Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 6

д) снова хорошо перемешать на мешалке

30 мин;

е) слить раствор через фильтр Millipore

в стерильный сосуд;

ж) разлить по 1 мл в стерильные пузырьки

и заморозить при — 20 °С.

В целом вся процедура приготовления дол-

жна проводиться в стерильных условиях. Сте-

рильный раствор гемолизата стабилен около

года. Раствор используют для контроля воспро-

изводимости исследований гемоглобина.

3. Консервированная кровь с фиксированны-

ми клетками крови или раствор с искусственны-

ми частицами, имитирующими клетки крови

(для контроля качества подсчета клеток крови).

4. Контрольные мазки (окрашенные и не-

окрашенные) с нормальной и патологической

лейкоцитарной формулой (для контроля каче-

ства подсчета лейкоцитарной формулы).

Мазки многократно просчитываются квали-

фицированными специалистами (не менее

20 раз). Из полученных данных рассчитывают

статистические критерии определения точности

подсчета мазка. Для удлинения срока хранения

мазков используют клей БФ-6, который облада-

ет свойством образовывать тонкую прозрачную

пленку, герметически приклеивающуюся к по-

верхности мазка и стекла и предохраняющую

препарат от внешних воздействий. Предложена

методика приготовления мазков на отмытой рен-

тгеновской пленке, нарезанной по размеру пред-

метного стекла. Мазки, приготовленные таким

образом, можно пересылать в конверте, что весь-

ма удобно при проведении межлабораторного

контроля качества подсчета лейкоцитарной фор-

мулы.

1.5.4. Контроль качества

работы лаборантов

Оценка качества работы лаборантов должна

быть частью программы внутрилабораторного

контроля качества. Могут быть использованы

следующие методы: 1) метод, использующий

результаты межлабораторного контроля каче-

ства; 2) метод дублированных анализов; 3) ме-

тод случайных проб; 4) метод разведения; 5) ме-

тод, использующий результаты внутрнлабора-

торного контроля качества.

Методы перечислены в порядке возрастания

времени, затрачиваемого на каждый метод заве-

дующим лабораторией. Методы 1 и 2 можно

использовать почти во всех лабораториях без

особых трудностей и больших расходов.

Лаборатории, участвующие в межлабора-

торных экспериментах по контролю качества

исследований, могут использовать результаты

контроля для оценки работы лаборантов. Метод

зависит от расчета правильности всех определе-

ний, выполненных лаборантами в контрольном

материале в течение определенного промежутка

времени. Нельзя делать выводы о качестве рабо-

ты лаборанта на основании одного анализа.

Однако если лаборант выполнил 10 или 20 ана-

лизов, то есть возможность оценить работу

лаборанта на основании аналитических резуль-

татов, если истинная величина проб известна.

Среднеквадратическое отклонение лаборатории,

рассчитанное контрольным центром, можно рас-

сматривать как отражение способности лабо-

ранта производить правильные анализы. Это

особенно верно, когда рассчитывают среднюю

арифметическую всех среднеквадратических от-

клонений для всех тестов. Эта средняя арифме-

тическая может быть названа как комбиниро-

ванное Среднеквадратическое отклонение (KS).

Величину KS рассчитывают за определенный

отрезок времени (полгода, год) для каждого

лаборанта и дают грубую оценку аналитической

способности каждого.

Лаборатории фиксируют результаты анали-

зов контрольных материалов за определенный

промежуток времени, идентифицируя каждый

тест с именем лаборанта, который выполнял

тест. После истечения установленного срока

приготовляют оценочные листы для каждого

лаборанта, как показано в табл. 7.

Т а б л и ц а 7. Результаты исследования

контрольной сыворотки лаборантом А за 1 год

Комбинированное Среднеквадратическое от-

клонение за год составляет 0,52. На оценочном

листе регистрируют название теста, выполняе-

мого лаборантом, полученный им результат,

истинное значение и Среднеквадратическое от-

клонение, сообщаемое контрольным центром. Из

этих величин рассчитывают разницу между

истинной величиной и полученной лаборантом

и делят на Среднеквадратическое отклонение.

Затем рассчитывают комбинированное средне-

квадратическое отклонение, которое является

средней всех среднеквадратических отклонений.

Как видно из табл. 7, лаборант А в первой пробе

для натрия получил результат 132 ммоль/л.

Средняя величина, сообщенная контрольным

центром, равна 132,7 ммоль/л. Среднеквадрати-

ческое отклонение среди участников контроля —

1,7 ммоль/л. Чтобы рассчитать 5 лаборанта А,

нужно решить следующее уравнение:

132-132,7

1,7

= -0,4.

Число, полученное в последнем столбце, показы-

вает, что величина, полученная лаборантом А,

на 0,4 единицы S меньше истинной величины

(если допустить, что средняя контроля есть

истинная величина). Отрицательные знаки в по-

следнем столбце игнорируют.

23

Величина KS указывает на способность ла-

боранта выполнить лабораторные исследования

с хорошей точностью. Чем ниже величина KS,

тем лучше работа лаборанта. Величину K.S мож-

но использовать для ранжирования лаборантов

по качеству работы. Величину KS от 0 до

0,5 можно считать очень хорошей, от 0,5 до 1 —

хорошей, от 1 до 1,5 — допустимой, от 1,5 до 2 —

плохой и выше 2 — очень плохой.

Первым требованием для применения метода

является обязательное участие лаборатории во

всех программах межлабораторного контроля

качества, чтобы каждый лаборант имел возмож-

ность выполнить не менее 10 тестов в контроль-

ной сыворотке за год. Во-вторых, этот метод

менее перспективен в полностью автоматизиро-

ванных лабораториях. В-третьих, заведующий

лабораторией должен гарантировать качество

оборудования и реактивов. Чтобы использовать

этот метод, лаборатория должна внедрить про-

грамму контроля качества исследований внутри

своей лаборатории. При ранжировании лабо-

рантов нужно, чтобы число исследуемых тестов,

выполняемых лаборантами, было равнознач-

ным.

Для сравнения качества работы лаборантов

можно использовать результаты дублированных

анализов. Принцип метода состоит в следую-

щем: разница между результатами дублиро-

ванных анализов обратно пропорциональна ка-

честву выполнения лаборантом исследований.

Лучшие лаборанты получают, как правило, не-

большую разницу между результатами дублиро-

ванных анализов, тогда как менее старательные

получают большую разницу.

где d — разница между результатами дублиро-

ванных анализов; п — число анализируемых

проб; 2n — общее число анализов.

Рассчитанное среднеквадратическое откло-

нение характеризует аналитическую ошибку,

присущую самому методу исследования, и ошиб-

ку лаборанта. Когда величина аналитической

ошибки постоянна, вариации, обнаруживаемые

в величине среднеквадратнческого отклонения,

полученные разными лаборантами, будут полу-

чаться вследствие вариации в ошибке лабо-

ранта. Другими словами, величина среднеквад-

ратического отклонения обратно пропорцио-

нальна квалификации лаборанта.

Этот метод оценки можно использовать толь-

ко для сравнения качества работы лаборантов,

но нельзя использовать для ранжирования, так

как невозможно точно сказать, какое средне-

квадратическое отклонение лучше.

Метод случайной пробы похож на предыду-

щий. Вместо анализа всех проб в дубликате

каждый лаборант анализирует одну или две

пробы в дубликате за неделю. Эти пробы выби-

раются случайно заведующим лабораторией,

без ведома лаборанта. Результаты дублирован-

ных анализов, выполняемые каждым лаборан-

том, заносят в таблицу за определенный проме-

жуток времени, после чего для каждого лабо-

ранта рассчитывают среднеквадратическое от-

клонение, значения которых заносят в таблицу

против каждого лаборанта. Оценка техники ис-

следования такая же, как в предыдущем методе.

В небольших лабораториях, где исследуют

менее 10 проб на один тест, трудно выбрать

случайную пробу без ведома лаборанта. В таких

случаях используют метод разведения, который

состоит из выбора случайной пробы и разведе-

ния ее водой или нормальным изотоническим

раствором хлорида натрия. Лучше растворять

пробу не более чем на 20%. Пробы, приготов-

ленные таким образом, под вымышленным име-

нем передают лаборанту для исследования. Ре-

зультаты заносят в таблицу, как в методе слу-

чайных проб, рассчитывают среднеквадратиче-

ское отклонение в целях оценки качества работы

лаборантов и затем высчитывают разницу меж-

ду полученной и ожидаемой величиной для

разведенной сыворотки.

Другой вариант того же метода — использо-

вание двух проб сыворотки больных, смешанных

1:1. Для расчета среднеквадратического откло-

нения используют разницу между расчетной

и аналитической величиной. Для смешивания

и разведения может быть также использована

ежедневная контрольная сыворотка.

Результаты исследования контрольной сыво-

ротки с известным содержанием компонентов,

проводимого в соответствии с программой внут-

рилабораторного контроля качества исследова-

ний, можно собрать за определенный отрезок

времени и таким же образом, как и результаты

межлабораторного контроля, использовать как

способ оценки качества работы лаборантов.

В паспорте к сыворотке содержится средняя

величина и среднеквадратическое отклонение.

После исследования этой сыворотки в лаборато-

рии можно рассчитать величину S для лабо-

ранта, используя S Из паспорта.

Например, лаборант при исследовании холе-

стерина в сыворотке получил результат

4,7 ммоль/л. В паспорте к сыворотке даны следу-

ющие значения: X = 4,8 ммоль/л, 5=0,13

ммоль/л при использовании того же метода.

Разница между полученным и паспортным зна-

чением составит: 4,8—4,7=0,1 ммоль/л.

Из среднеквадратических отклонений, вы-

считанных за определенный промежуток време-

ни, рассчитывают KS, которые затем можно

использовать для ранжирования и оценки каче-

ства работы лаборантов.

24

1.6. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ

ПРИНЦИПОВ МЕТОДОВ И АППАРАТУРЫ

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ

Подавляющее большинство результатов ла-

бораторных анализов получают с помощью той

или иной аппаратуры, чаще всего микроскопов

и фотометров (другие приборы используются

реже). Органолептические методы, для выполне-

ния которых не требуется никаких приборов

и аппаратов, имеют лишь вспомогательное зна-

чение. Чтобы грамотно применять эту сложную

медицинскую технику, нужно знать не только

практические приемы, что легко постигается в

процессе работы, но и физические принципы

измерений, так как они определяют оптимальные

диапазоны измеряемых величин, возможные по-

грешности и способы борьбы с ними, правила

контроля за технической стороной измерений

и т.д.

По способу использования все лабораторное

оборудование делится на измерительные прибо-

ры, которые выдают количественные результаты

и поэтому подлежат метрологическому контро-

лю, и прочую, иногда очень сложную, аппарату-

ру, которая метрологический контроль не прохо-

дит, например микроскопы. Ниже приводится

описание физических принципов работы и

устройства некоторых наиболее распространен-,

ных лабораторных измерительных приборов.

В клинической лабораторной диагностике

чаще всего используются оптические измери-

тельные приборы. К ним относятся приборы для

измерения светопоглощения — фотометры и

спектрофотометры; для измерения окраски и

светопропускания пленок — денситометры; для

измерения флюоресценции — флюорометры,

спектрофлюорометры, поляризационные флюо-

рометры; для измерения интенсивности свето-

излучения (окраски пламени, эмиссии) — пла-

менные фотометры; для измерения количества

излученного света — люминометры; для измере-

ния поглощения света раскаленными газами —

атомные абсорбциометры; для измерения свето-

рассеивания — нефелометры.

Другую группу составляют приборы для

электрохимических измерений — потенциомет-

ры, полярографы и т. д. По установившейся

традиции прибор для измерения электрического

потенциала при минимальном значении текуще-

го тока называется потенциометром, а метод —

потенциометрией. Если же измеряется сила тока

при постоянном значении электрического напря-

жения — это амперметрия, если в процессе из-

мерения величина потенциала изменяется по

тому или иному закону, такой метод называется

вольтамперметрней или полярографией, измере-

ние же количества электричества называется

кулонометрией. Из электрохимических приборов

непременной принадлежностью почти каждой

лаборатории крупной больницы являются рН-

метры и их разновидности — приборы для изме-

рения показателей кислотно-щелочного состоя-

ния (АЗИВ, прибор Аструпа и т. д.). К ним же

примыкает быстрорастущая группа датчиков

для непрерывного измерения различных пара-

метров внутренней среды — pO2, глюкозы, мо-

лочной кислоты и т. д., в которых используются

принципы потенциометрии и амперметрии.

В каждом, или почти в каждом, лабора-

торном измерительном приборе имеются приспо-

собления и устройства, облегчающие работу

лаборанта, однако в некоторых они настолько

совершенны, что функция аналитика сведена

к минимуму, все остальное выполняется автома-

тически. Такие приборы называются автомати-

ческими анализаторами; они бывают двух типов:

непрерывные, когда все пробы обрабатываются

последовательно, как на конвейере, и дискретные,

когда одновременно обрабатывается серия из

определенного количества проб, причем следую-

щую серию можно анализировать только тогда,

когда анализ окончен. Работа автоматического

анализатора управляется процессором — спе-

циальной вычислительной машиной; результаты

работы автоматического анализатора сравни-

тельно легко могут быть переданы цифровой

вычислительной машине, поэтому автоматиза-

ция работы неизбежно ведет к насыщению клини-

ческих лабораторий вычислительной техникой

К числу измерительных приборов должны

быть отнесены и более сложные устройства,

в которых объединены две функции: разделения

веществ и определения их количества в различ-

ных фракциях. Это приборы для электрофореза

и различные хроматографы. Поскольку эти при-
боры чаще всего используются в научной работе,

в настоящем разделе они не рассматриваются,

так же как не рассматривается другой очень

важный класс аналитической аппаратуры — ве-
сы, поскольку взвешивание используется в лабо-

раториях почти исключительно для приготовле-

ния растворов, а не для анализа состава биоло-

гических жидкостей, как это делается в весовом

анализе.

Ниже приводятся сведения, которые должны

знать лабораторные работники, чтобы успешно

заниматься фотометрией (в том числе спектро-

фотометрией), флюорометрией и потенциомет-

рией (практически измерением рН). Некоторые

вопросы, касающиеся других методов измере-

ний, рассмотрены в соответствующих разделах.

1.6.1. Фотометрия

и фотометрическая аппаратура

Биохимические аналитические методы чаще

всего оканчиваются цветной реакцией, в резуль-

тате которой прозрачный раствор приобретает

окраску, т. е. способность избирательно погло-

щать (абсорбировать) свет с определенной дли-

ной волны. Разумеется, что тот свет, который не

поглотился, проходит через раствор, поэтому

субъективно воспринимаемая окраска является

дополнительным цветом относительно того, ко-

25

торый поглотился. Так, если интенсивно погло-

щается красный свет, то раствор бывает зеле-

ным или синим, если поглощается фиолетовый

свет, раствор желтый и т. д. График, изобра-

жающий поглощение света с разными длинами

волн, называется спектральной кривой; обычно

для фотометрии используют область, где погло-

щение света наибольшее, т. е. максимум спект-

ральной кривой. Форма кривой, количество

максимумов на ней и их положение могут очень

варьировать, но обычно в видимой области не

бывает больше одного-двух максимумов, поэто-

му выбрать участок спектра, наиболее подходя-

щий для измерения, несложно.

Для аналитических целей пригодны только те

цветные реакции, в которых развивается окра-

ска, пропорциональная концентрации исследуе-

мого вещества. В этом случае посредством фото-

метрии измеряется количество поглощаемого

света и по этим данным рассчитывается искомая

концентрация. Однако количественные резуль-

таты удается получать лишь в определенном

диапазоне концентраций, про который говорят,

что в нем соблюдается закон Ламберта-Бера.

Если в растворе имеются непрозрачные

частицы, рассеивающие свет, он выглядит мут-

ным. В этом случае, строго говоря, фотометрия

невозможна, так как трудно узнать, сколько

света поглотилось, а сколько рассеялось. Суще-

ствуют разные способы уменьшить ошибку, вы-

званную мутностью, но все они эффективны

лишь в известной мере. В то же время рассеива-

ние света может быть использовано для опреде-

ления количества рассеивающих частиц, а так-

же их размеров; такой анализ называется

нефелометрией, или турбидиметрией.

Закон поглощения света окрашенными

растворами (Ламберта-Бера). Между концен-

трацией окрашенного вещества в растворе, тол-

щиной раствора и долей света, которая в этом

растворе поглощается, существует сложная ло-

гарифмическая зависимость:

раствор (т. е. то его количество, которое улавли-

вается приемником света); /

0

 — количество све-

та, падающего на раствор (т. е. величина холо-

стого опыта, когда окрашенного вещества нет,

но все остальные потерн остаются); с — концен-

трация; / — толщина слоя; k — характеристика

поглощающего вещества — так называемый ко-

эффициент экстинкции, или коэффициент опти-

ческой плотности. Если толщина слоя выражена

в сантиметрах, а концентрация в молях в 1 см

3

,

то коэффициент k имеет размерность см

2

/моль

(в результате перемножения всех трех величин

должен получиться безразмерный параметр);

эта величина называется молярным коэффици-

ентом экстинкции и соответствует количеству

молей (или его долей) вещества, находящегося

в 1  с м

2

 светового потока. Заметим, что эта

величина в 1000 раз меньше той, которая полу-

чится, если использовать более привычные раз-

мерности, т. е. выражать концентрацию в молях

в 1 л, а длину кюветы в сантиметрах:

видно из этих формул, ни количество прошедше-

го света, ни количество поглощенного света, ни

доля поглощенного света относительно падаю-

щего непропорциональны концентрации иссле-

дуемого раствора. Она прямо пропорциональна

логарифму отношений прошедшего через раст-

вор и падающего света:

Величина Е называется экстинкцией, или опти-

ческой плотностью раствора; большинство фото-

метрических приборов устроено так, что они

непосредственно указывают эту величину. Как

правило, имеется возможность отсчитывать ре-

зультаты и по другой шкале — в процентах

поглощенного или прошедшего света относи-

тельно фоновых величин. На широко распро-

страненном фотометре ФЭК шкала оптических

плотностей нанесена красной краской, а шкала

процентов пропускания — черной (в просторе-

чии так и указывают: "отсчет по красной шка-

ле», имея в виду шкалу оптических плотностей).

Если оптическая плотность 1, это значит, что

через раствор прошло только 10 % света, а

остальные 90 % поглотились в нем. Для боль-

шинства приборов высокого класса это крайняя

величина, выше которой уже трудно получить

надежные результаты, но для обычных лабора-

торных приборов она находится вне диапазона

достоверных данных. Во всех предназначенных

для измерения оптической плотности приборах

наибольшая точность достигается при значени-

ях экстинкцин около 0,3 (т. е. когда проходит

примерно половина падающего света); по мере

удаления в ту и другую сторону точность измере-

ния, а следовательно, и достоверность результа-

тов уменьшаются.

Экстинкция раствора, т. е. величина оптиче-

ской плотности, есть произведение концентрации

на толщину слоя раствора. Поэтому не имеет

значения, фотометрируется данный раствор в

кювете с длиной оптического .пути 1 см или тот

же раствор, разведенный в два раза, но в кювете

с длиной оптического пути 2 см и т. д. Удлинение

оптического пути приводит к повышению чув-

ствительности лишь в том случае, если объем

раствора остается прежним и сокращается попе-

речное сечение кюветы. Но возможности тут

ограничены, так как чем уже и длиннее кювета,

тем большие требования предъявляются к фоку-

сировке и юстировке пучка света. Поэтому боль-

шинство биохимических методик рассчитано

так, чтобы фотометрия проводилась в кювете

с длиной оптического пути I см; значительно

реже используются кюветы с длиной оптическо-

го пути 0,5 см, а кюветы с длиной оптического

пути 2 см — практически никогда.

26