Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 12

Р а з д

 ел 2

ХИМИКО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

2.1. МОЧА

Для исследования собирают всю порцию

утренней мочи после тщательного туалета поло-

вых органов. Мочу необходимо собирать в со-

вершенно чистую, сухую посуду; хранить до

исследования можно не более  l ' / 2 ч в холодном

месте. Применение консервирующих веществ не-

желательно, но допускается в виде исключения,

если анализ не может быть произведен в поло-

женное время. Лучшие результаты наблюдения

при обработке мочи тимолом (кристаллик тимо-

ла на 100—150 мл мочи).

2.1.1. Физические свойства

Количество. Количество утренней мочи

(обычно 150—250 мл) не дает представления

о суточном диурезе. Измерение объема утренней

мочи целесообразно для интерпретации ее отно-

сительной плотности,

Цвет. Нормальная моча окрашена в более

или менее насыщенный желтый цвет (от соло-

менного до янтарно-желтого). Окраска мочи

может меняться при приеме лекарственных пре-

паратов (ревеня, амидопирина, салицилатов

и др.) или употреблении некоторых пищевых

продуктов (свеклы, черники). Патологически

измененная окраска мочи бывает при гематурии

(вид мясных помоев), билирубинурии (оранже-

во-красный цвет).

Прозрачность. В нормальной моче все со-

ставные части находятся в растворе, поэтому

свежевыпущенная моча совершенно прозрачна.

Если моча оказывается мутной в момент выделе-

ния, то это обусловлено наличием в ней большо-

го количества клеточных образований, солей,

бактерий, жира. Ориентировочно установить

причину помутнения можно следующим обра-

зом: если при нагревании 4—5 мл мочи в про-

бирке она становится прозрачной, то помутнение

было вызвано мочекислыми солями (уратами);

если степень помутнения после нагревания не

изменяется, то к моче прибавляют 10—15 капель

уксусной кислоты, полное или даже частичное

исчезновение мути после этого говорит о том, что

она была вызвана фосфатами. Полная прозрач-

ность мочи может не достигаться потому, что

в таких случаях обычно имеется щелочная моча,

находящаяся в процессе разложения, которая

содержит микробы и клеточные элементы. По-

мутнение, исчезающее при добавлении НС1,

вызвано оксалатом кальция. Муть, обусловлен-

ная присутствием жира, исчезает при взбалты-

вании мочи со смесью эфира и спирта. Если моча

остается мутной, несмотря на все эти процедуры,

то муть, по всей вероятности, вызвана микроба-

ми, что распознается при микроскопическом

исследовании.

Реакция мочи. Определение рН при помощи

лакмусовой бумаги следует проводить одновре-

менно двумя ее видами: синей и красной.

Р е з у л ь т а т ы ; 1) синяя лакмусовая бума-

га краснеет, красная не изменяет своего цвета —

кислая реакция; 2) красная лакмусовая бумага

синеет, синяя не изменяет своего цвета — ще-

лочная реакция; 3) оба вида бумаги не меняют

своего цвета — нейтральная реакция.

Унифицированный метод определения рИ

мочи с индикатором бром-тимоловым синим

(1979).  Р е а к т и в ы . Бромтимоловый синий

(З

1

, 3"-дибромтимолсульфофталеин): 0,1 г

растертого в фарфоровой ступке индикатора

растворяют в 20 мл теплого этилового спирта

и после охлаждения до комнатной температуры

доводят водой до 100 мл.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Исследуют мочу

в первые 2—3 ч после мочеиспускания. К 2—

3 мл мочи добавляют 1—2 капли рабочего

раствора индикатора. Границы изменения окра-

ски индикатора лежат в диапазоне значений рН

6,0—7,6; этот диапазон обеспечивает определе-

ние кислой и щелочной реакции. Желтый цвет

соответствует кислой реакции, бурый — слабо-

кислой, травянистый — нейтральной, буровато-

зеленый — слабощелочной, зеленый и синий —

щелочной. Практическое выполнение этой ре-

акции очень просто и при большом количестве

исследований значительно экономит время. Од-

нако эти методы дают только ориентировочное

представление о кислой или щелочной реакции,

отличить мочу с нормальной кислотностью от

патологически кислой не представляется воз-

можным.

Выпускаемая в нашей стране универсальная

индикаторная бумага дает возможность опреде-

лить рН (значения даны с интервалом 1,0 в ши-

роком диапазоне — от 1,0 до 10,0 ). Кроме того,

некоторыми фирмами выпускаются специаль-

ные виды индикаторной бумаги, предназначен-

ные для определения рН мочи (диапазон зна-

чении рН 5,0—8,0), или комбинированные экс-

пресс-тесты, которые включают, кроме определе-

ния величины рН, несколько других показа-

телей.

47

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Моча здо-

ровых взрослых людей при обычном питании

имеет средние значения рН 6,25 ± 0,36 (от 5,0 до

7,0). Колебания рН мочи обусловлены составом

питания; мясная диета обусловливает кислую

реакцию мочи, растительная диета — щелочную.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . В норме

при смешанной пище в организме образуются

главным образом кислые продукты обмена. Ос-

нования попадают в организм при приеме ще-

лочных лекарств и питании богатой основания-

ми пищей (овощи, фрукты, молочные продукты).

Излишнее количество бикарбонатов выводится

почками, при этом моча становится щелочной.

Органические кислоты и кислые соли неорга-

нических кислот содержащиеся в моче, диссоци-

ируют в водной среде, выделяя известное коли-

чество свободных Н+. Концентрация (актив-

ность) свободных Н

+

-ионов представляет ис-

тинную реакцию мочи — активную кислотность

(РН).

Щелочность мочи увеличивается при рвоте,

особенно при высокой кислотности желудочного

сока, ощелачивающей терапии, хронической ин-

фекции мочевыводящих путей. Кислотность уве-

личивается при сахарном диабете, туберкулезе

почек, почечной недостаточности. Изменение рН

мочи соответствует изменениям рН крови; при

ацидозах моча имеет кислую реакцию, при алка-

лозах — щелочную. Однако иногда наблюда-

ется расхождение этих показателей. При хрони-

ческих поражениях канальцевого аппарата по-

чек (туберкулопатиях) в крови отмечается

картина гиперхлоремического ацидоза, а реак-

ция мочи щелочная, что связано с нарушением

синтеза кислоты и аммиака в связи с поражени-

ем канальцев.

При гипокалиемнческом алкалозе наблюда-

ется ацидурия. Недостаток калия увеличивает

секрецию Н

+

-ионов канальцами. В данной ситу-

ации это физиологический ответ почечных ка-

нальцев, направленный на поддержание ионного

равновесия между клетками и межтканевой

жидкостью. Таким образом, определение рН мо-

чи может иметь значение при дифференциальной

диагностике алкалоза и ацидоза разной этиоло-

гии.

Относительная плотность мочи (удельный

вес).  П р и н ц и п . Сравнение плотности мочи

е плотностью воды при помощи ареометра (уро-

метра) с диапазоном шкалы от 0,001 до 1,050.

Н е о б х о д и м о е  о б о р у д о в а н и е .

Цилиндр вместимостью 50 мл, урометр.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Мочу наливают

в цилиндр, избегая образования пены, затем

в нее осторожно погружают урометр. После

прекращения его колебаний отмечают относи-

тельную плотность по положению нижнего мени-

ска на шкале урометра. Урометр не должен

касаться стенок цилиндра. Температура иссле-

дуемой мочи должна быть 15±3°С. Если мочи

Мало, то можно перед исследованием развести ее

в 2—3 раза дистиллированной водой, а потом

полученную цифру относительной плотности ум-

ножить на степень разведения.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Относи-

тельная плотность зависит от концентрации

растворенных в ней веществ (белка, глюкозы,

мочевины, солей натрия и др.). Каждые 3 г/л

белка повышают относительную плотность мочи

на 0.001, а каждые 10 г/л глюкозы увеличивают

цифру плотности на 0,004. Цифры плотности

утренней мочи, равные или превышающие 1,018,

свидетельствуют о сохранении концентрацион-

ной способности почек и исключают необходи-

мость ее исследования с помощью специальных

проб.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Очень вы-

сокие или низкие цифры плотности утренней

мочи требуют выяснения причин, обусловивших

эти изменения. Низкая относительная плотность

связана с полиурией, а высокая при объеме

утренней мочи 200 мл и больше чаще всего

бывает при глюкозуриях.

2.1.2. Химическое исследование

БЕЛОК- Большинство качественных и коли-

чественных методов определения белка в моче

основаны на его коагуляции в объеме мочи или

на границе сред (мочи и кислоты); если есть

способ измерить интенсивность коагуляции, то

проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалицило-

вой кислотой (1972).  Р е а к т и в : 20% раствор

сульфосалициловой кислоты.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  В 2 пробирки нали-

вают по 3 мл профильтрованной мочи. В опыт-

ную пробирку прибавляют 6—8 капель реакти-

ва. На темном фоне сравнивают контрольную

пробирку с опытной. Помутнение в опытной

пробирке указывает на наличие белка, пробу

считают положительной.

П р и м е ч а н и е . Если реакция мочи ще-

лочная, то перед исследованием ее подкисляют

2—3 каплями 10 % раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга — Ро-

бертса—Стольникова (1972).  П р и н ц и п .

В основу положена кольцевая проба Геллера,

заключающаяся в том, что на границе азотной

кислоты и мочи при наличии белка происходит

его коагуляция и появляется белое кольцо.

Р е а к т и в ы . 30% раствор азотной кисло-

ты (относительная плотность 1,2) или реактив

Ларионовой. Приготовление реактива Ларионо-

вой: 20—30 г хлорида натрия растворяют при

нагревании в 100 мл дистиллированной воды,

дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата

приливают 1 мл концентрированной азотной

кислоты.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку нали-

вают 1—2 мл азотной кислоты (или реактива

Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки,

наслаивают такое же количество профильтро-

ванной мочи. Появление тонкого белого кольца

на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й ми-

нутой указывает на наличие белка в концентра-

ции примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется

раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует

развести водой и провести повторное наслаива-

ние уже разведенной мочи. Степень разведения

48

мочи подбирают в зависимости от вида кольца,

т. е. его ширины, компактности и времени по-

явления. При нитевидном кольце, появившемся

ранее 2 мин, мочу.разводят в 2 раза, при широ-

ком— в 4 раза, при компактном—в 8 раз

и т. д. Концентрацию белка при этом вычисляют

путем умножения 0,033 на степень разведения

и выражают в граммах на 1л (г/л).

П р и м е Ч а н и е. Иногда белое кольцо

получается при наличии больших количеств ура-

тов. В отличие от белкового кольца уратное

появляется немного выше границы между двумя

жидкостями и растворяется при легком нагрева-

нии.

Количественное определение белка в моче по

помутнению, образующемуся, при добавлении

сульфосалнциловой кислоты (1972).  П р и н -

ц и п . Интенсивность помутнения при коагуля-

ции белка сульфосалициловой кислотой пропор-

циональна его концентрации.

Р е а к т и в ы . 1.3% раствор сульфосалици-

ловой кислоты. 2. 0,9 % раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина — 1 %

раствор (I мл раствора, содержащий 10 мг

альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина

(из человеческой или бычьей сыворотки) раство-

ряют в небольшом количестве 0,9% раствора

хлорида натрия в колбе вместимостью 100, мл,

а затем доводят до метки тем же раствором.

Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5 %

раствора азида натрия (NaN

3

). При хранении

в холодильнике реактив годен в течение 2 мес.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е : фо-

тоэлектроколориметр.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку вносят

1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до

5 мл 3 % раствором сульфосалициловой кисло-

ты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на

фотоэлектроколориметре при длине волны 590—

650 им (оранжевый: или красный-светофильтр)

против контроля в. кювете длиной оптического

пути 5 мм. Контролем служит пробирка в кото-

рой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до

5 мл 0,9 % раствор хлорида натрия. Расчет

ведут по калибровочному графику, для построе-

ния которого из стандартного раствора готовят

разведения, как указано в табл. 15.

Т а б л и ц а 15. Приготовление разведений для

построения калибровочного графике

Из каждого полученного

 :

 раствора берут

1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

П р и м е ч а н и е. Прямолинейная зави-

симость при построении калибровочного графи-

ка сохраняется до 1 г/л. При более высоких

концентрациях пробу следует разводить и учи-

тывать разведение при расчете.

Ложноположйтельные результаты могут

быть получены при наличии в моче контрастных

веществ, Содержащих органический йод. Поэто-

му тест Нельзя использовать у лиц, принимаю-

щих Препараты йода; лоЖноположительный тест

может быть Также обусловлен приемом сульфа-

ниламидных препаратов, больших доз пеницил-

лина и при высоких концентрациях в моче

мочевой кислоты:

Бнуретовый метод.  П р и н ц и п . Пептидные

связи белка с солями меди в щелочкой среде

образуют комплекс фиолетового цвета: Белки

предварительно осаждают трихлоруксусной кис-

лотой.

Р е а к

;

т и в ы с у л ь ф а т а. I. 10% раствор

трнхлоруксусной кислоты. 2. 20 % раствор меди

(CuSо

4

-2H

2

O): 3, 3% раствор NaOH.

Х о д  о п р е д е л е н и я . К 5 Мл мочи, взятой

из суточного количества, прибавляют 3 мл

раствора трихлоруксусной кислоты, центрифу-

гируют до постоянного объема осадка. Надоса-

дочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок

затем растворяют в 5 мл раствора NaOH.

К раствору добавляют 0,25 мл Си SO

4

, смесь

перемешивают к центрифугируют. Надосадоч-

ную жидкость фотометрируют при длине волны

540 им в кювете с длиной оптического пути 10 мм

против дистиллированной воды. Концентрацию

белка рассчитывают по калибровочной кривой,

при построении которой на оси ординат отклады-

вают концентрацию белка (г/л). а на оси аб-

сцисс — оптическую плотность в единицах эк-

стинкции. По полученной концентрации рассчи-

тывают суточную потерю белка с мочой.

Обнаружение белка с помощью индикатор-

ной бумаги (полосок), которые выпускаются

фирмами «llachemi» (ЧССР), «Albuphan»,

«Ames» (Англия), «Albustix», «Boehringer»

(ФРГ), «Comburtest» и др.

П р и н ц и п основан на феномене так назы-

ваемой протеиновой ошибки некоторых кислот-

но-щелочных индикаторов. Индикаторная часть

бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим

и цитратным буфером. При увлажнении бумаги

буфер растворяется н обеспечивает соответству-

ющий, рН для реакции индикатора. При рН

3,0—3,5 аминогруппы белков реагируют с инди-

катором и меняют его первоначально желтую

окраску, на зеленовато-синюю, после чего, срав-

нивая с цветной шкалой, можно ориентировочно

оценить концентрацию, белка в исследуемой мо-

че. Основной предпосылкой правильной работы

индикаторных полосок является обеспечение рН

3,0—3,5 для протекания реакции. Если бумага

находится в. контакте с исследуемой мочой до-

льше экспозиции, указанной в инструкции, то

цитратный буфер, в, ней растворяется, и тогда

индикатор реагирует на истинный рН . мочи,

т. е. дает ложноположительную реакцию. В свя-

зи с тем, что емкость буфера ограничена, то

даже при соблюдении методических указаний

49

в пробах слишком щелочной мочи (рН>6,5)

получаются ложноположительные результаты,

а в пробах слишком кислой мочи (рН<3,0) —

ложноотрицательные. Число реагирующих ами-

ногрупп в составе отдельных белков различно,

поэтому альбумины реагируют в 2 раза интен-

сивнее, чем такое же количество у-глобулинов

(белок Бене-Джойса, парапротеины), и гораздо

интенсивнее, чем гликопротенды. Однако при

большом количестве слизи с высоким содержа-

нием гликопротеидов (воспаление мочевыводя-

щих путей) оседающие на индикаторной полоске

хлопья слизи могут давать ложноположитель-

ные результаты. Чувствительность отдельных

производственных серий индикаторной бумаги,

равно как и отдельных видов бумаги, выпускае-

мых одной и той же фирмой, может быть различ-

ной; поэтому к количественной оценке белка

этим методом следует относиться осторожно.

Определение суточной потери белков с мочой

при помощи индикаторной бумаги невозможно.

Таким образом, индикаторная бумага уступает

химическим пробам, в первую очередь пробе

с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает воз-

можность быстрого исследования серии образ-

нов.

Н о р м а л ь н о е  з н а ч е н и е . Небольшое

количество белка в суточной моче обнаружива-

ется и у вполне здоровых лиц, однако такие

небольшие концентрации не выявляют в разо-

вых порциях используемыми в настоящее время

методами. Приблизительно 70 % белков мочи

здорового человека приходится на долю урому-

коида — белка, являющегося продуктом почеч-

ной ткани; таким образом, доля гломерулярного

белка в моче здоровых людей является ничтож-

но малой. Большинство исследователей указы-

вают, что протеинурия в норме составляет 50—

150 мг/сут. Большинство белков мочи идентично

сывороточным.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Принято

различать следующие формы протеинурни в за-

висимости от места возникновения: пререналь-

ную, связанную с усиленным распадом белка

тканей,

:

 выраженным гемолизом; ренальную,

обусловленную патологией почек, которая мо-

жет быть разделена на клубочковую и канальце-

вую; постренальную, связанную с патологией

мочевыводящих путей и чаще всего обусловлен-

ную воспалительной экссудацией. В зависимо-

сти от длительности существования выделяют

постоянную протеинурию, существующую в те-

чение многих недель и даже лет, и преходящую,

прявляющуюся периодически, иногда даже при

отсутствии патологии почек, например при лихо-

радке и выраженной интоксикации. Целесооб-

разно различать вариабельность протеинурии:

при сутрчной, потере белка до 1 г — умеренную,

от 1 до 3 г — среднюю и более 3 г — выражен-

ную.

Обнаружение в моче белков с относительно

большой молекулярной массой свидетельствует

об отсутствии избирательности почечного филь-

тра и выраженном его поражении. В этих случа-

ях говорят о низкой селективности протеинурии.

Поэтому в настоящее время широкое распро-

странение получило определение белковых

50

фракций мочи. Наиболее точны методы электро-

фореза в крахмальном н полиакрнламидном

;

геле. По результатам, полученным этими мето-,

дами, можно судить о селективности протеину-,

рии.

Обнаружение в моче белка Беис-Джонса.

Исследование целесообразно проводить только:

при положительной пробе с сульфосалициловой

кислотой. Индикаторная бумага для обнаруже-

ния белка Бенс-Джонса непригодна.

П р и н ц и п основан на реакции термопре-

ципитации. Методы, с помощью которых оцени-

вают растворение белка Бенс-Джонса при тем-

пературе 100 °С или повторное осаждение при

последующем охлаждении, ненадежны, так как

далеко не все белковые тела Беис-Джонса обла-

дают соответствующими свойствами. Наиболее

достоверно выявление этого парапротеина осаж-

дением его при температуре 40—60 °С, но и в

этих условиях осаждение может не произойти

в слишком кислой (рН<3,0—3,5) или слишком

щелочной (рН>6,5) моче, при низкой относи-

тельной плотности мочи и при низкой концентра-

ции белка Бенс-Джонса. Наилучшие условия

осаждения обеспечивает методика, предложен-

ная Patnem.

Р е а к т и в . 2М ацетатный буфер рН 4,9.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Профильтрован-

ную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл

буфера и согревают 15 мин на водяной бане при

температуре 56 °С. При наличии белков Бенс-

Джонса уже в течение 2 мин появляется выра-

женный осадок, при концентрации белка Бенс-

Джонса менее 3 г/л проба может получиться

отрицательной, На практике это встречается

крайне редко, так как большей частью концен-

трация белка Бенс-Джонса в моче значитель-

ная.

С полной достоверностью белок Бенс-Джон-

са может быть обнаружен иммуноэлектрофоре-

тическим исследованием при использовании

специфических сывороток против тяжелых и лег-

ких цепей иммуноглобулинов.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Белок

Бенс-Джонса может выделяться с мочой при

миеломной болезни, макроглобулииемни Валь-

денстрема.

Л и т е р а т у р а . Михеева А. И., Богодаро-

ва И. А.— Лаб. дело, 1969, т. 7, с. 441; Рябов

С. И., Наточин Ю. В., Бондаренко Б. Б. Диагно-

стика болезней почек.— Л.:' Медицина, 1979,

с. 29—32; Kingsburry F. В., Clark С. P., Willi-

ams G., Post A.— J. Lab. Clin. Med., 1926, vol.

11, p. 981.

ГЛЮКОЗА. Унифицированный метод опре-

деления с помощью индикаторных полосок

(1972).  П р и н ц и п . Метод основан на специ-

фическом окислении глюкозы с помощью фер-

мента глюкозооксидазы; образовавшаяся при

этом перекись водорода разлагается пероксида-

зой н окисляет краситель. Изменение окраски

красителя при окислении свидетельствует о при-

сутствии глюкозы в моче.

Реактивная бумага «Глюкотест» представля-

ет собой полоски бумаги 0,5Х 5 см, имеющие

поперечную полосу светло-желтого цвета, про-