Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 8

оружейным глазом. Ее форма и положение

говорят о составе и концентрациях антигенов.

- Связывание меченых веществ также суще-

ствует во многих вариантах, оно составляет

основу метода конкурентного связывания, или

сатурационного анализа. В этом случае образо-

вание комплекса антиген — антитело проводят

так, чтобы в него включился весь исследуемый

антиген и еще некоторое количество меченого

соединения. Затем комплекс отделяют от непро-

реагировавших составных частей и по количе-

ству метки судят о содержании антигена.

Третий путь основан на том, что размер

молекулы комплекса значительно больше, чем

молекулы антитела или антигена, поэтому и фи-

зические свойства: растворимость, способность

рассеивать свет и флюоресцировать — иные.

Проще всего исследовать светорассеивание

(т. е., попросту говоря, помутнение раствора)

в результате выпадения осадка. Но чтобы оса-

док образовывался количественно, нужны спе-

циальные условия, которые долгое время были

неизвестны. Оказалось, что в присутствии кол-

лоидов свободный объем раствора, в котором

могут присутствовать белковые молекулы,

уменьшается и реакция антиген — антитело

идет значительно быстрее и с лучшим количе-

ственным выходом.

Методы преципитации в геле. Наиболее рас-

пространены четыре перечисленные ниже вари-

анта методов определения антигенов преципита-

цией в геле.

1. Радиальная иммунодиффузия по Манчи-

ни: в этом случае прозрачный гель в чашке

Петри пропитывается антителами, в нем выреза-

ют лунку, куда помещают исследуемый раствор:

Антиген диффундирует из лунки в гель, где

создается неравномерная концентрация — вы-

сокая по краям лунки, убывающая обратно

пропорционально квадрату расстояния от ее

краев. В том месте, где концентрация антигена

и антитела эквивалентны, образуется зона пре-

ципитации в виде кольца. Чем выше концентра-

ция антигена в лунке, тем больше радиус кольца.

2. Встречная или двойная, иммунодиффузия

по Оухтерлони отличается от радиальной тем,

что слой геля предварительно не пропитывается

антителами, а их раствор вносят в специальную

лунку, находящуюся по соседству с лункой анти-

гена. Оба вещества диффундируют одно на-

встречу другому, в результате чего создаются

градиенты концентраций, и антител, и антигена.

В простейшем случае зона преципитации имеет

форму прямой линии, которая проходит между

лунками антигена и антител. Но если лунок не

две, а больше (например, одна лунка антител,

вокруг которой несколько лунок с разными раз-

ведениями испытуемого раствора, или же одна

лунка со смесью антител, вокруг которой не-

сколько лунок с идентичными или неидентичны-

ми антигенами), образуются довольно сложные

фигуры. По ним можно судить не только о коли-

честве, но и о структуре исследуемых веществ,

3. Ракетный электрофорез, который называ-

ют-также электроиммуноопределением, основан

на том же принципе, что и радиальная иммуно-

диффузия, т. е. пластинка геля предварительно

Рис. 3. Образование преципитата при иммуно-

химических реакциях. На оси ординат — коли-

чество осадка комплекса антиген—антитело;

на оси абсцисс — отношение количеств анти-

ген—антитело в условных единицах.

I — зона избытка антитела; 11 — зона избытка анти-

гена.

пропитывается антителами и в луику вносят

исследуемую жидкость. Однако в данном вари-

анте антиген перемещается в гель не в результа-

те простой диффузии, а под влиянием нало-

женного электрического поля, т. е. так же, как

при электрофорезе. Благодаря этому образова-

ние преципитата идет значительно быстрее, зона

преципитации имеет характерную форму за-

остренных языков, отдаленно напоминающих

контуры космических ракет на старте (отсюда

и название: по-английски ракета «rocet»). Рас-

стояние от лунки до верхушки зоны примерно

пропорционально концентрации антигена.

4. Классический иммуноэлектрофорез по

Грабарю или Вильямсу дает наиболее разверну-

тую картину антигенного состава исследуемой

жидкости. В этом случае исследуемую жидкость,

например сыворотку крови, подвергают обычно-

му электрофорезу в геле, при этом белки выстра-

иваются в линию соответственно своей электро-

форетической подвижности. После этого прово-

дят встречную иммунодиффузию в поперечном

направлений против поливалентной иммунной

сыворотки, в результате образуется сложная

система дуг преципитации.

Метод конкурентного связывания (сатураци-

онный анализ). Суть метода конкурентного свя-

зывания заключается в том, что некоторые

вещества — лиганды — способны весьма изби-

рательно связываться с исследуемым соединени-

ем, при этом нет различия между веществом

биологического происхождения (анализируе-

мым) и его меченым аналогом, добавленным

извне. Они конкурируют за лиганд, который

должен быть добавлен в таком количестве, что-

бы его связывающая способность полностью

насытилась (отсюда и название "сатурацион-

ный» — насыщающий анализ). Очевидно, что
чем больше в пробе определяемого вещества,

тем меньше связывается меченое вещество. По-

сле этого отделяют комплекс от свободных ин-

гредиентов и подсчитывают количество метки —

в одних вариантах в комплексе, в других не

связанного с комплексом.

31

. Особенность метода конкурентного связыва-

ния заключается в том, что используют лиганды

исключительно биологического происхождения;

меченое соединение обычно получают из при-

родного, присоединяя к нему метку в виде

отдельного атома или химической группировки.

Как следует из краткого описания принципа,

метод конкурентного связывания имеет два неу-

добства: во-первых, это нелинейная зависимость

между результатом непосредственного измере-

ния, т. е, количеством меченого соединения, и ис-

следуемым параметром, т. е. содержанием опре-

деляемого вещества; во-вторых, это многоэтап-

ность анализа. Оба обстоятельства сказываются
на точности определения, причем особенно важ-

но помнить, что в силу нелинейности хорошие

результаты получаются лишь в определенном

диапазоне концентраций исследуемого веще-

ства, поэтому обычно рекомендуют каждую про-

бу исследовать два или даже три раза (в дупле-

тах или триплетах), отбрасывая результаты,

которые находятся вне нужного диапазона. Од-

нако эти недостатки компенсируются необыкно-

венно высокой чувствительностью и избиратель-

ностью метода, широкое внедрение которого

вызвало переворот в традиционных методах кли-
нической биохимии.

По своему принципу метод конкурентного

связывания примыкает к классическим иммуно-

логическим методам, основанным на реакции

связывания комплемента, однако количество

комплемента может быть определено лишь полу-

количественно. Кроме того, для этого метода

необходимы определенным образом обработан-

ные эритроциты (или другие заменяющие их

частицы), в то время как реактивы, используе-

мые для сатурационного анализа, значительно

легче стандартизуются и более устойчивы. Одна-

ко приготовление их настолько сложно, что

недоступно практическим лабораториям, поэто-

му в условиях клинико-диагностических лабора-

торий метод конкурентного связывания может

быть выполнен лишь с помощью промышленно

изготовленных готовых наборов реактивов, так

называемых китов (от английского слова kit,

означающего набор инструментов или команду).

В клинической биохимии и иммунологии

метод конкурентного связывания шире всего

используется для определения трех групп ве-

ществ: 1) гормонов—как белковой природы,

так и небелковых; 2) индивидуальных белков —

как нормально присутствующих (альбумин,

макроглобулин и т. д.), так и появляющихся

в условиях патологии (антитела к микробам

и вирусам и белки инфекционных агентов);

3) лекарственных соединений и вредных веществ

из окружающей среды, что относится к сфере

фармакодинамики и токсикологии.

В качестве лигандов используются три

группы веществ биологического происхождения:

1) антитела; 2) специфические транспортные

белки плазмы крови; 3) рецепторные белки орга-

нов-мишеней. Наибольшее значение имеет ис-

пользование антител, полученных путем имму-

низации. Сатурационный анализ стал возможен

лишь после того, как были разработаны весьма

совершенные способы иммунизации, в том числе

низкомолекулярными веществами, позволяю-

щие получать антисыворотки с высокими титра-

ми специфических антител. В этой связи следует

упомянуть также о способе получения моноспе-

цифических клоновых антител, которые выра-

батываются не в целом организме, а в тканевых

культурах, в которых растут клетки, в больших

количествах продуцирующие только нужные им-

муноглобулины (обладающие свойствами ка-

ких-либо антител). Такие культуры получают

путем гибридизации лимфоидных клеток имму-

низированного животного со злокачественными

клетками, обладающими свойствами неограни-

ченно расти в тканевых культурах. Затем отби-

раются (клонируются) клетки, обладающие

нужными качествами, т. е. способностью проду-

цировать требуемые антитела и неограниченным

ростом в культуре.

Транспортные белки крови обычно использу

ются в качестве лигандов при определении сте-

роидных гормонов, в частности глюкокортикои-

дов. Транскортин удобен как лиганд потому, что

он необязательно должен быть использован в

чистом виде (реактивом может быть лишь незна-

чительно обогащенная фракция или даже сыво-
ротка) и не обладает видовой специфичностью,

поэтому пригодны сыворотки различных лабора-

торных и домашних животных. Недостаток ис-

пользования транспортных белков состоит в том,

что они не очень специфичны и, как правило, не

позволяют дифференцировать гормоны от их

непосредственных метаболитов (например, кор-

тизол, кортизон и гидрокортизол).

Третий источник лнгандов — белки из орга-

нов-мишеней — шире всего используется для

определения эстрогенов. В целом они обладают

свойствами, аналогичными транспортным бел-

кам крови, но их извлекают путем соответствую-

щей обработки из органов лабораторных жи-

вотных, чувствительных к эстрогенам, например

из матки крыс.

Чтобы получить меченое соединение, обычно

используют чистый препарат определяемого ве-

щества, полученный из биологического источни-

ка или синтетическим путем. Белковые вещества

удобно метить, вводя в их состав радиоактивный

йод — обычно изотоп

 |25

 I; для этого препарат

инкубируют с радиоактивным индикатором в

присутствии окислителя, а затем очищают от

побочных продуктов. Низкомолекулярные веще-

ства метят тритием путем неспецифического

изотопного обмена. Использование радиоактив-

ных меченых соединений связано с теми неудоб-

ствами, что для работы с ними необходима

специально оборудованная лаборатория, поэто-

му все большее распространение приобретают

такие варианты метода конкурентного связыва-

ния, в которых исследуемое вещество метится

ферментом. Таким способом можно пометить

лишь относительно крупные молекулы, так как

образовавшаяся химическая связь не должна

затрагивать функционально важные группы

ни в молекуле меченого соединения, ни в фер-

менте

Очень важная техническая проблема — от-

деление связанных с лигандом меченого и неме-

ченого соединений от их свободных форм. Для

32

решения этой задачи применяются самые разно-

образные приемы, причем может удаляться сво-

бодная форма и подсчитываться количество

связанной формы, а может быть и наоборот —

удаляться связанная форма и определяться

количество свободной формы. Однако во всех

случаях для разделения используется суще-

ственное различие в молекулярной массе ком-

плекса и свободных форм определяемого веще-

ства. Более крупные молекулы комплекса можно

отделить гель-фильтрацией или электрофорезом,

а также осаждая их полиэтилеигликолем. Воз-

можен такой вариант анализа, когда лиганд

заранее адсорбирован на твердой фазе — бром-

ацетил целлюлозе, полиэтилене н т. д., поэтому

комплекс легко отделяется от находящихся в

растворе свободных форм определяемого веще-

ства. Используется также так называемый ме-

тод двойных антител, когда комплекс лиганд —

определяемое вещество осаждается (преципити-

руется) после добавления антител против белка

самого лиганда. Свободные формы можно уда-

лить также, адсорбировав их на специфических

сорбентах, которые не связывают комплекс ли-

ганда и определяемого вещества, например на

целлюлозе, амберлнте, силикагеле, активиро-

ванном угле. Особенно широкое распростране-

ние при определении низкомолекулярных гормо-

нов получило использование активированного

угля, покрытого декстраном, тонкий слой кото-

рого пропускает лишь молекулу гормона, кото-

рая поэтому адсорбируется на угле, а высокомо-

лекулярный комплекс остается в растворе. Та-

кой прием получил название мгновенного

диализа.

Определение при помощи энзима, связанного

с иммуносорбентом. Определение «при помощи

энзима, связанного с иммуносорбентом (сокра-

щенно ЭЛИСА — заглавные буквы английских

слов — Enzyme Linked Immunosorbent Assay),

представляет собой дальнейшее развитие мето-

да двойных антител, используемого в сатурацн-

онном анализе, но здесь отсутствует конкурен-

ция между определяемым природным соедине-

нием и его меченым вариантом. Суть метода

заключается в том, что образуется нечто вроде

слоеного пирога, причем определяемое веще-

ство составляет один из его внутренних слоев,

а индикаторный фермент — самый внешний; об-

щий размер всей структуры зависит от количе-

ства определяемого вещества. Рассмотрим фун-

кционирование этого метода на примере набора

для определения альбумина в моче (рис. 4).

Определение выполняют в лунках (гнездах),

стенки которых изготовлены из специального син-

тетического материала, эффективно адсорбиру-

ющего антитела,— полистирена. Сначала в них

вносят так называемые первичные антитела, в

данном случае кроличьи антитела против чело-

веческого альбумина, затем после их адсорбции

на стенках и отмывания избытка вносят исследу-

емую пробу. Содержащиеся в ней молекулы

альбумина через посредство первичных антител

оказываются фиксированными на стенках лун-

ки. Затем добавляют вторичные антитела: в дан-

ном случае источником их служит сыворотка

морской свинки, иммунизированной против че-

Рис. 4. Комплекс, образующийся при одном из

вариантов определения сывороточного альбу-

мина с помощью связанного с иммуносорбентом

энзима (схема).

АЛБ — сывороточный альбумин человека (опреде-

ляемое вещество); римскими цифрами обозначены

компоненты аналитической системы: I — полистн-

реновая стенка лунки ммкротнтратора; II — первич-

ные антитела (из сыворотки кролика, иммунизиро-

ванного против сывороточного альбумина человека);

III—вторичные антитела (из сыворотки морской

свинки, иммунизированной против сывороточного

альбумина человека); IV — пероксидаза из хрена,

фиксированная на кроличьих антителах против

иммуноглобулинов морской свинки.

ловеческого альбумина; они фиксируются на тех

же альбуминовых молекулах, которые другими

группами адсорбированы на первичных антите-

лах. Четвертый слой иммунного «пирога» —

фермент пероксидаза, фиксированная на кро-

личьих антителах против иммуноглобулинов

морской свинки; они связываются со вторичны-

ми антителами, при этом количество фиксиро-

ванной пероксидазы оказывается пропорцио-

нальным содержанию альбумина в исследуемой

пробе. После добавления каждого реагента и за-

вершения реакции связывания избыток непроре-

агировавших белков тщательно удаляют отмы-

ванием буферным раствором, кроме того, до-

бавляют инактивированные Сыворотки для

подавления неспецифических реакций. После

окончания всех адсорбции н отмываний прово-

дят ферментативную реакцию, для чего в лунку

добавляют о-фениленднамин и перекись водоро-

да. Благодаря присутствующей пероксндазе

о-фенилендиамин окисляется, и через некоторое

время интенсивность окраски измеряется фото-

метрией.

Для иммуноферментных исследований не

только в методе ЭЛИСА, но н в других его вари-

антах чаще всего используется пероксидаза, так

как этот фермент с небольшой молекулярной

массой, который легко определять, но находят

применение и другие энзимы, например щелоч-

2 п/р В. В. Меньшикова

33

Ряс. 5. Угловое распределение света, рассеян-

ного частицами разного размера.

А — размер частицы меньше, чем 1/10 длины волны

света; Б — размер частицы больше, чем 1/10 длины

волны света, но меньше длины волны света; В — раз-

мер частицы больше, чем длина волны света.

ная фосфатаза. Вместо фенилендиамина иногда

используют другие хромогенные субстраты или

образование молекулярного йода из его солей

под влиянием перекиси водорода.

Метод ЭЛИСА очень чувствителен и высо-

коспецифичен; в отличие от радиоиммунных

методов он не требует специальных условий.

Многочисленные адсорбции и отмывания, кото-

рые проводятся по ходу определения, занимают

5—6 ч, требуя постоянного внимания работника.

Поэтому для выполнения анализа изготовляют-

ся специальные приборы, в которых эти опера-

ции механизированы или даже автоматизирова-

ны. Результаты во многом зависят от качества

материала, использованного для приготовления

лунок микротитратора. В результате многосту-

пенчатости анализа зависимость между содер-

жанием исследуемого вещества в пробе и окра-

ской, которая развивается в результате фермен-

тативной реакции, обычно нелинейная.

34

Исследование светорассеивання. В обычных

условиях осадок комплекса антиген-антитело

образуется медленно, ему препятствует как из-

быток антител, так и антигена. Это затруднение

удается в значительной степени преодолеть, если

реакция проходит в растворе коллоида, обычна

полиэтиленгликоля. Его большие молекулы, за-

нимая значительный объем раствора, вытесняют

оттуда молекулы белков, относительная концен-

трация которых в свободном пространстве повы-

шается, а взаимодействие ускоряется. В резуль-

тате область, в которой имеется достоверная

зависимость между количеством добавленного

антигена и размером осадка (преципитатом),

значительно расширяется и ход реакции ускоря-

ется. Поэтому, проводя иммунохнмнческую ре-

акцию в растворе полиэтиленгликоля, удается

определять содержание антигена по светорассе-

иванию (мутности) пробы уже через несколько

минут после добавления антител. Чаще всего

измерения проводят по конечной точке, когда

реакция уже остановилась и светорассеивание

больше не увеличивается, но существует и дру-

гой вариант пробы, когда измеряется скорость

нарастания мутности.

Классическая теория светорассеивання, раз-

работанная Релеем, рассматривает случай,

когда размер рассеивающей частицы мал по

сравнению с длиной волны, составляя '/

10

 ее или

меньше. Для фиолетового света с длиной волны

400 им это составляет 40 нм, а для красного

света с длиной волны 700 нм размер релеевской

частицы не должен превышать 70 нм. Для срав-

нения заметим, что наибольший диаметр моле-

кулы альбумина 8 нм, IgG — 20 нм, а длина

молекулы фибриногена (которая имеет форму

нити) — около 50 нм.

Интенсивность релеевского светорассеива-

ния зависит от длины волны света и угла, под

которым измеряется рассеянный свет по отноше-

нию к падающему: оно обратно пропорциональ-

но четвертой степени длины волны, когда вперед

и назад попадает немного больше света, чем

в бок, но диаграмма симметрична (рис. 5). Если

же размер частиц больше 1/10 длины волны,

рассеивание света становится несимметричным,

т. е. вперед по отношению к лучу падающего

света его интенсивность заметно больше, чем

в задней полусфере. Характер этого распределе-

ния также зависит от размера частиц (см. рис.

5). В ряде случаев оказывается выгодным изме-

рять свет рассеянный не под углом 90 ° к падаю-

щему лучу, а под меньшими углами, что значи-

тельно повышает чувствительность.

Судить о мутности раствора можно двумя

способами: по количеству рассеянного света и По

количеству прошедшего; первый способ называ-

ется нефелометрией, второй — турбиднметрией.

Нефелометрия точнее и надежнее, так как фон,

т. е. показания прибора, когда он заполнен про-

зрачным раствором, очень мал и даже неболь-

шое количество взвешенных частиц приводит

к заметному возрастанию сигнала, который в

широких пределах пропорционален размеру

осадка. Если же измерение проводят в турбидит

метрическом варианте, то количество преципи-

тата должно быть таким, чтобы рассеялось не