Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 14

500 - 590нм (зелений светофильтр) В кювете

с толщиной слоя 1 см на спектрофотометре при

длине волны 562нм. Рабочий калибровочный

раствор измеряют при тех же условиях, что и

опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха

(I ед. соответствует 1 мг уробилнногена). Кон-

центрацню уробилиногена выражают количест-

вояг единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Ед,).

Расчет производят по формуле:

где " Е„ -— экстинКцня опытной пробы; £, — эк-

стинкция холостой пробы; £« •— экстинкция ка-

либровочной пробы; 0,346 — концентрация уро-

билиногена в растворе (0,346 мг/ 100 мл), окрас-

ка которого эквивалентна окраске калибро-

вочного раствора фенолфталеина; 6,0 — объем

пробы (мл); 1,5 — количество мочи в пробе (мл).

Соотношение ингредиентов при определении

уробилиногена в моче представлено в табл. 18.

Т а б л к ц а 18. Соотношение ингредиентов

(в миллилитрах) при определении уробнлн-

ногена в моче

П р и м е ч а н и я . 1. Рекомендуется соби-

рать мочу в посуду из темного стекла, так как

при дневном свете окисление уробилиногена

происходит значительно быстрее.

2. Для расчета выделения уробилиногена за

определенное время для исследования надо

брать мочу из всего собранного за это время

объема и, учитывая его, провести расчеты

по

:

 формуле:

лдеУ-—-объем мочи (в мл)^ выделенный за

определенный промежуток времени; -т~г-

; ч ' 1 \flj

коэффициент для расчета количества уроби-

лнногена в 1 мл мочи.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В моче здо-

рового человека содержатся следы уробилино-

гена, а за сутки выделяется не больше 6 мг, у де-

тей не более 2 мг.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . В свеже-

выпущенной моче-содержится уробилиноген, ко-

торый при стоянии мочи окисляется в уробили-

ны. Все эти вещества являются производными

билирубина и называются уробилнноидами.

Уробилиноиды образуются под действием фер-

ментов бактерий и клеток слизистой оболочки

кишечника из билирубина, выделившегося с

желчью. Уробилнноидурия является одним из

характерных симптомов поражения паренхимы

печени (гепатиты, циррозы), гемолитических со-

стояний и заболеваний кишечника (энтериты,

наклонность к запорам, кишечная непроходи-

мость). Полное отсутствие уробилиноидов гово-

рит о полном нарушении поступления желчи

в кишечник.

Л и т е р а т у р а . Henry R. /., Cannon D. С.,

Winkelman J. W. Clinical chemistry. Principles

and technics.— New York, 1974, p. 1354—1369;

Terwen A. G, L. Dtsch. Arch. Klin, med., 1925,

H. 149, S. 72.

ПОРФОБИЛИНОГЕН. Уннфнцнрованный

метод с пара-днметнламинобензальдегндом

(1979).  П р и н ц и п . Порфобилиноген (ПБГ)

реагирует с пара-диметиламинобензальдегидом

с образованием окрашенного в красный цвет

соединения. Для повышения специфичности ре-

акции добавляют ацетат натрия.. Соединения,

дающие аналогичную реакцию с пара-димешл-

аминобензальдегидом (уробилиноген, производ-

ные индола, скатола и др.), удаляют путем

экстракции хлороформом и бутанолом, в кото-

рых ПБГ нерастворим.

Р е а к т и в ы . 1. 4-(Диметиламино)-бен-

зальдегид (пара-диметнламннобензальдегид).

2. НС! кислота концентрированная х. ч. 3. Реак-

тив Эрлиха: 0,7 г пара-диметиламинобензальде-

гнда растворяют в 150 мл концентрированной

НС1 кислоты, приливают к 100 мл дистиллиро-

ванной воды и смешивают. Раствор должен

быть бесцветным или слегка желтым. Хранят

в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

4. Натрия ацетат х. ч. или ч. д. а., насыщенный

раствор: 375 г CH

3

COONa • ЗН

3

О (или 226 г

CH

3

COONa) растворяют в 250 мл теплой дис-

тиллированной воды, охлаждают до комнатной

температуры. Хранят при температуре 20 °С.

Раствор должен быть бесцветным и прозрач-

ным. 5. Хлороформ. 6. Бутиловый спирт. 7. Бума-

га индикаторная для измерения рН (в интервале

4,0—5,0).

Х о д  о б н а р у ж е н и я и  о ц е н к а ре-

з у л ь т а т о в . Исследуют мочу в первые 2—3 ч

после мочеиспускания. Смешивают в пробирке

2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добав-

ляют 5 мл насыщенного раствора ацетата нат-

рия и перемешивают. Измеряют рН индикатор-

ной бумагой; рН должен быть в интервале 4,0—

5,0. Если рН меньше 4,0, то добавляют раствор

ацетата натрия до установления нужного рН.

Если окраска не развивается, результат считают

отрицательным. При развитии розовой или крас-

ной окраски к пробе добавляют 5 мл хлороформа

55

и встряхивают. Если окраска переходит в слой

хлороформа, а верхний слой остается бесцвет-

ным или слегка желтоватом, то результат сле-

дует считать отрицательным. Если окраска оста-

ется в слое над хлороформом, то 6—8 мл из окра-

шенного слоя переносят в другую пробирку,

добавляют бутиловый спирт в соотношении 1:2

и встряхивают. Если фазы не сразу разделяют-

ся, то смесь центрифугируют при переходе ок-

раски в слой бутилового спирта — результат

отрицательный, если же окраска остается в ис-

следуемом слое, то в исследуемой моче концен-

трация ПБГ превышает нормальную.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Если кон-

центрация ПБГ в моче нормальна (до 2 мг/л),

то проба отрицательная: ПБГ данным методом

обнаруживают при концентрации выше 6 мг/л.

П р и м е ч а н и е . При хранении мочи более

3 ч при, комнатной температуре положитель-

ная реакция может стать отрицательной. Это

можно объяснить превращением порфобили-

ногена в порфирин и образованием ингиби-

торов реакции. Если нет возможности иссле-

довать мочу в первые 2 ч, то хранить ее надо

в холодильнике при 4 °С, доведя рН мочи до

6,0—7,0, так как в этих условиях порфобили-

ноген стабилен длительное время.

Л и т е р а т у р а . Идельсон Л. И. Наруше-

ние порфиринового обмена в клинике.— Л.:

Медицина, 1968; Пименова Л. М, В кн.: Унифи-

кация лабораторных методов исследования.

Вып. VIII.— М., 1978; Henry R. I., Cannon D. С.,

Winkelman ]. Clinical chemistry. Principles and

technics.— New York, 1974, p. 1251—1263; Pie-

rack C. A.,, Cardinal R., Bossenmaier 1., Wat-

son C. J. Clin. Chem., 1977, vol. 23, p. 1666.

2.1.3. Скрининг-тесты для выявления

наследственных или приобретенных

нарушений обмена веществ у детей

Приведенные ниже тесты унифицированы

в 1979 г.

Исследуют утреннюю порцию мочи.

ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКА. Проба с бромфе-

ноловым синим.  П р и н ц и п . Изменение ок-

раски индикатЪра в присутствии белка.

Р е а к т и в ы . 1, 5,5-Диэтилбарбитуровой

кислоты натриевая соль (мединал). 2. Натрия

ацетат (NaOOCCH

3

-3H

2

O). 3. НС1 0,1 моль/л.

4. Варбитал-ацетатный буфер рН 8,6: 8,6 г меди-

нала и 6,48 г ацетата натрия растворяют в 100 мл

воды; добавляют 60 мл НС1 и доводят до 1 л

водой. 5. БромфеноЛовый синий водораствори-

мый. 6. Цийка сульфат (ZnSO, • 7Н

2

О). 7.

Раствор индикатора: 0,5 г бромфенолового

синего и 50 г сульфата цинка растворяют в 1 л

воды. 8. Уксусная кислота: к 1 мл концентриро-

ванной уксусной кислоты добавляют 99 мл воды.

9. Раствор альбумина: 10 г альбумина

растворяют в 1 л изотонического раствора хло-

рида натрия (9 г/л). Рабочие растворы альбу-

мина готовят путем разведения основного рас-

твора в 2; 4; 8 и 16 раз водой. 10. Натр едкий

0,02 моль/л.

56

Х о д  и с с л е д о в а н и я .  Н а фильтроваль-

ную бумагу, предварительно пропитанную бар-

биталацетатным буфером и высушенную, на-

носят 0,02 мл исследуемой мочи. После высыха-

ния бумагу с нанесенной пробой окрашивают

индикатором, а избыток краски отмывают рас-

твором уксусной кислоты в течение 5—7 мин.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Результат

оценивают визуально, сравнивая окраску в

опыте с окраской, которую дают стандартные

растворы альбумина, обработанные так же, как

и опытная проба. Метод позволяет обнаружить в

моче белок, содержание которого составляет

2 мкг в пробе.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В норме бе-

лок в моче не обнаруживают.

Проба на гипераминоацидурню.  П р и н -

ц и п . Аминокислоты при нагревании с нингид-

рином образуют соединения, Окрашенные в сине-

фиолетовый цвет.

Реактивы. 1. Нингидрии. 2. Ацетон. 3. Уксус-

ная кислота (ледяная). 4. Раствор нингидрина:

5 г нингидрина на 1 л смеси. К 0,5 г нингидрина

прибавляют 95 мл ацетона, 1 мл ледяной уксус-

ной кислоты и 4 мл дистиллированной воды.

5. Гликолол (глицин). 6. Раствор глицина:

150 мг глицина растворяют в 100 мл дистиллиро-

ванной воды; 1 мл раствора содержит 1,5 мг

глицина, что соответствует 0,28 мг аминоазота.

Из данного раствора глицина готовят серию

разведений: 1; 3, 6; 9;\18; 24; 36; 54 мл рас-

твора глицина доводят до 100 мл водой. Приго-

товленные растворы соответствуют 0,28; 0,84;

1,68; 2,52; 5,04; 6,72; 10.08; 16,12 мг аминоазота

в 100 мл. Растворы стабильны при хранении в

холодильнике в течение 1 мес.

Х о д  и с с л е д о в а н и я .  Н а фильтроваль-

ную бумагу наносят 0,02 мл мочи и после подсу-

шивания окрашивают раствором нингидрина,

затем высушивают на воздухе до полного исчез-

новения запаха уксусной кислоты и помещают

в сушильный шкаф при температуре 60 "С на

15 мин.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Окраску опы-

та сравнивают с окраской стандартных раство-

ров глицина, обработанных так же, как образец

мочи, для чего берут по 0,02 мл каждого раство-

ра. Результаты выражают в миллиграммах

аминоазота, выделенного с мочой за сутки,

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Выделение

аминоазота за сутки у детей не превышает I—

2 мг/кг. В ночное время выделяется

 2

/з—

3

/< су-

точного количества аминоазота.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Гиперами-

ноацидурия возникает при наследственной

(синдром Дебре — де Тони — Фанкони) и при-

обретенной (гломерулонефрит) патологии в

почках, а также при некоторых заболеваниях

печени. Для выяснения причины гиперамино-

ацидурии необходимо определение концентра-

ции аминокислот в крови и' моче и вы-

числение их клиренса.

Обнаружение цистина и гомоцистииа.

П р и н ц и п . Азид натрия и йод образуют

комплекс бурого цвета, который обесцвечивает-

ся в присутствии цистина и гомоцистина.

Р е а к т и в ы . I. Натрия азид. 2. Йод кри-

сталлический. 3. Раствор йода: 12,69 г кристал-

лического йода отвешивают в бюксе, растворя-

ют в насыщенном растворе йодида калия (37 г

KI в 26 мл дистиллированной воды), переносят

в колбу и доливают дистиллированной водой до

1 л. Можно использовать фиксанал йода 0,1 н.

4. Этиловый спирт 96 %, 5. Раствор азида

натрия: 1,5 г азида натрия растворяют

в 50 мл раствора йода и доводят объем этиловым

спиртом до 100 мл. Раствор хранят в посуде тем-

ного стекла в холодильнике.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Каплю мочи на-

носят на фильтровальную бумагу и после вы-

сушивания добавляют 1 каплю раствора азида

натрия. В течение 5 мин наблюдают за исчезно-

вением бурой окраски.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в .  П о времени

исчезновения окраски судят о наличии амино-

кислот в исследуемой моче. Для полуколичест-

венной оценки результатов окраску пробы

можно сравнивать с цветной шкалой, для полу-

чения которой готовят раствор цистина и гомо-

цистина, содержащий 0,6 мг каждой амино-

кислоты в 1 мл. Из этого раствора готовят

растворы с содержанием аминокислот от 0,6 до

0,3 мг/мл. Нижняя граница чувствительности

пробы 0,3 мг/мл.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Бурая

окраска исчезает через 2—3 мин после добавле-

ния азида натрия.

П р и м е ч а н и е . Ложноположительную

реакцию дают ангидрид аргииинянтарной кис-

лоты, ацетон, некоторые лекарственные пре-

параты.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Тест поло-

жителен при наследственной или приобретенной

цистинурии или гомоцистинурии, в этом случае

окраска остается более 5 мин.

Обнаружение пролииа и других аминокислот.

П р и н ц и п . Изатин образует с некоторыми

аминокислотами специфически окрашенные

соединения.

Р е а к т и в ы . 1. Изатин. 2. Ацетон. 3. Рас-

твор изатина в ацетоне 0,2 г/л. Раствор хранят в

холодильнике при температуре 4 °С. 4. Соляная

кислота 1 моль/л.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . Фильтровальную

бумагу пропитывают раствором изатина в аце-

тоне и высушивают. Затем наносят на нее 1 кап-

лю мочи и высушивают при 100 °С в течение

10 мин, смачивают раствором соляной кислоты

и промывают водой.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Сине-серую

окраску дает повышенное содержание фенила-

ланина, коричневую — триптофан, пурпурную—

смесь различных аминокислот, а появление си-

ней окраски в виде ободка свидетельствует о

присутствии в моче свободного пролина (не менее

0,1 мг/мл). Можно сравнивать интенсивность

окраски с цветной шкалой. Для приготовления

стандартных растворов, содержащих от 0,1 до

0,5 мг/мл соответствующих аминокислот, ис-

пользуют растворы аминокислот с исходной

концентрацией 0,5 мг соответствующей амино-

кислоты в 1 мл раствора.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Пролин-

урия возможна при патологии почек и как сим-

птом наследственногс) нарушения обмена.

Обнаружение мтокнслот (проба с треххло-

ристым железом). П р.и и ц.и п, Треххлористое

железо в присутствии HCI дает с кетокислотами

специфически окрашенные соединения.

Р е а к т и в ы . 1. Железо треххлористое

(FеСl

3

-6Н

2

О), 10 % раствор. 2. HCI, 10% рас-

твор. 3. Аммиак водный концентрированный.

4. Магния хлорид (MgCl

2

-6H

2

O): к 11 г хлорида

магния прибавляют 20 мл концентрированного

водного аммиака и объем доводят водой до 1 л.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . Вариант 1: к 0,5мл

мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористо-

го железа, при положительной реакции появля-

ется темно-зеленый осадок. Вариант П: для свя-,

зывания фосфатов, мешающих реакции, к 4мл

мочи прибавляют 1 мл раствора хлорида маг-

ния, перемешивают и через 5 мин фильтруют,

К фильтрату добавляют по 2 капли раствора

соляной кислоты и раствора треххлористого

железа; 5 мин наблюдают развитие окраски.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . О наличии ке-

токислот судят по характеру окраски, но окраска

может развиваться и за счет других соединений

(табл. 19).

57

Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4-

динитрофенилгидразином.  П р и н ц и п . Кето-

кнслоты образуют с 2,4-динитрофенилгидрази

ном окрашенные гидразоны.

Р е а к т и в ы . 1. HCI, 2 моль/л. 2. 2,4-Ди-

нитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ): 2 г 2,4-

ДНФГ растворяют в 1 л 2 моль/л HCI. 3. Диэти-

ловый эфир. 4. Натрия карбонат (NO

2

CO

3

),

100 г/л.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . Смешивают 1 мл

раствора 2,4-ДНФГ и 0,25 мл мочи. Через 10 мин

прибавляют 1,25 мл днэтилового эфира и пере-

мешивают, эфирный слой отсасывают и перено-

сят в пробирку, куда добавляют равный объем

раствора натрия карбоната. Содержимое про-

бирки перемешивают.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . При положи-

тельной пробе развивается окраска от желтой

до оранжево-коричневой. В норме проба отрица-

тельная, окраска не развивается.

Обнаружение гомогентизиновой кислоты.

П р и н ц и п . В щелочной среде гомогентизино-

вая кислота окисляется с образованием соеди-

нений сине-фиолетового цвета.

Р е а к т и в : едкий натр, 100 г/л.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . К 0,5 мл мочи при-

бавляют 3—4 капли раствора едкого натра, ре-

зультат оценивают через 1—2 мин.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . При положи-

тельной реакции развивается сине-фиолетовое

окрашивание, при отрицательной — окраска не

возникает.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Кетокисло-

ты в большом количестве выделяются с мочой

при нарушении различных обменных процессов,

в частности цикла Кребса; производные фено-

тиазида или салицилата — при отравлениях

ими, 3-окснантраннловая кислота — при нару-

шениях обмена триптофана.

Обнаружение инднкана.  П р и н ц и п . Пре-

вращение индикана в индоксил после гидролиза

эфирной связи сильной минеральной кислотой и

последующее окисление индоксила треххлорис-

тым железом с образованием окрашенного со-

единения.

Реактивы. 1. Свинца ацетат (СНзСОО)

2

РЬХ

X ЗН

2

О), 100 г/л раствора. 2. HCI концентриро-

ванная. 3. Железо треххлористое (FеСl

3

 • 6Н

2

О).

4. Реактив Обермейра: 0,4 г треххлористого же-

леза растворяют в 100 мл концентрированной

НС1. 5. Хлороформ. 6. Натрия тиосульфат

(Na

2

S

2

O

3

X5H

2

O), 200 г/л раствора.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . К4 мл мочи при-

бавляют 0,4 мл раствора ацетата свинца для

осаждения желчных пигментов, солей и других

веществ, мешающих реакции. Фильтруют, I —

2 мл фильтрата смешивают с равным объемом

реактива Обермейра, прибавляют 0,5—1 мл хло-

роформа и осторожно перемешивают.

Если слой хлороформа окрашивается в си-

ний или красный цвет, его отсасывают и

добавляют к нему 2—3 капли тиосульфа-

та натрия.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . При положи-

тельной реакции окраска хлороформа не исче-

зает после добавления тиосульфата натрия. В

норме реакция отрицательная.

58

Обнаружение фруктозы (проба Селиванова)

П р и н ц и п . При нагревании фруктозы срезор-

цином в кислой среде образуются соединения,

окрашенные в красный цвет.

Р е а к т и в ы . 1. НС1, 1 моль/л. 2. Резорцин:

5 г в 1 л, 1 моль/л раствора НС1.

Х о д об н а р у же н  и я . К 2 мл мочи при-

ливают 1 мл раствора резорцина н нагревают

до закипания.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т а . При положи-

тельной пробе развивается интенсивное красное

окрашивание. В норме окраска не появляется.

П р и м е ч а н и е . Оценку пробы проводят е

момент закипания, так как при длительном кипе-

нии окраска может развиться при наличии глю-

козы. Пищевая нагрузка медом и фруктами

может дать положительную пробу.

Обнаружение лактозы и 'мальтозы (пробе

Велька).  П р и н ц и п. Лактоза и мальтоза в

щелочной среде при нагревании с аммиаком

образуют окрашенные соединения.

Р е а к т и в ы. 1. Аммиак водный концентри-

рованный. 2. Кали едкое, 200 г/л раствора.

Х о д о б н а р у ж е я и я. К 5 мл мочи при-

ливают 2,5 мл аммиака и 0,2 мл раствора едкого

кали. Нагревают на водяной бане 30 мни при

60 °С.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в. При положи-

тельной реакции на лактозу появляется корич-

невая окраска, а при наличии Мальтозы —

красная окраска. В норме окраска не развивает-

ся.

Обнаружение пентоз (проба Биаля). П р и н-

ц и п. Пентозы с орцином и треххлористым же-

лезом при нагревании в кислой среде образуют

окрашенные соединения.

Р е а к т и в ы . 1. 5-Метнлрезорцим (ориин)

2. HCI концентрированная. 3. Железо треххло-

ристое (FеС1

3

-6Н

2

О), 100 г/л раствора. 4. Реак-

тив Биаля: 1 г орцина растворяют в 500 мл НСl

кислоты и добавляют 1 мл раствора треххлоряс-

того железа.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . Нагревают 1  м л

мочи до кипения с 5 мл реактива Биаля.

О ц е н к а  р е з у  л ь  т а  т о в . При положи-

тельной пробе появляется яркая желто-зелена?

окраска. В норме проба отрицательная.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Обнаруже-

ние глюкозы, фруктозы, пёнтозы, лактозы и

мальтозы в моче может быть результатом врож-

денных ферментопатий, а лактоза и мальтоза

могут быть обнаружены при нарушении их

гидролиза в тонкой кишке.

Обнаружение гликозоаннномаканов {проба

с цетилтриметнламмония бромидом), П р и н-

ц и п. Цетилтриметнламмония бромид (ЦТАБ )

с гликозаминогликанами образует в кислой сре-

де белый осадок.

Р е а к т и в ы . 1. Лимонная кислота. 2.Едкий

натр. 3. Цитратный буфер, 1 ммоль/д, рН 5,7: в

небольшом количестве воды растворяют 210 г

лимонной кислоты, добавляют 120 г едкого

натра, растворяют, охлаждают и доливают

водой до 1 л. 4. Раствор ЦТАБ, 25 г.в 1л цитрат-

ного буфера.

Х о д  о б н а р у ж е н и я . К 5 мл мочи при-

ливают 1 мл раствора ЦТАБ и в течение 30 мин