Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 13

питанную раствором ферментов и красителя.

С понощью бумаги «Глюкотест» можно обнару-

жить глюкозу в моче и ориентировочно опреде-

лить ее концентрацию. Комплект состоит из

100 штук реактивных полосок, цветной шкалы,

пластинки из пластмассы и инструкции. Иссле-

дование проводят строго по инструкции.

Х од и сс л е д о в а ни я.. Бумагу «Глюко-

тес»» погружают к исследуемую мочу так, чтобы

желтая полоса с реактивами оказалась смочен-

ной, после этого ее немедленно извлекают из

мочи и на 2 мин оставляют на пластмассовой

пластинке. По истечении 2 мин сразу же сравни-

вают изменившуюся окраску цветной полосы на

бумаге со шкалой, имеющейся в комплекте.

Содержаяие глюкозы в моче определяют по

наиболее совпадающему со шкалой цвету по-

лоски.

П р и м е ч а н и я: I. Хранить полоски

надо при температуре от +8 до +18 °С, избе-

гать попадания на них прямых солнечных лучей;

не рекомендуется дотрагиваться рукой до цвет-

ной шкалы полоски. 2. Исследуют свежесобран-

ную мочу. 3. При содержании в моче глюкозы

более 20 г/л интенсивность окраски цветной

полосы становится предельной (соответствует

2 % по шкале) и далее не меняется.

Срок годности полосок «Глюкотест» 8 мес со

дня выпуска. Подобные тесты выпускают и зару-

бежные фирмы.

Унифицированные методы обнаружения глю-

козы в моче. Проба Гайнеса (1972). Можно

использовать готовый набор реактива.

П р и н ц и п метода основан на способности

глюкозы восстанавливать в щелочной среде при

нагревании гидрат окиси меди (синего цвета)

в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись

меди (красного цвета). Для того чтобы из гидра-

та окиси, меди при нагревании не образовался

черный осадок окиси меди, к реактиву добавля-

ют глицерин, тидроксильные группы которого

связывают гидрат окиси меди.

Р е а к т и в ы . Реактив Гайнеса: 1) 13,3 г

кристаллического сульфата меди х. ч. (Сu-

SO4 5НаО) растворяют в 400 мл дистиллиро-

ванной воды; 2) 50 г едкого натра растворяют

в 400мл дистиkлированной воды; 3) 15 г глице-

рина (ч. или ч. д. а.) растворяют в 200 мл

дистиллированной воды. Смешивают раство-

ры 1 и 2 и тотчас же приливают раствор 3. Ре-

актив стоек.

X о д и с с л е д о в а н и я. К 6—8 мл мочи

прибавляют 20 капель реактива до появления

голубоватой окраски, смешивают н нагревают

верхнюю часть пробирки до начала кипения.

Нижняя часть пробирки — контроль. При нали-

чии глюкоэы в моче появляется желтая окраска

в верхней части пробирки.

П р и м е ч а н и е . При бактериурии глю-

коза мочи быстро разлагается. Можно использо-

вать готовый набор реактивов:

Унифицированный поляриметрический метод

определения содержания глюкозы (1972).

П р и н ц и п. Метод основан на использовании

свойства раствора глюкозы вращать плоскость

поляризованного луча вправо. Угол вращения

пропорционален концентрации глюкозы в

растворе.

Р е а к т и в ы . 30% раствор ацетата свинца.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у до в а н и е: по-

ляриметр.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Исследуемая мо-

ча должна быть кислой реакции, прозрачной

и не содержать белка. Белок удаляют кипячени-

ем с последующим фильтрованием. Необходимо

также обесцветить мочу, так как некоторые пиг-

менты могут быть оптически активны. Лучше

всего обесцвечивание достигается обработкой

ацетатом свинца, для этого к 10 мл мочи прили-

вают 1 мл 30 % ацетата свинца, подкисленного

несколькими каплями уксусной кислоты (в ще-

лочной среде свинец осаждает глюкозу), переме-

шивают, фильтруют. Исследовать можно только

прозрачный фильтр. Затем трубку поляриметра

наполняют прозрачным фильтратом, избегая по-

падания пузырьков воздуха, накрывают шлифо-

ванным стеклом, помещают в аппарат и через

2—3 мин проводят определение; это время не-

обходимо для затихания колебаний частиц жид-

кости. Определение ведут строго по инструкции,

прилагаемой к данному аппарату.

Точность поляриметра проверяют, исследуя

стандартный раствор глюкозы, но этот раствор

годен для работы только через 24 ч после его

приготовления.

П р и м е ч а н и е . Определению могут

мешать р-оксимасляная кислота, препараты тет-

рациклннового ряда, стрептомицин.

Определение сахара в моче по цветной ре-

акции с ортотолуидином см. Определение глюка-

зы в крови.

Н о р м а л ь н о е  з н а ч е н и е . Нормаль-

ную концентрацию глюкозы в моче до 0,2 г/л

обычными пробами не обнаруживают. Появле-

ние глюкозы в моче может быть результатом

физиологической гипергликемии (алиментар-

ной, эмоциональной, лекарственной).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Появление

глюкозы в моче зависит от концентрации ее

в крови, от процесса фильтрации в клубочках

(гломерулярных клиренсов) и от реабсорбции

глюкозы в канальцах нефрона. Патологические

глюкозурии делятся на панкреатогенные и вне-

панкреатические. Важнейшая из панкреатоген-

ных — диабетическая глюкозурия.. Внепанкреа-

тические глюкозурии наблюдаются при раздра-

жении ЦНС, гипертиреозе, синдроме Иценко —

Кушинга, патологии печени, почек. Для оценки

степени выраженности глюкозурии необходимо

рассчитывать потерю глюкозы с мочой за сутки.

Кетоновые тела. Унифицированная проба

Ланге (1979).  П р и н ц и п . Нитропрусснд на-

трия в щелочной среде реагирует с кетоновыми

телами (ацетоуксусной кислотой, р-оксимасля-

ной кислотой и ацетоном) с образованием ком-

плекса красно-фиолетового цвета.

Р е а к т и в ы . 1. Натрия нитропрусснд,

раствор 50 г/л; готовят перед употреблением.

2. Уксусная кислота концентрированная. 3. Ам-

миак водный (МШОН) — 25 % раствор.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Исследуют мочу

в первые 3 ч после мочеиспускания. В пробирку

к 3—5 мл мочи приливают 5—10 капель раство-

51

pa натрия нитропруссида и 0,5 мл уксусной

кислоты, смешивают, а затем осторожно по стен-

ке пробирки пипеткой наслаивают 2—3 мл во-

дного раствора аммиака. Пробу считают поло-

жительной, если в течение 3 мин на границе сред

образуется красно-фиолетовое кольцо.

Модифицированная проба Ротеры (1979).

П р и н ц и п тот же, что и в пробе Ланге.

Р е а к т и в ы . 1. Натрия ннтропруссид,

раствор 50 г/л; готовят перед употреблением.

2. Аммония сульфат. 3. Аммиак водный

(NН

4

ОН) — 25 % раствор.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Приблизительно

200 мг сухого сульфата аммония, 5 капель мочи

и 2 капли раствора натрия нитропруссида тща-

тельно смешивают в пробирке, а затем на эту

смесь осторожно наслаивают 10—15 капель

раствора водного аммиака. При наличии кетоно-

вых тел на границе раздела в течение 3—5 мин

образуется красно-фиолетовое кольцо, интен-

сивность окраски которого позволяет ориентиро-

вочно судить о концентрации кетоновых тел

в моче (табл. 16).

Т а б л и ц а 16. Ориентировочная количествен-

ная оценка кетоновых тел в моче

Интенсивность

окраски

Следы

Умеренная

Интенсивная

Обнаруживаемые

вещества, г/л

ацетоуксусная

кислота

0,05

0,3

0,8

ацетон

0,2

2,5

8

При незначительной концентрации кетоно-

вых тел слабое кольцо может появиться на

8—10-й минуте.

Метод с готовым набором для экспресс-

анализа ацетона в моче.  П р и н ц и п тот же, что

и в предыдущих 2 пробах.

Х о д  о п р е д е л е н и я . На полоску филь-

трованной бумаги помещают таблетку, на кото-

рую пипеткой наносят 2 капли исследуемой

мочи. Через 2 мин окраску таблетки сравнивают

с цветной шкалой. Наличие ацетона вызывает

фиолетовое окрашивание разной интенсивности;

согласно шкале, реакцию оценивают как слабо-

положительную, положительную и резко поло-

жительную.

Ряд фирм выпускает экспресс-тесты для оп-

ределения кетоновых тел (табл. 17); определе-

ние с помощью таких тестов проводят строго по

инструкции.

П р и м е ч а н и е . Ацетоуксусная кисло-

та в стерильной моче стабильна до 8—10 дней,

при бактериурии или большом количестве дрож-

жевого грибка может полностью исчезнуть в те-

чение 24 ч. Около 20% ацетона при комнатной

температуре исчезает за 24 ч, но сохраняется

52

в холодильнике; Кетоновые тела могут исчезать

из мочи и in vivo при бактериурии.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В норме

с мочой выделяется 20—50 мг кетоновых тел за

24 ч.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Чаще всего

кетонурия наблюдается при диабете, что явля-

ется критерием правильности подбора пищевого

режима: если количество вводимых жиров не со-

ответствует количеству усваиваемых углеводов,

то увеличивается выделение кетоновых тел. При

уменьшении введения углеводов (лечение без

инсулина) при обычном количестве жиров начи-

нает выделяться ацетон; при лечении инсулином

уничтожение глюкозурии достигается лучшим

усвоением углеводов и не сопровождается кето-

нурией. Таким образом, обнаружение кетоновых

тел в моче больных диабетом необходимо для

регулирования диеты.

Л и т е р а т у р а , Меньшикова В. В., В айн-

штейн Т. Я — Лаб. дело, 1984, № 2, с. 84; Мето-

дические рекомендации по применению экспресс-

тестов (сухих диагностических проб) в медицин-

ской практике.— М., 1977; Henry R. I. Clinical

chemistry. Principles and technics.— New York,

1964, p. 689—698.

ЖЕЛЧНЫЕ ПИГМЕНТЫ. БИЛИРУБИН.

Большинство качественных проб для обнаруже-

ния билирубина в моче основано на его превра-

щении под действием окислителя в зеленый

биливердин или пурпурно-красные билипур-

пурины, которые, примешиваясь к биливердину,

дают синее окрашивание.

Унифицированная проба Фуше (.1972). Р е-

а к т и в ы. 1.15 % раствор хлорида бария. 2. Ре-

актив Фуше: 25 г трихлоруксусной кислоты

растворяют в 100 мл дистиллированной воды и

приливают 10 мл 10 % раствора хлорного же-

леза (FeCU).

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 10 мл мочи при-

бавляют 5 мл 15 % раствора хлорида бария.

Смешивают, фильтруют. На вынутый из воронки

и расправленный на дне чашки Петри фильтр

наносят 2 капли реактива Фуше. Появление на

фильтре сине-зеленых пятен говорит о присут-

ствии билирубина. Если реакция мочи щелоч-

ная, то необходимо подкислить ее несколькими

каплями уксусной кислоты.

Унифицированная проба Резина (1972).

Р е а к т и в : 1% спиртовой раствор йода.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку нали-

вают 4—5 мл мочи и осторожно по стенкам

пробирки наслаивают раствор йода. Появление

на границе между жидкостями зеленого кольца

говорит о наличии билирубина:

Проба Готфрида.  П р и н ц и п . Билирубина

глюкуронид (холебилирубин) при соединении

с диазотированной сульфаниловой кислотой

(диазобензосульфоновая кислота) дает розовую

окраску за счет образования билирубина.

Р е а к т и в ы . 1. 10% раствор хлорида ба-

рия. 2. Диазореактив: а) диазораствор 1: 5 г

сульфаниловой кислоты растворяют в неболь-

шом количестве воды, прибавляют 15 мл концен-

трированной НС1 и доливают до 1000 мл дистил-

Т а б л и ц а 17. Экспресс-тесты для обнаружения кетоновых тел в моче

лированной водой; б) диазораствор II: 0,5 % ра-

створ нитрата натрия. Непосредственно перед

определением смешивают 10 мл диазораство-

ра I и 0,25 мл диазораствора II, 3. Спирт этило-

вый 96 %, 4. 6 % раствор двузамещенного фос-

фата натрия.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 10 мл мочи, под-

кисленной несколькими каплями уксусной кисло-

ты, прибавляют 5 мл 10 % раствора хлорида ба-

рия, перемешивают, фильтруют через бумажный

фильтр. Фильтр раскладывают на дне -чашки

Петри и на осадок, содержащий билирубин,

капают 1—2 капли свежеприготовленной диазо-

смеси, 4 капли спирта и 1 каплю двузамещенного

фосфата натрия. При положительной пробе по-

лучается красно-фиолетовая окраска.

Принцип описанной пробы лег в основу эк-

спресс-тестов для определения билирубина, вы-

пускаемых зарубежными фирмами «Ames»

(Англия), «Boehringer» (ФРГ) и др.

Н о р м а л ь н ы е  з н а ч е н и я . Моча, здо-

ровых людей содержит минимальные количества

билирубина, которые не могут быть обнаружены

качественными пробами, применяемыми в прак-

тической

 :

медицине. С мочой выделяетсй только

билирубина глюкуроннд (прямой билирубин),

концентрация которого в норме в крови незна-

чительна.

К л и н и ч е с к о е значение. Биляруби-

нурню наблюдают главным образом при порa-

жениях паренхимы печени (паренхиматозные

желтухи) и нарушении оттока, желчи (обтура-

ционные желтухи). Для гемолитической желту-

хи билирубинурия нехарактерна, так как гемо-

билирубин (непрямой билирубин) не проходит

через почечный фильтр;

УРОБИЛИНОИДЫ. Унифицированная про-

ба Флорамса (1979)  . П р и н ц и п С HCI уроби-

лин образует соединение, окрашенное в крас-

ный цвет.

53

Р е а к т и в ы . 1. Серная кислота концентри-

рованная. 2. Диэтиловый эфир. 3. НС1 концен-

трированная.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Мочу в количе-

стве 8—10 мл подкисляют в пробирке 8—10 кап-

лями концентрированной серной кислоты, пере-

мешивают, затем приливают 2—3 мл эфира и,

закрыв пробирку пробкой, несколько раз осто-

рожно пропускают эфир через слой мочи для

экстрагирования уробилина. Затем эфирную вы-

тяжку мочи наслаивают, лучше пастеровской

пипеткой, на 2—3 мл концентрированной HCI,

налитой в другую пробирку. При наличии уроби-

лина иа границе жидкостей образуется розовое

кольцо. Интенсивность окраски пропорциональ-

на количеству уробилина.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т а . Проба настоль-

ко чувствительна, что даже в норме на границе

между двумя жидкостями видно легкое розовое

окрашивание. Этой пробой можно установить

полное отсутствие уробилиноидов в моче.

Унифицированная проба Богомолова (1979).

П р и н ц и п . Уробилин с сульфатом меди обра-

зует соединение красно-розового цвета.

Р е а к т и в ы . 1. Меди сульфат ч. д. а., насы-

щенный раствор: 23 г CuSO

4

5H

2

O растворяют

в 100 мл дистиллированной воды. 2. Хлороформ.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . К 10—15 мл мочи

приливают 2—3 мл насыщенного раствора суль-

фата меди. Если образуется помутнение, то при-

бавляют несколько капель концентрированной

HCI до прояснения раствора. Через 5 мин прили-

вают 2—3 мл хлороформа и, закрыв пробирку

пробкой, несколько раз встряхивают.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Если хлоро-

форм окрашивается в розовый цвет, то концен-

трация уробилина в моче выше нормальной.

Унифицированная бензальдегидная проба

Нейбауэра (1979).  П р и н ц и п . Проба основа-

на на том, что уробилиногеновые тела с пара-

диметяламинобензальдегидом (реактив Эрли-

ха) дают соединение красной окраски.

Р е а к т и в . Реактив Эрлиха: 2 г пара-диме-

тила.минобензальдегида растворяют в 100 мл

20%; раствора НС1 кислоты.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . К 3—4 мл свеже-

вьщущенной мочи, охлажденной до комнатной

температуры, прибавляют 3—4 капли реактива

Эрлиха (I каплю на I мл мочи). Окрашивание

жидкости в красный цвет в течение первых 30 с

говорит об увеличенном содержании уробилине-

гена в моче; если окрашивание развивается по

прошествии 30 с, то концентрация уробилина

в моче нормальная, а если через 30 с окраска

не развивается, то это может быть вариантом

нормы или говорить о полном отсутствии уро-

бнлиногена в моче.

. . П р и м е ч а н и е . Билирубин мешает опре-

делению уробилиноидов, поэтому, если он об-

наружен в моче, его следует предварительно

удалить, осаждая хлоридом бария с последу-

ющим фильтрованием, для этого к 10—12 мл

мочи-приливают 5—6 мл 10% раствора

BaCl

2

 и фильтруют. Затем фильтрат прове-

ряют на полноту осаждения билирубина и

процедуру повторяют, если первое осаждение

было, неполным.

Унифицированный метод с пара-диметил-

аминобензальдегидом (1979) . П р и н ц и п . Уро-

билиноген с пара-диметнламинобензальдегидом

образует комплекс, окрашенный в красный цвет,

:

интенсивность окраски пропорциональна содер-

жанию уробилиногена. Для восстановления уро-

билина в уробилиноген используют аскорбинок

вую кислоту н гидрат окиси железа. Для увели-

чения специфичности реакции добавляют ацетат

натрия.

Р е а к т и в ы . 1. 4-Диметнл аминобензаль-

дегид (пара-диметнламинобензальдегнд). 2. HCI

концентрированная х. ч. 3. Реактив Эрлиха;

0.7 г пара-диметиламинобензальдегида раство-

ряют в 150 мл концентрированной HCI, прили-

вают к 100 мл дистиллированной воды и смеши-

вают. Раствор должен быть бесцветным или

слегка желтоватым. Хранят в посуде из темного

стекла. Реактив стабилен. 4. Натрия ацетат

ч. д. а., х. ч., насыщенный раствор: 375 г

СНзСООNa-ЗН

2

О (или 226 г CH

3

COONa)

растворяют в 250 мл теплой дистиллированной

воды, охлаждают до комнатной температуры.

Хранят при температуре 20 "С. Раствор должен

быть бесцветным и прозрачным. 5. Аскорбино-

вая кислота. 6. Натр едкий: 0,5 г/л раствора.

7. Бария хлорид, 100 г/л раствора. 8. Фенол-

сульфофталеин (феноловый красный). Исполь-

зуют для приготовления калибровочного раство-

ра. 9. Основной калибровочный раствор: 20 мг

фенолсульфофталеина растворяют в 100 мл

0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при

хранении. Рабочий калибровочный раствор го-

товят разведением основного раствора 0,5 г/л

раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен в те-

чение недели с условием хранения при 20 °С.

Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсуль-

фофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске

раствору уробилиногена — 0,345 мг/100 мл.

Точность приготовления можно проверить изме-

рением оптической плотности раствора на спек-

трофотометре: при длине волны 562 им опти-

ческая плотность раствора должна быть 0,380—

0,390.

С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н н е : фо-

тозлектроколориметр или спектрофотометр.

П о д г о т о в к а  о б р а з ц а . Исследова-

ние проводят в первые 2—3 ч после мочеиспуска-

ния. При наличии мутности мочу центрифуги-

руют, а затем проводят качественное определе-

ние билирубина. Если обнаруживают билиру-

бин, то 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раст-

вора хлорида бария и фильтруют через бумаж-

ный фильтр. Конечный результат умножают на

1,25, чтобы внести поправку на разведение.

Х о д  о п р е д е л е н и я . 100 мг аскорбино-

вой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой

мочи и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки для

опытной и холостой пробы. В пробирку с холо-

стой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготов-

ленной смеси одного объема раствора Эрлиха

и двух объемов насыщенного раствора ацетата

натрия. В пробирку с опытной пробой прибав-

ляют 1,5 мл раствора Эрлиха и немедленно при-

ливают 3 мл насыщенного раствора ацетата

натрия. Через 5 мин измеряют экстинкцию обеих

проб против воды на ФЭК при длине волны

54