателя переваривания на со-

держание фермента производят с помощью

табл. 23. В связи с тем что для исследования

берут 0,1 мл разведенного в 100 раз желудочного

чину рН определяют потенциометрически. Хра-

нят в холодильнике. 2. 1 % раствор гемоглобина в

0,1 М глициновом буфере рН 1,5. 3. Калибровоч-

ные растворы пепсина: для стандартного раство-

ра 7,5 мг лиофилизированного кристаллическо-

го пепсина растворяют в 1 л воды. Полученная

концентрация пепсина в растворе равна 7,5 мкг/мл.

Из этого раствора готовят разведения в 2; 4 и

8 раз и получают растворы с содержанием пеп-

сина 3,75; 1,87 и 0,94 мкг/мл. 4. 10 % раствор

трихлоруксусной кислоты. 5. 0,1 н. раствор HCI.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

I. Секундомер. 2. Спектрофотометр.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Опытная проба:

в центрифужную пробирку наливают 1 мл ра-

створа гемоглобина и 1 мл разведенного в 10 или

100 раз желудочного сока. Инкубируют при

37 °С 10 мин (точно по секундомеру). Затем

добавляют 3 мл 10 % раствора трихлоруксусной

кислоты и оставляют при комнатной температуре

на I ч. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин.

Измеряют оптическую плотность надосадочной

жидкости при длине волны 280 им против ди-

стиллированной воды.

Холостую пробу проводят так же, как опыт-

ную, но без добавления трихлоруксусной кис-

лоты.

Р а с ч е т . Концентрацию пепсина в иссле-

дуемом соке определяют по калибровочному

графику; активность пепсина выражают в ми-

крограммах на 1 мл желудочного содержимого.

П о с т р о е н и е  к а л и б р о в о ч н о г о

г р а ф и к а . Пробы с калибровочными раство-

рами пепсина ставят так же, как опытные, беря

вместо желудочного содержимого 1 мл соответ-

ствующего раствора пепсина.

Из экстинкции калибровочных проб вычи-

тают экстинкцию холостой пробы. Строят кали-

бровочную кривую, откладывая на оси ординат

полученную разницу экстинкции, а на оси аб-

сцисс— содержание пепсина (мкг/мл). Для

вычисления активности пепсина в желудочном

содержимом значения, найденные по калибро-

вочному графику, умножают на степень разве-

дения желудочного сока.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Актив-

ность пепсина должна быть выведена на донорах

в каждой лаборатории, так как она зависит от

активности кристаллического пепсина, испол^ь-

зуемого для построения калибровочного гра-

фика.

2,3.3. Беззондовые методы

Беззондовые методы дают ориентировочное

представление о желудочной секреции и при-

меняются при наличии противопоказаний к

фракционному зондированию.

Десмоидная проба Сали.  П р и н ц и п .

Выявление окраски мочи метиленовым синим в

результате попадания его в желудок из десмоид-

ного мешочка при растворении кетгута под дей-

ствием НС1 и пепсина.

Р е а к т и в ы . 1. Метиленовый синий. 2. Тон-

кая резинка. 3. Кетгут № 5.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . В мешочек из

тонкой резины помещают 0,15 г метиленового си-

него, перевязывают кетгутом. Концы нити корот-

ко обрезают. Больной проглатывает мешочек не-

посредственно перед завтраком и собирает мочу

через 3; 5 и 20 ч. Определяют время появления

и интенсивность окраски мочи метиленовым си-

ним в голубой, синий или зеленый цвет.

Н о р м а л ь н ы е  п о к а з а т е л и . Первая

порция мочи не окрашена, вторая окрашена в

бледно-зеленый, третья — в интенсивно-зеленый

или синий цвет.

П р и м е ч а н и я . 1. При отсутствии окрас-

ки мочу необходимо прокипятить, так как

метиленовый синий иногда может выделять-

ся в виде бесцветных соединений, из которых

освобождается при нагревании. 2. Для

облегчения расфасовки метиленового сине-

го можно пользоваться прописью шариков-

пилюль: Methyleni caerulei 0,15 г; Butyri

cacao 0,3 г. Шарики хранят в холодильнике.

3. Вместо метиленового синего в качестве

индикатора можно использовать 0,4 г йоди-

да калия. Последний после переваривания

кетгута появляется в слюне (в норме через

35—45 мин) и может быть обнаружен в

реакции с раствором крахмала.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . При от-

сутствии в желудочном соке пепсина или НС1,

способной активировать этот фермент, кетгут не

переваривается и изменения окраски мочи или

появления йодида калия в слюне не происходит.

Десмоидная проба является простым способом

ориентировочной диагностики ахлоргидрии;

особенно удобна она при массовых обследова-

ниях населения.

В клинической практике при массовых об-

следованиях для определения количества НС1

широкое распространение получили препараты

гастротест («Cilak», Швейцария) и аиидотест

(«Chinoin», Венгрия). В состав гастротеста вхо-

дит красящее вещество 3-фенил-азо-2,6-диами-

иопиридин, а в ацидотесте красящим веществом

является 2,4-диамино-4-этоксиазобензол. О ко-

личестве кислоты судят по окраске мочи. Коло-

риметрию проводят визуально при помощи

цветной шкалы. Подробно правила работы с

препаратами изложены в приложенных к ним

инструкциях.

В качестве беззондового метода можно

использовать определение уропепсииа. Уропеп-

син определяют методом Туголукова; исследова-

ние осуществляют в той же последовательности,

как и при изучении протеолитической активности

желудочного сока, но вместо последнего берут

I мл мочи. Результат выражают в протеолити-

ческой активности часовой или суточной мочи.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы .  З а сутки

38—96 мг, «часовое напряжение» натощак —

2—3 мг/ч.

Л и т е р а т у р а . Фишэон-Рысс Ю. И. Со-

временные методы исследования „желудочной

секреции.— Л., 1972; Anson M. I.— J. Physiol.,

1939, vol. 22, p. 79.

90