Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 3

1.4,1. Воспроизводимость

Воспроизводимость результатов — соответ-

ствие результатов повторных определений в од-

ном и том же материале. Воспроизводимость не

имеет числовой величины, она определяется сте-

пенью разброса результатов. Воспроизводи-

мость аналитического метода определяется вос-

производимостью результатов, полученных этим

методом.

Понятие, обратное воспроизводимости,—

разброс результатов, или аналитическая вариа-

ция, зависит от наличия случайных погрешно-

стей и может быть охарактеризовано количе-

ственно. В зависимости от условий определения

различают аналитическую вариацию в серии, во

времени и межлабораторную. Воспроизводи-

мость метода зависит от случайных погрешно-

стей, обусловленных количеством процедур ме-

тода (осаждение, центрифугирование, пипетиро-

вание), а также стабильностью окрашенного

комплекса и другими причинами. Воспроизводи-

мость рассчитывают либо по двум параллель-

ным результатам при исследовании различных

образцов, либо по результатам повторных опре-

делений на одном и том же контрольном матери-

але в течение не менее 20 дней, следующих друг

за другом. Контрольный материал должен быть

стабильным в течение всего периода проверки.

Можно использовать пригодный слитый биоло-

гический материал.

Статистическим показателем разброса ре-

зультатов является среднеквадратическое от-

клонение S и относительный показатель разбро-

са результатов — коэффициент вариации

V. Сравнивают аналитическую вариацию метода

с помощью F-теста.

кыми определениями; п — число определении;

S — среднеквадратическое отклонение; V— ко-

эффициент вариации; F — тест оценки вариации

методов.

Воспроизводимость определяют на разных

уровнях концентрации — нормальном и патоло-

гическом. Это позволяет более полно охаракте-

ризовать воспроизводимость метода на всем

диапазоне измеряемых концентраций. Чем мень-

ше коэффициент вариации, тем выше воспро-

изводимость результатов, получаемых тем или

иным методом.

Такой способ оценки воспроизводимости по-

зволяет объективно оценивать и сравнивать

воспроизводимость различных методов.

1.4.2. Правильность

Правильность результатов — соответствие

среднего значения результатов повторных опре-

делений одного и того же материала должной

(номинальной) величине. Правильность не име-

ет числовой величины, она определяется непра-

вильностью.

Правильность метода определяется правиль-

ностью результатов, полученных этим методом,

и зависит от наличия систематических погреш-

ностей метода. Систематическая погрешность

метода может быть обусловлена рядом причин:

неспецифичностью метода или неправильным

способом построения калибровочной кривой, ис-

пользованием калибровочного материала недо>

статочной степени чистоты, неправильной поста-

новкой холостой пробы и т. д.

Статистическим критерием правильности яв-

ляется средняя арифметическая (X) и степень ее

отклонения от должного (номинального) значе-

ния. Способами определения правильности мо-

гут быть следующие.

С п о с о б  д о б а в к и — внесение в биоло-

гическую жидкость точно взвешенного количе-

ства анализируемого вещества и определение

его с помощью исследуемого метода.

С п о с о б  с м е ш и в а н и я  п р о б — био-

логическая жидкость с низкой и с высокой

концентрацией исследуемого вещества смеши-

вается в различных соотношениях.

Способы добавки и смешивания проб (по-

следний может быть применим в методах опреде-

ления активности ферментов, где невозможно

использовать способ добавки) не всегда позво-

ляют определить систематическую погрешность

метода. Например, добавленное количество кре-

атинина, определенное по реакции Яффе, может

дать хороший процент выявления, однако мето-

ды, основанные на реакции Яффе, дают непра-

вильные результаты за счет низкой специфично-

сти метода. Процент выявления вещества, рав-

ный 90—110, считается удовлетворительным для

клинических лабораторных методов.

И с с л е д о в а н и е  к о н т р о л ь н о г о

м а т е р и а л а с известным содержанием ком-

понентов — наиболее простой способ оценки

правильности. Однако он может быть использо-

ван только для быстрой ориентировочной оценки

правильности метода. Обязательным условием,

ограничивающим возможности этого способа,

является использование метода, который ука-

зан в аннотации к контрольному материалу.

Процедура изготовления контрольного материа-

ла, хранение его, вид используемой сыворотки

могут в значительной степени изменить истинное

содержание компонента. Особенно большим из-

менениям могут подвергнуться ферменты.

С р а в н е н и е  м е т о д о в . Наиболее ин-

формативным способом является способ сравне-

ния методов, который позволяет определять

общую систематическую погрешность метода.

11

Смысл сравнения методов состоит в сравнении

результатов, полученных методом-кандидатом

(т. е. методом, правильность которого исследу-

ется) и сравнительным методом, который дол-

жен давать правильные результаты. Поэтому

крайне важную роль играет правильность мето-

да, используемого для сравнения. Оптимальным

для этих целей является применение референт-

ного метода.

Референтный (эталонный) метод — это ме-

тод, обладающий максимальной специфично-
стью, правильностью и воспроизводимостью ре-

зультатов определения без учета экономических

затрат. Он служит главным образом для сравне-

ния методов при оценке аналитической надежно-

сти унифицированных и других методов. Однако

референтные методы могут быть недоступны ла-

бораториям, и для определения ряда компо-

нентов они еще не разработаны. Поэтому в каче-

стве сравнительных могут использоваться мето-

ды, правильность которых исследована и резуль-

таты не дают существенного отклонения от

истинных величин.

Для более точной оценки правильности мето-

да-кандидата сравнение методов следует прово-

дить в соответствии с правилами сравнения

методов. Эти правила предусматривают точное

соблюдение всех письменных указаний по при-

менению метода, проведение исследований под

контролем качества с применением единого кон-

трольного материала для гарантии стабильности

условий исследования. В сравниваемых методах

должны быть проверены точность и линейность

калибровочных кривых, по возможности приме-

няться одни и те же реактивы, приборы, работа

должна проводиться одними и теми же лабо-

рантами. Правильность метода оценивается на

всем диапазоне измеряемых концентраций, поэ-

тому рекомендуется исследовать образцы с низ-

кими, нормальными и повышенными концен-

трациями вещества. Сравнение методов можно

проводить на контрольном материале и на био-

логическом материале, полученном от больных

и здоровых лиц; очень важным является выбор

метода для сравнения.

1.4.3. Статистическая оценка

правильности результатов

Статистическая обработка результатов со-

стоит в оценке степени совпадения результатов,

полученных методом-кандидатом и сравнитель-

ным методом. Ниже приводится статистический

способ оценки результатов сравниваемых мето-

дов, не требующий специальной вычислительной

техники и позволяющий судить о правильности

метода-кандидата.

Для оценки правильности определяются до-

стоверность различий результатов и наличие

статистической связи.

О п р е д е л е н и е  д о с т о в е р н о с т и

р а з л и ч и й  р е з у л ь т а т о в . Для этого при-

меняют тест Стьюдента:

где X, Р — средние арифметические результатов

сравниваемых методов; га — ошибка средней

арифметической.

Наиболее достоверные результаты тест

Стьюдента дает при нормальном распределении

результатов. Поэтому в тех случаях, когда рас-

пределение результатов не является нормаль-

ным или вид распределения невозможно опреде-

лить из-за малого числа наблюдений, рекомен-

дуется использовать непараметрические крите-

рии статистики — критерий знаков, тест Вилкок-

сона (F. Wilcoxon).

Преимуществом непараметрических крите-

риев является их независимость от вида распре-

деления результатов и простота расчета. Крите-

рий знаков эффективен при большом числе
определений. Он учитывает не степень разли-

чий в каждой паре, а лишь их направленность

(знак) и основан на подсчете числа разностей

между результатами X и F со знаком + или —.

Если число наблюдений невелико и критерий

знаков не выявил различий, целесообразно при-

менить критерий Т — парный критерий Вилкок-

сона. Критерий Т более чувствителен, чем крите-

рий знаков. Заключения строят на достигнутом

уровне значимости.

Для целей лабораторной диагностики доста-

точен уровень значимости р = 0,05. Полученные

значения сравнивают с табличными. Если

р<0,05, то различия между методом-кандида-

том и сравнительным методом достоверны,

т. е. метод-кандидат имеет систематическую

ошибку. Если р>0,05, то различия на достигну-

том уровне значимости недостоверны, т. е. ме-

тод-кандидат может быть правильным. Даль-

нейшая обработка результатов состоит в оценке

статистической связи.

Д л я  о ц е н к и  с т а т и с т и ч е с к о й

с в я з и можно использовать корреляционным

метод и метод регрессии. Корреляционный метод

менее информативен, чем метод регрессии. Кор-

реляция указывает на степень связи двух рядов

чисел, т. е. изучается зависимость между резуль-

татами X и У двух методов. Для определения

корреляции рассчитывают линейный коэффици-

ент корреляции r и коэффициент ранговой кор-

реляции р, при расчете которого результаты

оценивают порядковыми номерами — рангами

от меньших результатов к большим. Порядко-

вый номер каждого результата является его

рангом.

Формула расчета коэффициента корреляции:

12

Формула расчета коэффициента ранговой

корреляции:

где х — результаты сравнительного метода; у —

результаты метода-кандидата; а — значение у

при х, равном 0; в — коэффициент пропорцио-

нальности илн регрессии.

Если а статистически отличается от 0, то

метод-кандидат имеет систематическую погреш-

ность по отношению к сравнительному методу.

Эта ошибка может быть приемлемой и непри-

емлемой.

1.4.4. Специфичность

Аналитическая специфичность метода —

спoсобность метода измерять лишь тот компо-

нент или те компоненты, для определения кото-

рых он предназначен. Низкая специфичность

приводит к получению неправильных результа-

тов и должна быть указана в описании метода.

Оценка специфичности не имеет завершения,

поскольку любое вещество может повлиять на

результаты. Для оценки аналитической специ-

фичности следует использовать примеси, кото-

рые, исходя из химической структуры, являются

репрезентативными представителями тех групп

веществ, которые с физиологической точки зре-

ния имеют практическое значение.

Интерференция в отличие от неспецифично-

сти обусловлена влиянием веществ на ход ре-

акции. Способ влияния (повышение, пониже-

ние) и степень влияния могут быть различными.

Важным аспектом этой проблемы является

интерференция лекарств. Лекарственные веще-

ства в зависимости от вида, дозы, способа

применения могут воздействовать на результаты

лабораторных исследований различными путя-

ми: различают фармакологическую интерферен-

цию в организме и техническую интерференцию

в ходе выполнения анализа.

Низкая специфичность, интерференция сни-

жают правильность метода. Поэтому предпочте-

ние следует отдавать более специфичным мето-

дам и свободным от интерференции!

1.4.5. Чувствительность

Аналитическая чувствительность метода оп-

ределяется его способностью выявлять наимень-

шие различия между двумя концентрациями

исследуемого вещества. В процессе калибровки

устанавливается диапазон линейности калибро-

вочной кривой, что является частью аналитиче-

ской характеристики метода. В диапазоне линей-

ности аналитическая чувствительность опреде-

ляется наклоном калибровочной кривой.

Нижний предел чувствительности метода —

это концентрация исследуемого вещества, кото-

рая соответствует наименьшему результату

определения, статистически достоверно отлича-

ющемуся от показателей холостой пробы. Ни-

жний предел чувствительности метода может

быть охарактеризован количественно.

Практически определить нижний предел чув-

ствительности для фотометрических методов

можно следующим образом: проводят многок-

ратное исследование (не менее 20) холостой

пробы и проб с низкой концентрацией анализи-

руемого вещества и устанавливают с заданным

уровнем значимости статистически достоверные

различия между результатами холостой и опыт-

ной проб с низким значением анализируемого

вещества, которое и будет количественно со-

ответствовать нижнему пределу чувствительно-

сти метода.

Экспериментально установлено, что обычно

нижний предел чувствительности в фотометри-

ческих методах равен среднему значению холо-

стой пробы плюс 3 средних квадратических

отклонения (X+3S).

1.4.6. Принципы определения допустимых

погрешностей результатов лабораторных

исследований

Проблемы, связанные с повышением анали-

тической надежности результатов лабораторных

исследований, направлены не только на улучше-

ние их аналитических качеств, но и на повыше-

ние диагностической информативности лабора-

знак сумми-

ровании.

Коэффициенты корреляции могут колебаться

от 0 до +1 при положительной корреляции и от

0 до —1 —при отрицательной корреляции.

При хорошем совпадении результатов срав-

ниваемых методов значение r будет около

1 (0,9—0,99). Чем ниже величина коэффициента

корреляции, тем меньше степень совпадения ре-

зультатов сравниваемых методов. При

:

 отсут-

ствии связи между результатами r=0. Если

корреляция отрицательна, при изменении ре-

зультатов группы X результаты группы Y будут

изменяться в противоположном направлении.

М е т о д  р е г р е с с и и . Если корреляция

указывает на степень связи, то регрессия позво-

ляет определить, как количественно меняется

один результат по мере изменения другого. Для

построения эмпирической линии регрессии на

диаграмму наносят парные результаты в виде

точек: на оси абсцисс — сравнительного метода,

на оси ординат — метода-кандидата. Диаграм-

ма дает первое представление о типе связи

между двумя методами. При линейной регрессии

точки располагаются вокруг прямой линии. Если

регрессия нелинейна, то требуется дальнейшая

доработка метода-кандидата, т. е. он непригоден

для целей лабораторной диагностики.

Линейную регрессию рассчитывают по фор-

муле:

торных тестов. В этом основной смысл работы,

которая проводится в области лабораторной

аналитики. Однако будет неправильно и эконо-

мически не оправдано стремиться к необосно-

ванной. наибольшей точности результатов лабо-

раторных исследований. Необходимый уровень

точности, соответствующий клиническим целям,

или допустимый предел погрешности результа-

тов лабораторных исследований должен быть

установлен на научной основе.

Общая погрешность результатов, анализа,

получаемая количественными аналитическими

методами, зависит от наличия систематической

погрешности, характеризующей неправиль-

ность, и случайной погрешности, характеризую-

щей аналитическую вариацию (разброс).

П р и н ц и п ы определения допустимой ана-

литической вариации базируются на следую-

щем. Прежде всего должна быть установлена

аналитическая вариация метода, что позволит

реально оценить разброс результатов, получае-

мых тем или иным методом. Далее величину

полученной аналитической вариации сравнива-

ют с биологической вариацией. Смысл такого

сравнения состоит в определении степени влия-

ния аналитической вариации на биологическую,

тем самым определяется степень влияния анали-

тической вариации на расширение диапазона

нормальных или референтных величин.

Соотношение между различными видами ва-

риации определяется следующим уравнением:

Биологическая вариация имеет два источни-

ка: внутрииндивидуальная и межиндивидуаль-

ная вариации:

должны соответствовать наибольшей точности;

Более высокая степень биологической вариации

обнаруживается у веществ, участвующих в про-

цессах анаболизма. К этой группе веществ

относятся глюкоза, холестерин. Наибольшую

биологическую вариацию имеют вещества, явля-

ющиеся конечными продуктами катаболизма,—

мочевина, мочевая кислота, креатинин и веще-

ства, выделяющиеся из тканей, например лак-

татдегидрогеназа, аминотрансферазы и

др'. К точности определения веществ этой группы

предъявляются менее высокие требования, так

как указанные вещества в норме имеют широ-

кую биологическую вариацию.

Таким образом, во всех случаях при расчете

допустимых пределов погрешности метода инди-

видуально для каждого вещества устанавлива-

ются необходимая точность или допустимые

пределы ошибок. Каждое вещество в конечном

счете исследуется для определенных клиниче-

ских целей — установления диагноза, контроля

за лечением, обследования здоровых. В зависи-

мости от поставленной цели будут меняться

и требования к точности результатов. Поэтому

окончательный критерий в оценке допустимой
погрешности должен основываться на определе-

нии влияния аналитической вариации на диагно-

стическую информативность результатов анали-

за, т. е. носить медицинский характер. Медицин-

ски допустимые пределы погрешностей в различ-

ных клинических ситуациях будут различными;

например, при повторном исследовании лабора-

торного показателя у одного и того же больного

медицински допустимые пределы погрешности

будут более строгими — они включают внутри-

индивидуальную и аналитическую вариации изо

дня в день. При диспансеризации здоровых наи-

большее значение для разделения нормы и пато-

логии будет иметь межиндивидуальная вариа-

ция, при этом медицинские требования к точно-

сти могут быть снижены.

Для оценки медицински допустимых преде-

лов погрешностей может быть использован оп-

рос мнений врачей-клиницистов и лабораторных

работников [Меньшиков В. В., Делекторская

Л. Н., 1980; Barnett R., 1968, 1977|. С этой целью

лечащие врачи для определенного вида патоло-

гии, например сахарного диабета, устанавлива-

ют концентрацию исследуемого компонента

(глюкозы) выше верхнего предела нормальных

значений, за пределами которого начинается, по

их мнению, определенный вид патологии (са-

харный диабет), например для глюкозы в сыво-

ротке крови — 110 мг/100 мл (18 мг/100 мл —

1 ммоль/л) при верхнем пределе нормы

90 мг/100 мл.

Величина, превышающая верхний предел

нормальных значений (20 мг/100 мл в нашем

примере) является мерой медицински допусти-

мого отклонения. Эту величину можно использо-

вать для расчета медицински допустимого ко-

эффициента вариации и последующего его срав-

нения с аналитической вариацией, получаемой

при определении тех же компонентов. Если

110 мг/100 мл в приведенном примере являются

средней величиной (X), полученной на основа-

нии ответов лечащих врачей, то 20 мг/100 мл

14

меньше 0,4 влияние аналитической вариации на

общую будет незначительным.

Существуют и другие способы определения

соотношения аналитической и биологической ва-

риаций. Например, по D. Tonks (1968), коэффи-

циент вариации метода не должен превышать

1/8 области нормальных пределов в процентах
от средней величины нормы. При этом нормаль-

ные величины рассматриваются как совокуп-

ность аналитической и биологической вариаций.

Следовательно, для достижения точности,

необходимой для клинических целей, важна не

только величина аналитической вариации, но

и ее соотношение с биологической вариацией.

Степень же биологической вариации определя-

ется физиологической ролью веществ в орга-

низме. В связи с этим м'ожно выделить группу

веществ, имеющих наилучшую гомеостатиче-

скую регуляцию, т. е. имеющих наименьшую

биологическую вариацию. К ним относятся та-

кие вещества, как натрий, хлор, общий белок,
калий. Результаты определения таких веществ