Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 7

В литературе имеется много описаний раз-

личных микросистем, в которых повышение чув-

ствительности фотометрии достигается путем

использования узких и длинных кювет и значи-

тельного сокращения объема фотометрируемого

раствора. Но надо иметь в виду, что если объем

раствора меньше 0,5 мл, точность отмеривания

падает, возрастают ошибки в результате испаре-

ния растворов в ходе анализа и т. д., поэтому

надо принимать специальные меры предосто-

рожности. Опыт работы показывает, что опти-

мальными в смысле чувствительности, точности

и удобства работы оказываются объемы 0,5—

1 мл при длине оптического пути кюветы

I см. Эти параметры и реализованы в большин-

стве современных прецизионных приборов.

Точность фотометрии значительно возраста-

ет, если нет необходимости каждый раз выни-

мать кювету для заполнения ее новой порцией

исследуемого раствора. Существуют различные

конструкции проточных кювет, из которых ис-

следуемый раствор отсасывают после окончания

измерения и заполняют кювету новой порцией,

не вынимая ее из гнезда прибора. Выполнять

серийные анализы на таких приборах проще

и быстрее, чем при использовании съемных кю-

вет. Но надо помнить, что количество раство-

ра должно быть достаточным, чтобы промыть

кювету.

Фотометрические приборы делятся на две

большие группы: фотометры и спектрофотомет-

ры. В фотометрах нужные спектральные диапа-

зоны выделяются при помощи светофильтров,

поэтому число участков спектра, в котором мо-

жет проводиться измерение, равно числу свето-

фильтров. В спектрофотометре участки спектра

выделяются при помощи призм или дифракци-

онных решеток, поэтому можно установить лю-
бую длину волны в заданном диапазоне. Обычно

спектрофотометры — это приборы более высоко-

го класса, чем фотометры, в них можно выделить

более узкий (более монохроматический) участок

спектра, однако все зависит от конкретной кон-

струкции прибора. Так, например, спектрофото-

метр «Спекол» фирмы «Цейс» (ГДР) хотя и по-

зволяет делать измерения на любой длине волны

в диапазоне от 400 до 700 нм, но имеет настолько

слабый монохроматор, что более узкие области

выделять труднее, чем на хорошем фильтровом

фотометре.

Чаще всего в клинической биохимии фото-

метрия проводится в области 400—700 нм — это

Так называемая видимая область спектра. Свет

с большей длиной волны относится к ближней

инфракрасной области, измерения в которой

приходится делать чрезвычайно редко. Свет с

длиной волны короче 400 нм относится к ультра-

фиолетовому диапазону, причем различают

ближнюю область с длиной волны 300—400 нм

и коротковолновый диапазон 220—300 нм. Осо-

бенно широко распространено определение вос-

становленного NADH и NADPH по поглощению

света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем

ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометри-

ческих измерений в видимой и ближней инфрак-

расной области пригодны кюветы из обычного

стекла; для ближней ультрафиолетовой области

нужны кюветы из специальных сортов стекла —

так называемые увиолевые; в коротковолновой

ультрафиолетовой области пригодны только кю-

веты из кварца и сапфира. По внешнему виду

они плохо различимы, поэтому узнать, из какого

материала изготовлена кювета, можно только

после определения диапазона длин волн, кото-

рые она пропускает. .При получении новых пар-

тий кювет, или если их почему-либо перепута-

ли, надо измерить оптические плотности кювет,

заполненных водой, по отношению к пустому

кюветодержателю через каждые 20 им, начиная

от 400 нм, в сторону коротких волн до конца

шкалы прибора. Практически можно работать

на данной длине волны, если оптическая плот-

ность кюветы не более 0,2—0,3. В связи с тем что

кюветы из кварца или сапфира очень дороги,

надо стремиться работать в видимой области

только со стеклянными кюветами, а в ближней

ультрафиолетовой области — только с увиоле-

выми.

Последовательность операций при работе на

спектрофотометрах или фотометрах различных

конструкций несколько различается, но принцип

остается одним. Сначала устанавливают длину

волны, выбирая светофильтр на фотометре или

вращая соответствующую рукоятку на спектро-

фотометре. Чтобы точно и правильно установить

длину волны, надо идти от меньших длин к боль-

шим, так как прн движении в обратном на-

правлении ошибка возрастает. Следующий этап

измерения — установка нуля, т. е. определение

величины Iо в формуле

1

. Для этого в кювето-

держателе устанавливают кювету, заполненную

растворителем или раствором, полученным в ре-

зультате холостого опыта; изменяя ширину ще-

ли, добиваются того, чтобы показания прибора

соответствовали величине, предусмотренной ин-

струкцией (обычно это нуль), после чего холо-

стую пробу заменяют опытной и производят

отсчет величины оптической плотности.

Щелью спектрофотометра выделяется опре-

деленный интервал длин волн: чем шире щель,

тем шире и спектральный интервал. Если изме-

рение делается в той области, где чувствитель-

ность прибора или прозрачность кювет мала,

чтобы вывести прибор на нуль, необходимо уве-

личить ширину щели. Это чревато возможно-

стью такой ошибки, когда свет проходит с длина-

ми волн, соседними с выбранной. Если исследуе-

мый объект для них прозрачен, то результаты

измерений оказываются ошибочными, так как

фактически регистрируется сила света не на

избранной длине волны, а на соседней.

Чтобы уменьшить ошибки, вызванные при-

сутствием в растворе посторонних окрашенных

веществ или его мутностью, используют двух-

или трехволновые методы измерений. Сущность

трехволнового метода видна на рис. 2; оптиче-

скую плотность измеряют при трех длинах волн;

на месте максимума пропускания и на равном

расстоянии от него в сторону длинных и корот-

ких волн. При этом предполагается, что рассеи

1

 См. с. 26.

27

Рис. 2. Введение поправки на неспецифическое
поглощение (трехволновый метод). На оси

ордииат — величины светопоглощения (Е); на

оси абсцисс — длина волны света.

— величина светопоглощения. характеризую-

щая количество определяемого вещества; Е1, Е

2

,

Ез— светопоглошение при волнах разной длины.

ванне света или неспецифическая окраска рав-
номерно изменяется с изменением длины волны,
поэтому истинную оптическую плотность вычис-

ляют по формуле:

1.6.2. Флюорометрия

Эффект флюоресценции заключается в том,

что исследуемый объект светится под влиянием
облучения светом с более короткой длиной во-

лны. Излучаемый свет называется светом флюо-

ресценции, или вторичным излучением; тот свет,

которым объект облучается, называется светом
возбуждения флюоресценции, или первичным.

Форма спектра флюоресценции обычно зеркаль-

но отображает форму спектра возбуждения, при
этом спектр возбуждения флюоресценции бли-

зок к спектру поглощения раствора и поэтому

характерен для данного флюорофора, в то время

как спектр флюоресценции малоспецифичен.
Аналитические методы, использующие флюорес-

ценцию, основаны на предположении, что при

освещении светом одинаковой интенсивности си-

ла света флюоресценции пропорциональна со-
держанию исследуемого вещества. Однако та-
кая пропорциональность имеется только в отно-

сительно узком диапазоне концентраций, из

которого на практике очень легко выйти, поэто-
му при налаживании флюорометрических иссле-

дований надо всегда с особой тщательностью

проверять линейность калибровочного графика

во всем диапазоне возможных величин. Наруше-

ние линейности бывает вызвано в первую оче-

редь явлением гашения флюоресценции, которое

обусловлено тем, что по мере углубления пучка
возбуждающего света в раствор интенсивность

его уменьшается вследствие поглощения. Чем
концентрированнее раствор, тем поглощение это

больше, поэтому сила возбуждающего света
оказывается также уменьшенной. Отсюда общее

правило, что флюорометрни должны подвер-

гаться относительно разбавленные растворы.

При флюорометрии длина волны вторичного

излучения обычно устанавливается на максиму-

ме интенсивности, так как это излучение ма-

лоспецифично, в то время как длина волны

первичного света (возбуждения флюоресцен-
ции) должна приходиться на наиболее специ-

фичный для исследуемого вещества участок

спектра, который необязательно совпадает с

максимумом (мешающие вещества могут быть
причиной ложного максимума).

Физический эффект флюоресценции заклю-

чается в том, что молекула исследуемого веще-

ства поглощает квант света возбуждения и при
этом переходит в новое, энергетически более

богатое состояние; через некоторый микропро-

межуток времени она излучает избыточную

энергию в виде кванта света флюоресценции

(эмиссии). В связи с тем что энергия кванта

света обратно пропорциональна длине волны,

длина волны возбуждающего света всегда коро-
че излучаемого. Промежуток времени между

поглощением света и его излучением очень мал,

и в обычных флюоресцентных методах на него не
обращают внимания, но он достаточен, чтобы на

молекулярном уровне успели произойти некото-

рые события, в частности, чтобы молекула могла
изменить свое положение в пространстве. На

этом основан метод молекулярной вискозимет-

рии путем измерения поляризации света флюо-
ресценции.

1.6.3. Пламенная фотометрия

и атомная абсорбцнометрия

Соли металлов, попадая в пламя, способны

окрашивать его. Это происходит потому, что при

высокой температуре пламени молекулы распа-

даются на отдельные ионы, электроны которых
непрерывно переходят из одного квантового со-

стояния в другое, что сопряжено с испусканием

или поглощением кванта света. Минимальная

температура, необходимая для того, чтобы эти
процессы проходили достаточно интенсивно, за-

висит от природы исследуемого элемента и в

меньшей степени от того, в состав какого соеди-
нения в растворе оно входит. Некоторые эле-

менты, например калий и натрий, начинают

интенсивно излучать свет, попадая в сравни-

тельно низкотемпературное пламя, которое по-
лучается при сгорании метана в воздухе (так

называемое метаново-воздушное пламя); дру-

гие же, как, например, кальций, начинают интен-

сивно излучать свет и поглощать его лишь при

значительно более высокой температуре, кото-

рая создается при сгорании ацетилена. При

сгорании метана (т. е. бытового газа) на возду-

хе можво определять кальций лишь после его
предварительного выделения, но методика эта

сложна, ненадежна и практически не использу-

ется.

Метод, в котором изучается окраска пламе-

ни, т. е. излучение, возникающее в результате

перехода атома из энергетически более высокого

28

состояния в низкое, называется пламенной фото-

метрией. Можно изучать и обратный процесс,

т. е. измерять поглощение света при переходе

атома с более низкого на более высокий энерге-

тический уровень; этот метод называется атом-

ной абсорбциометрией.

Аппаратура, необходимая для пламенной

фотометрии, относительно проста и дешева, но

метод оправдывает себя лишь при исследовании

наиболее легковозбудимых щелочных элемен-

тов — лития, натрия, калия, так как можно

работать с легкодоступным низкотемператур-

ным пламенем, которое образуется при сгорании

бытового газа. Химические методы определения

этих элементов сложны и неточны, поэтому ка-

лин и натрий определяют в клинических лабора-

ториях практически только путем фотометрии

пламени.

При атомной абсорбциометрии исследуемый

образец вносят в пламя, в результате чего оно

начинает поглощать свет с длиной волны, ха-

рактерной для данного элемента. Особенность

этого процесса состоит в том, что поглощается

очень узкая полоса света, измеряемая долями

нанометра, поэтому для измерения поглощения

необходим соответствующий линейчатый источ-

ник света. В качестве такого источника служит

специальная лампа, внутри баллона которой

находятся разогретые пары того самого элемен-

та, концентрация которого определяется. Благо-

даря этому источник света излучает только тот

свет, поглощение которого должно быть иссле-

довано; этим достигается очень высокая избира-

тельность физического эффекта и специфич-

ность метода, однако для каждого исследуемого

элемента должна быть специальная лампа, из-

лучающая нужные линии спектра. Поэтому при-

боры для атомного абсорбционного анализа

выпускаются с набором ламп, число которых

равно числу элементов, которые можно опреде-

лять на данном приборе.

В некоторых приборах используется обычная

газовая горелка, в пламя которой распыляется

раствор, содержащий исследуемый элемент. Ре-

же для получения раскаленных паров исследуе-

мого вещества используется специальная графи-

товая камера, стенки которой нагреваются элек-

тричеством, а во внутреннее пространство

распыляется раствор исследуемого образца. Та-

кая система сложнее, чем обычная горелка, но

позволяет изменять температуру поглощающих

свет паров исследуемого элемента. Необходи-

мость устанавливать для каждого исследуемого

элемента свой источник освещения конструктив-

но осложняет прибор, так как путем простого

поворота головки можно менять 3—4 лампы,

а если число измеряемых элементов достигает

15—20, каждую лампу приходится отдельно

устанавливать и юстировать. Атомные абсорб-

циометры — значительно более дорогие прибо-

ры по сравнению с пламенными фотометрами.

Многие элементы, которые определяются с их

помощью, могут быть определены и посредством

обычных цветных реакций, хотя и с большей

затратой труда и часто менее точно, поэтому

атомная абсорбциометрия оказывается методом

выбора.

Как при фотометрии пламени, так и при

атомной абсорбции важнейшим этапом анализа

является распыление исследуемого раствора и

введение его в пламя горелки. Для этого исполь-

зуют различные эжекторы из стекла или металла

(аналогичные пульверизаторам), в которых

струя воздуха засасывает через узкую трубку

исследуемый раствор и распыляет его в неболь-

шом объеме, через который проходит струя

воздуха (или кислородно-воздушной смеси),

предназначенная для поддержания горения.

При этом в пламя попадает только очень неболь-

шая часть распыленного раствора, а остальной

раствор стекает на дно распылителя. Интенсив-

ность распыления, а следовательно, и количе-

ство вещества, поступающего в пламя, зависят

не только от условий работы эжектора — его

регулировки и давления воздуха, которое, ко-

нечно, должно тщательно регулироваться и под-

держиваться постоянным на протяжении всего

измерения, но и от вязкости раствора. Возбуж-

дение атомов в пламени в известной мере зави-

сит от природы молекулы, в .которую входит

исследуемый элемент, а также от присутствия

в пламени других элементов, т. е. фона. Поэтому

все условия проведения анализа должны тща-

тельно соблюдаться; при исследовании сыво-

ротки крови или других богатых белком жидко-

стей разведение должно быть всегда одним и тем

же. Не следует думать, что если имеется пропор-

циональность между концентрацией калиброво-

чного раствора и показаниями прибора, то такая

же пропорциональность сохранится и при раз-

личных разведениях сыворотки, поскольку при

разведении сыворотки изменяются также вяз-

кость раствора, а значит, и условия распыления.

В составе пламенного фотометра обязатель-

но имеется блок, обеспечивающий подачу возду-

ха (или, реже, кислородно-воздушной смеси)

при постоянном давлении, которое регулируется

в пределах 2—4 атм, а также горючего газа при

давлении, измеряемом сантиметрами ртутного

столба. Воздух подается в распылитель, оттуда

в смеситель и в горелку. Свет, излучаемый го-

релкой, через систему зеркал, линз и светофиль-

тров попадает на один или два фотоэлемента,

ток которых измеряется прибором. Устройство

прибора обязательно предусматривает возмож-

ность визуального контроля пламени и его юсти-

ровки. При налаживании прибора и включении

его надо сначала создавать давление воздуха,

а потом уже включать газ и зажигать пламя, так

как в противном случае газ может проникнуть

через смеситель в распылитель, где образуется

взрывоопасная газовоздушная смесь. В прибо-

ре также обязательно имеется отстойник, в кото-

рый стекает жидкость, оседающая на дно распы-

лителя во время работы. Давление воздуха

в отстойнике во время работы всегда несколько

выше атмосферного, поэтому жидкость оттуда

удаляется через водяной запор. Во время рабо-

ты пространство внутри отстойника не должно

непосредственно сообщаться с атмосферным

воздухом, иначе давление там упадет и из го-

релки может засосаться взрывоопасная смесь.

Помимо этих блоков, обязательных для всех

приборов, некоторые могут быть снабжены раз-

29

личными дополнительными сервисными устрой-

ствами: электрическим поджигателем газовой

горелки, автоматическим разбавителем проб,

устройством, печатающим результаты, и т, д.

Существует несколько возможных схем ра-

боты на пламенном фотометре. В самом простом

случае, который обычно и практикуется при

исследовании мочи или плазмы крови, исследуе-

мый материал разводят водой в 50 или 100 раз,

свет, образующийся при его сжигании в пламе-

ни, проходит через светофильтр и попадает на

фотоэлемент, интенсивность тока которого реги-

стрируется. В связи с тем что иногда бывает

трудно достаточно хорошо выделить нужную

спектральную линию, используют также так на-

зываемый компенсационный метод, когда с по-

мощью зеркал и линз формируется два пучка

света: один проходит через светофильтр, выде-

ляющий характерную для исследуемого элемен-

та линию спектра, а второй — линию того эле-

мента, который создает помехи, затем из показа-

теля первого фототока вычитают второй.

Можно также использовать метод внутрен-

него стандарта, когда исследуемую биологиче-

скую жидкость разводят не водой, а слабым

раствором элемента, которого нет в биологиче-

ском материале, чаще для этого используют

соли лития. В процессе анализа делают два

измерения: со светофильтром, пропускающим

излучение измеряемого элемента, и со свето-

фильтром, пропускающим излучение внутренне-

го стандарта; если показания внутреннего стан-

дарта отличаются от того, что было при ка-

либровке, то вносят соответствующую поправку

и в измеряемый ток. Такой порядок работы

позволяет избежать ошибок, связанных с не-

стандартными условиями распыления; это быва-

ет важно в том случае, когда исследуются

жидкости, вязкость которых может значительно

колебаться (слюна, желудочный сок и т. д.).

Чтобы создать одинаковые условия возбуж-

дения исследуемого элемента при анализе проб,

в которых содержание других составных частей

значительно колеблется, используют также раз-

ведение исследуемых проб так называемым фо-

ном, т. е. раствором, содержащим такие количе-

ства элемента, определенным образом влияюще-

го на интенсивность свечения исследуемого

элемента, чтобы возможные колебания состава

посторонних веществ в пробе уже не сказыва-

лись.

В клинической лабораторной практике метод

внутреннего стандарта и разведения проб «фо-

ном», как правило, не используется; компенса-

ционный метод измерения используется только

в том случае, если это предусмотрено конструк-

цией прибора. Для того чтобы анализы сыво-

ротки крови и мочи были выполнены с необходи-

мой точностью, практически достаточно пра-

вильно приготовить комплексный калибровоч-

ный раствор, который одновременно содержит

и калий, и натрий в концентрациях, близких

к тем, которые бывают в исследуемом материа-

ле. Однако в моче и плазме крови соотношение

этих элементов различное, поэтому калибровоч-

ный график для мочи не может быть использо-

ван для сыворотки и наоборот.

Как уже отмечалось, в то время как опреде-

ление калия и натрия методом пламенной фото-

метрии является обязательным анализом для

всех крупных лабораторий, определение других

металлов: кальция, магния, железа и т. д.—

может быть выполнено как обычными химиче-

скими методами, так и посредством атомно-

абсорбционного анализа, который тем самым

является методом выбора и сравнительно мало

используется в клинических лабораториях.

Здесь надо иметь в виду еще и то обстоятель-

ство, что в биологических жидкостях такие

элементы, как кальций и магний, лишь частично

находятся в биологически активном ионизиро-

ванном состоянии, а атомно-абсорбционный

анализ позволяет определять лишь общее их

содержание. Однако при определении микроэле-

ментов: меди, марганца, цинка, а также токсиче-

ских веществ, особенно ртути, преимущества

атомно-абсорбционного анализа проявляются в

полной мере. Особенно удобны те варианты ме-

тода, в которых применяется беспламенная ато-

мизация, так как выпаривание пробы, ее озоле-

ние и перевод в парообразное состояние про-

исходят в одном и том же устройстве. При

определении веществ, которые находятся в био-

логическом материале в ультрамикроколиче-

ствах, чувствительность метода иногда оказыва-

ется недостаточной, в этих случаях применяют

концентрирование путем образования комплек-

сных соединений с пирролидондитиокарбоматом

аммония (ПДКА), которые экстрагируют мети-

лизобутилкетоном (МИБК).

1.6.4. Иммунохимические методы

При взаимодействии антигена и специфиче-

ского иммуноглобулина, который по традиции

называется антителом, образуется высокомоле-

кулярный комплекс, растворимый как в избытке

антител, так и в избытке антигена (рис. 3); его

можно использовать, чтобы судить о содержа-

нии антигена, но это не простая задача. Долгое

время не могли найти подходящего решения

этой задачи и иммунохимические методы были

лишь качественными или в лучшем случае полу-

количественными. Однако за последние 30 лет

найдено несколько путей для преодоления в той

или иной степени возникших трудностей. Это

делает антитела очень чувствительными и специ-

фическими реактивами для определения чрезвы-

чайно широкого класса органических веществ,

в первую очередь белков. Чаще всего использу-

ют три способа: 1) преципитацию в геле, 2) свя-

зывание меченых веществ и 3) изучение физиче-

ских характеристик образующихся макромоле-

кулярных комплексов.

Существует огромное количество вариантов

метода преципитации в геле. Однако в любом

случае в прозрачной желеобразной среде тем

или иным способом создается либо градиент

концентрации антигена при постоянной концен-

трации антител, либо градиенты концентраций

той и другой компоненты. В том месте, где их

содержание эквивалентно, выпадает осадок —

образуется зона преципитации, заметная нево-

30