Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 2

вый карандаш, надпись не расползается, но

легко удаляется обычной резинкой.

 :

Подавляющее большинство анализов можно

с равным успехом проводить как в пробирках,

так и в пеннциллиновых флакончиках, однако

флакончики удобнее, так как могут стоять

на столе без штатива и легко закрываются

пробками.

1.2.2. Мытье посуды

Чтобы анализ был успешным, посуда должна

быть чисто вымыта, причем для разных исследо-

ваний требования к чистоте посуды и, следова-

тельно, способы мытья неодинаковы. Наиболее

широко распространена обработка стеклянной

посуды хромовой смесью, или, как ее сокра-

щенно называют, хромпиком. Для ее приго-

товления в большую фарфоровую ступку насы-

многократном промывании посуды водой. Для

каждого вида анализов надо отработать адек-

ватный— не слишком трудоемкий, но доста-

точно надежный метод мытья, убедиться, что он

не искажает результаты исследования и всегда

пользоваться одним и тем же моющим сред-

ством. Какие-либо однозначные советы тут дать

трудно, так как поступающие в продажу сти-

ральные порошки, помимо основного детерген-

та — алкилсульфоновых кислот, содержат раз-

личные добавки, а разные сорта стекла по-

разному выщелачиваются и адсорбируют мою-

щие средства.

Надо постоянно заботиться также о чистоте

той посуды, которую не моют перед каждым

анализом (пипетки и флаконы для реактивов).

Иногда вновь приготовленную порцию реактива

можно налить во флакон, в котором еще сохра-

нились остатки предыдущей порции этого же

реактива, но, как правило, остатки выливают

и флакон моют с хромпиком. Делают это потому,

что существует угроза развития грибов и микро-

бов, для которых многие реактивы оказываются

если не идеальной, то подходящей средой.

Мытье флаконов с хромпиком и высушивание

в горячем сушильном шкафу хотя и не обеспечи-

вают полную стерильность, но значительно

уменьшают микробную обсемененность и спо-

собствуют лучшей сохранности реактивов. То же

относится и к пипеткам, которыми реактивы

отмеривают.

1.2.3. Приготовление реактивов

и проверка их чистоты

Теоретически совершенно чистых реактивов

не существует, в каждом препарате есть какое-

то количество примесей. Практически важно

только, чтобы они не препятствовали данному

анализу. В связи с тем что разные партии могут

содержать различные примеси, не всегда огово-

ренные в стандарте на данный реактив, может

оказаться, что одна партия для конкретного

вида исследования пригодна, а другая непри-

годна, хотя обе имеют одинаковую квалифика-

цию. По этой причине следует с определенной

осторожностью решать, что препарат такой-то

квалификации для данного исследования непри-

годен. Некоторые способы проверки пригодности

реактивов и их очистки приведены в соответству-

ющих разделах справочника.

Приготовление реактива начинается с взве-

шивания. Надо готовить такое его количество,

которое может быть израсходовано за месяц

(самое большое — за 2 мес), но в то же время

навеска не должна быть менее 20—30 мг, так как

иначе точное взвешивание весьма осложняется.

При приготовлении калибровочных растворов

в прописях обычно указывают круглые .числа,

например 100 мг или 0,2 ммоля, которые должны

быть растворены в 50 или 100 мл растворителя.

Если реактив дефицитен или навеска мала,

удобнее точно взвесить то количество реактива,

которое сразу же попало на весы: допустим,

вместо 10 мг взять 9,3 мг и растворить их в мень-

шем количестве воды (в данном случае не

в 100 мл, а в 93 мл). Растворы обычно отмерива-

пают кристаллы оихромата калия

и растирают с концентрированной серной кисло-

той, постепенно увеличивая ее количество, так,

чтобы раствор был насыщенным. Смесь должна

иметь красноватый оттенок и нагреваться, если

ее налить в мокрую посуду. Когда хромпик

приобретает зеленый цвет и перестает нагре-

ваться, это будет означать, что его способность

к окислению органических соединений исчерпа-

на, в связи с чем он не может более применяться

для мытья посуды. Хромовую смесь наливают

в колбы, цилиндры и т. д. или погружают в нее

более мелкие предметы — пипетки, флакончики

и т. п. Перед тем как обрабатывать посуду хром-

пиком, надо тщательно удалить все видимые на

глаз загрязнения, в том числе надписи каранда-

шом по стеклу. В противном случае хромовая

смесь быстро портится, но, главное, при взаимо-

действии с органическим веществом могут обра-

зовываться ядовитые пары и выделяться тепло,

что таит в себе опасность взрыва.

Хромовая смесь — очень едкий реактив: он

прожигает одежду, а попадая на кожу, вызыва-

ет ожоги. Поэтому, если возможно, лучше по-

льзоваться менее едкими средствами — содой,

мылом, стиральным порошком. Если посуду мо-

ют, погружая ее в моющие-растворы, то сначала

надо удалить грязь и надписи с внешней по-

верхности и вымыть ее теплой водой с мылом;

если надписи сделаны стеклографом (каранда-

шом по стеклу), их удаляют ватой, смоченной

в органическом растворителе (хлороформ, эфир

и т. д.). Грязь на внешней поверхности не только

портит моющие растворы, но и может попасть

с ними на внутреннюю поверхность посуды.

Каждый способ мытья посуды имеет свои

преимущества и недостатки; он должен йыть

адекватен тому виду анализа, для выполнения

которого посуда предназначается, поэтому же-

лательно всегда использовать один и тот же

комплект посуды. Мытье хромпиком обеспечива-

ет степень чистоты, достаточную практически

для всех видов лабораторных клинических ра-

бот, но способ этот трудоемок и требует соблю-

дения мер предосторожности. Стиральные по-

рошки безопаснее и работать с ними проще, но

надо иметь в виду, что они прочно адсорбиру-

ются на стекле и могут быть удалены только при

ют с помощью мерной посуды — мерных колб

и цилиндров, но иногда бывает удобно взвесить

растворитель на весах, особенно если нужно

отмерить большие и некруглые количества (на-

пример, 1450 мл). Это часто оказывается точнее,

чем отмеривание нескольких объемов; не надо

только забывать, что относительная плотность

многих растворов отлична от I.

Часто в прописях используют понятие «про-

центный раствор»; оно не совсем точно, поэтому

в настоящем справочнике везде приведены со-

ответствующие разъяснения. Строго говоря,

процент — это одна сотая часть среди каче-

ственно одинаковых частей. Поэтому когда гово-

рят о 3 % растворе, формально следует пони-

мать такой раствор, в 100 г которого содержится

3 г данного вещества и 97 г каких-то других

составных частей. Однако в химической литера-

туре иногда неправильно называют процент-

ным такой раствор, в 100 мл которого со-

держится 3 г данного вещества. Молярные

растворы действительно готовят так, чтобы

I л содержал столько-то молей растворенного

вещества; этот принцип неправильно распро-

страняют и на процентные растворы.

Иногда используют понятие «объемные про-

центы», которое предполагает, что данный

раствор получен путем смешивания А объемов

растворенного вещества и 100-А объемов

растворителя. В связи с тем что при, смешивании

жидкостей суммарный объем смеси обычно ме-

няется, такой способ выражения нельзя считать

удачным. Правильнее обозначать соотношение

частей знаком «двоеточие» (:). Так, запись «во-

да : спирт : ацетон  1 : 2 : 3 » означает, что дан-

ная смесь получена путем смешивания 1 объема

воды, 2 объемов спирта и 3 объемов ацетона.

Растворы с точными концентрациями, осо-

бенно калибровочные и буферные, надо готовить

в мерных колбах; мерные цилиндры можно ис-

пользовать только при отсутствии высоких тре-

бований к точности. Некоторые работники, пы-

таясь сэкономить время, при приготовлении

раствора насыпают навеску непосредственно в

мерную колбу, растворяют ее там и доводят

объем до метки. Так можно поступать лишь

в исключительных случаях, так как мерная посу-

да значительно дороже немерной, а когда насы-

пают вещество через узкое горлышко, а затем

перемешивают и нагревают для растворения,

колбу легко разбить.

Навеску вещества растворяют в широко-

горлой колбе или в химическом стакане в коли-

честве растворителя, которое составляет от 30 до

80 % окончательного объема, а затем перелива-

ют в мерную колбу, споласкивают посуду, в ко-

торой готовили раствор, новой порцией раство-

рителя, добавляют его в мерную колбу, а затем

уже доводят объем до метки.

1.2.4. Отмеривание растворов,

взвешивание, центрифугирование

Для отмеривания растворов применяют пи-

петки различных конструкций (в том числе

автоматические) и дозаторы. Наиболее перспек-

тивны автоматические пипетки со сменными

наконечниками для фиксированных или изменя-

емых объемов. В такой пипетке имеется пор-

шень, при перемещении которого засасывается

или выдавливается определенный объем возду-

ха, в результате чего в сменный наконечник

пипетки сначала засасывается, а затем вытесня-

ется оттуда определенный объем жидкости. Су-

ществуют автоматические пипетки с тремя или

большим числом наконечников, которые по су-

ществу представляют собой несколько пипеток,

объединенных в один блок, с единой системой

управления, так что одновременно заполняются

или опорожняются несколько наконечников. Это

позволяет ускорить розлив реактивов.

Автоматический дозатор представляет собой

поршень с цилиндром, который через систему

клапанов соединен с резервуаром реактива и на-

конечником. За один рабочий ход дозатор запо-

лняет рабочий цилиндр реактивом, а за второй

выпускает отмеренную порцию через наконеч-

ник. Заполнение и опорожнение цилиндра может

производиться либо вручную, либо с помощью

электропривода. Аналогично дозатору устроен

и дилютер, который отличается лишь тем, что

сначала через наконечник засасывает опреде-

ленный объем разводимой жидкости (обычно

сыворотки), а затем через тот же наконечник

выпускает больший объем разводящей жидко-

сти (реактива), при этом происходит разведение

и перемешивание.

При отмеривании растворов стеклянной пи-

петкой с делениями нижний мениск жидкости

должен быть на уровне соответствующего деле-

ния пипетки, которую располагают строго верти-

кально. Пипетку заполняют и опорожняют с по-

мощью резиновой груши или шприца, соеди-

ненного с пипеткой резиновой трубкой. Недо-

пустимо засасывать растворы ртом, так как при

этом в рот могут попасть ядовитые жидкости,

слюна же почти неизбежно попадает в пипетку,

а из нее в реактивы и опытные пробы.

После того как пипетка заполнена с по-

мощью резиновой груши, ее можно отсоединить,

закрыть отверстие пипетки пальцем и осторожно

выпускать раствор, но при соответствующем на-

выке удобнее регулировать вытекающие объемы

жидкости, надавливая на грушу. Оправдывает

себя и такая система, когда пипетка вертикально

укреплена в штативе Бунзена, а с помощью

другой лапки на том же штативе укреплены

шприц или резиновая груша. Перемещая пор-

шень шприца, можно заполнять пипетку и вы-

пускать нужные порции реактива.

Сухие вещества для приготовления реакти-

вов взвешивают на аналитических, аптечных

или технических весах, работа с которыми опи-

сывается в соответствующих заводских инструк-

циях и специальных руководствах. Заметим

только, что аналитические весы должны быть

установлены на капитальных стенах по возмож-

ности дальше от нагревательных и отопительных

приборов, а также шахт лифтов; устанавливает

и юстирует весы метрологическая служба, кото-

рая выдает соответствующий документ (пас-

порт). Необходимо систематически проверять

разновесы и делать об этом запись в паспорте.

8

Взвешивание — вполне надежная процедура,

которая, как правило, не служит источником

ошибок, однако и здесь необходимы тщатель-

ность и определенный навык.

Лабораторные центрифуги могут иметь два

типа роторов: угловые и с подвесными стаканчи-

ками; часто одна и та же центрифуга снабжа-

ется несколькими сменными роторами, рассчи-

танными на разное количество пробирок. В угло-

вом роторе гнезда для пробирок неподвижные,

расположены под углом около 45 " как во время

установки пробирок, так и во время вращения,

поэтому граница осадка идет косо, что затрудня-

ет отсасывание последних порций надосадочной

жидкости.

В роторе с подвесными стаканчиками до

начала вращения пробирки стоят вертикаль-

но, а во время вращения располагаются гори-

зонтально, поэтому осадок ложится точно на дно

пробирки и его граница строго перпендикулярна

длинной оси. Это облегчает количественное от-

деление осадка от надосадочной жидкости, од-

нако если осадок неплотный, то вследствие

толчков при остановке центрифуги может обра-

зоваться муть.

Каждая центрифуга обязательно снабжа-

ется прочным защитным кожухом, крышка кото-

рого должна быть закрыта во время работы.

Если пробирка длиннее, чем гнездо ротора, она

мешает крышке закрываться. У неопытных ра-

ботников возникает искушение включать цен-

трифугу с открытой крышкой; этого делать ни

в коем случае нельзя, так как под действием

центробежной силы пробирка может сломаться

и осколки стекла с большой силой разлететься

и поранить окружающих.

1.3. ЕДИНИЦЫ СИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

В I960 г. Генеральная конференция по мерам

и весам приняла Международную систему еди-

ниц— СИ (Systeme Internationale—SI) как

единую универсальную систему для всех отрас-

лей науки, техники и производства. Стандарт

СЭВ СТ СЭВ 1052-78 сЕдиницы физических

величин» предусматривает введение Междуна-

родной системы единиц в странах — членах

СЭВ с 1980 г. XXX сессия Всемирной ассамблеи

здравоохранения, состоявшаяся в 1974 г., реко-

мендует применять СИ во всех областях медици-

ны, включая практическое здравоохранение.

В основу СИ (табл. .1) положена метрическая

система. Название системы происходит от грече-

ского слова «метрон», что означает — мера. СИ

состоит из единиц трех типов: основных (7),

дополнительных (2), производных (табл. 2).

Т а б л и ц а 1. Основные единицы СИ

Величина

Длина

Масса

Время

Сила электри-

ческого тока

Термодинами-

ческая темпе-

ратура

Количество ве-

щества

Сила света

Единица

наимено-

вание

метр

килограмм

секунда

ампер

кельвин

моль

кандела

обозначение

между-

народ-

ное

m

kg

s

А

К

mol

cd

рус-

ское

м

кг

с

А

К

моль

кд

Дополнительные единицы — радиан и стера-

диан.

Производные единицы образуются из основ-

ных в соответствии с правилами Международ-

ной системы единиц. Сочетая две или более

Т а б л и ц а 2. Примеры производных единиц СИ

основных единиц, путем умножения или деления

можно получить производные единицы.

Сочетание основных единиц для образования

производных иллюстрирует одно из основных

преимуществ СИ. Внутри системы нет ни одного

коэффициента перевода, кроме 1. Поэтому такая

система называется когерентной (согласован-

9

Т а б л и ц а 3. Множители и приставки для

образования десятичных кратных и дольных

единиц и их наименований

ной) системой. Некоторым производным едини-

цам даны специальные названия — паскаль,

ньютон, джоуль и др. Единицы СИ, как основ-

ные, так и производные, могут быть для практи-

ческих целей неудобными по размерности. Поэ-

тому в табл. 3 приводятся 16 приставок, при

помощи которых возможно образование деся-

тичных кратных и дольных единиц.

Наряду с единицами СИ допускается приме-

нение ряда единиц без ограничения срока на-

равне с единицами СИ, в том числе тонна,

минута, час, сутки, литр. Другая группа единиц,

не принадлежавших СИ, была принята Гене-

ральной конференцией по мерам и весам для

использования на ограниченный период време-

ни: мм рт. ст., калория ,и др.

В клинической лабораторной диагностике

Международную систему единиц рекомендуется

применять в соответствии со следующими прави-

лами.

1. В качестве единиц объема следует приме-

нять литр. Не рекомендуется в знаменателе

применять дольные или кратные от литра (1 мл,

100 мл).

2. Концентрация измеряемых веществ указы-

вается как молярная (моль/л) или как массовая

концентрация (г/л).

3. Молярная концентрация используется для

веществ с известной относительной молекуляр-

ной массой. Ионная концентрация указывается

в виде молярной.

4. Массовую концентрацию используют для

веществ, относительная молекулярная масса ко-

торых неизвестна.

5. Плотность указывается в г/л; клиренс —

в мл/с.

6. Активность ферментов на преформиро-

ванное количество веществ по времени и объему

выражается как моль/(с- л); мкмоль/(с- л);

нмоль/(с-л).

При переводе единиц массы в единицы коли-

чества вещества (молярные) коэффициент пере-

Исходная единица

массы

грамм (г)

миллиграмм (мг)

микрограмм (мкг)

нанограмм (нг)

Соответствующая

единица количества

вещества (молярная)

моль (моль)

миллимоль (ммоль)

микромоль (мкмоль)

наномоль (нмоль)

1.4. ОЦЕНКА АНАЛИТИЧЕСКОЙ НАДЕЖНОСТИ  К Л И Н И Ч Е С К И Х

ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Качество результата лабораторного исследо-

вания зависит от многих факторов (качества

реактивов, оборудования, квалификации лабо-

рантов), важное значение имеет также и каче-

ство метода. Для объективной оценки аналити-

ческих качеств метода рекомендуется оценка его

аналитической надежности.

В отличие от системы контроля качества

работы лабораторий, которая должна давать

ежедневную информацию о качестве получае-

мых .в лаборатории результатов, оценка анали-

тической надежности метода — продолжитель-

ный процесс, во время которого постепенно

накапливается информация об аналитических

качествах метода. При оценке надежности мето-

да задача состоит в выявлении погрешностей,

зависящих от метода; поэтому важно оценку

надежности метода проводить не в одной, а в не-

скольких точно работающих (референтных) ла-

бораториях с соблюдением всех указаний по

применению метода.

Количественные аналитические методы кли-

нических лабораторных исследований разнооб-

разны и используются для определения различ-

ных веществ, поэтому описываемые способы

оценки надежности метода могут быть пригодны

не для всех методов. Оценке аналитической на-

дежности должны подвергаться методы, реко-

мендуемые для официального утверждения, но-

вые и существенно модифицированные методы.

Основными критериями, по которым оцени-

вается метод, являются следующие: воспроизво-

димость, правильность, специфичность, чувстви-

тельность.

10