содержание .. 5 6 7 8 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 7
концентрация вещества×количество частиц
Осмолярность
=
,
молекулярная масса
где:
концентрация вещества
- количество растворенного вещества на литр
раствора, в граммах;
количество частиц — число частиц или ионов, образующихся при растворении
одной молекулы вещества.
# Единицей осмолярности является осмоль на литр раствора (осмоль/л), но на
практике обычно используется единица миллиосмоль на литр раствора
(мосмоль/л).
# При повышении концентрации раствора взаимодействие между
частицами вещества возрастает и фактическая осмолярность понижается по
сравнению с осмолярностью идеального раствора. Теоретический расчет
осмолярности растворов веществ с большой молекулярной массой (например,
белковых гидролизатов) и высококонцентрированных растворов невозможен. В
таких случаях определяют осмоляльность экспериментальным путем по
понижению температуры замерзания раствора или по понижению давления
пара над раствором. Понижение температуры замерзания на 1.86°С и понижение
давления пара на 0.3 мм рт.ст. при температуре 25°С соответствует 1 осмолю на
килограмм воды.
# Растворы, равные по осмоляльности (осмолярности) 0.9 % раствору
натрия хлорида, называют изотоничными.
# Наряду с прибором, описанным выше, для определения осмоляльности
могут использоваться также осмометры, основанные на измерении давления
пара над раствором. Они требуют малого объема вводимой пробы (около 5
мкл), при этом точность и правильность определения сравнима с величинами,
получаемыми на приборах, основанных на измерении температуры замерзания.
# В осмометрах, основанных на измерении понижения температуры
замерзания, объем вводимой пробы образца можно варьировать.
# Указание значения осмоляльности
(осмолярности) в маркировке
препаратов. Значение осмоляльности (осмолярности) необходимо указывать на
этикетках инфузионных растворов.
2.2.36. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИОНСЕЛЕКТИВНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ
Теоретически потенциал Е ионселективного электрода изменяется линейно
от логарифма активности ai данного иона, что выражается уравнением Нернста:
RT
Е=
Е
о
+
2,303
loga
i
,
z
i
F
где:
Ео - стандартный электродный потенциал используемого электрода;
R - универсальная газовая постоянная;
Т - абсолютная температура;
F - число Фарадея;
zi - величина заряда иона с обозначением его знака.
При постоянной ионной силе выполняется уравнение:
k
Е=
Е
о
+
log
fC
i
,
z
i
где:
Сi - молярная концентрация иона;
f - коэффициент активности (ai = fCi);
RT
k =
F
если:
k
k
E +
log
f
=
E
`
и
S
=
,
o
o
z
i
z
i
где:
S - наклон калибровочной кривой электрода (наклон электродной функции),
в таком случае выполняется уравнение:
E=E
`
+SlogC
и для
-logC
= pC
:
E=E
`
- SpC
o
i
i
i
o
i
Потенциомтрическое определение концентрации иона проводят путем
измерения разницы потенциалов между двумя подходящими электродами,
погруженными в испытуемый раствор; индикаторный электрод является
селективным по отношению к анализируемому иону, другой является электродом
сравнения.
Прибор. Используют вольтметр, позволяющий выполнять измерения с
точностью 0,1 милливольта, с входным сопротивлением в 100 раз превышающим
сопротивление используемых электродов.
Ионселективные электроды
- преимущественно электроды с
кристаллической или некристаллической мембраной или с твердой основой
(например, стеклянные электроды) или электроды с заряженными (положительно
или отрицательно) или с незаряженными подвижными носителями или с
сенсибилизированными электроды
(субстрат-энзимные электроды, газ-
индикаторные электроды). Электродом сравнения обычно являются
хлорсеребряный или каломельный электрод с подходящими соединяющими
жидкостями, исключающими их перемешивание.
Методика. Измерения проводят при постоянной температуре с точностью
+0,5оС, обеспечивая изменение наклона электродной функции электрода от
температуры (см. Табл.2.2.36-1).
Таблица 2.2.36.1.
Значения k при разных температурах
Температура (оС)
k
20
0,0582
25
0,0592
30
0,0602
Ионную силу и, если необходимо, рН испытуемого раствора регулируют,
используя буферные растворы, указанные в частной статье; электрод погружают в
испытуемый раствор, который свободно перемешивается с постоянной скоростью и
добиваются постоянства потенциала.
Если электродная система используется часто, то регулярно проверяют
воспроизводимость и стабильность сигнала, линейность калибровочной кривой или
расчетного алгоритма в пределах концентраций испытуемого раствора; если нет, то
проводят проверку перед каждой серией измерений.
Показания электрода можно считать линейными, если наклон S
калибровочной кривой приблизительно равен k/zi на единицу pCi.
МЕТОД I (МЕТОД ПРЯМОЙ ГРАДУИРОВКИ)
Измеряют последовательно не менее трех раз потенциалы не менее трех
растворов сравнения предположительно близких концентраций к испытуемому
раствору. Рассчитывают и затем строят градуировочный график в координатах:
среднее значение потенциала Е - соответствующее ему значение концентрации
анализируемого иона, выраженное как: -log Ci или pCi.
Приготавливают испытуемый раствор, как указано в частной статье;
измеряют потенциал три раза и по среднему значению потенциала рассчитывают
концентрацию анализируемого иона, используя градуировочный график.
МЕТОД II (МЕТОД МНОГОРАЗОВЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК)
Приготавливают испытуемый раствор, как указано в частной статье.
Измеряют равновесный потенциал ЕТ в объеме VТ этого раствора с неизвестной
концентрацией СТ анализируемого иона. Не менеее трех раз последовательно к
объему VТ испытуемого раствора прибавляют объем VS раствора сравнения,
незначительный в сравнении с VТ
(VS ≤ 0,01 VТ), с концентрацией СS, значения
которой находятся в пределах линейной части градуировочного графика. После
каждого прибавления измеряют потенциал и рассчитывают разницу потенциалов
∆Е между измеряемым потенциалом и ЕТ.
∆Е связано с концентрацией
анализируемого иона уравнением:
DE
C
V
C
V
S
S
S
S
S
DE =S
log(
1+
)
или
10
=1+
,
C
V
C
V
T
T
T
T
VT - объем испытуемого раствора;
CT - концентрация анализируемого иона в испытуемом растворе;
VS - объем прибавляемого раствора сравнения;
CS - концентрация анализируемого иона в растворе сравнения;
S
- наклон электродной функции, установленный экспериментально при
постоянной температуре путем измерения разницы потенциалов, полученной
из двух растворов сравнения, концентрации которых отличаются в 10 раз и
рассчитаны в пределах области градуировочного графика.
DE
S
Строят график
10
(ось y) относительно VS
(ось - х) и экстраполируют
полученную линию до пересечения с осью - х. В точке пересечения концентрацию
CT анализируемого иона в испытуемом растворе рассчитывают по уравнению:
C
S
V
S
C =
,
T
T
V
при этом величина VS соответсвует точке пересечения экстраполированной прямой
с осью х.
МЕТОД III (МЕТОД ОДНОЙ СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ)
К объему VТ испытуемого раствора, приготовленного, как указано в частной
статье, прибавляют объем VS раствора сравнения, вмещающего такое количество
анализируемого иона, чтобы сигнал находился в линейной части калибровочного
графика. Параллельно в тех же условиях готовят контрольный раствор.
Потенциалы испытуемого раствора и контрольного раствора измеряют не менее
трех раз перед прибавлением и после прибавления раствора сравнения.
Рассчитывают концентрацию CT анализируемого иона, используя уравнение с
учетом необходимости коррегирования для контрольного раствора:
C
V
S
S
C
T
=
,
DE
S
10
(V
T
+
V
S
) -
V
T
где:
VT - объем испытуемого раствора или контрольного раствора;
CT - концентрация анализируемого иона в испытуемом растворе;
VS - объем прибавляемого раствора сравнения;
CS - концентрация анализируемого иона в растворе сравнения;
∆Е -среднее значение разницы потенциалов, измеренных до и после прибавления
объема VS ;
S - наклон электродной функции, установлен экспериментально при постоянной
температуре путем измерения разницы потенциалов, полученной из двух
растворов сравнения, концентрации которых отличаются в
10 раз и
рассчитаны в пределах области калибровочной кривой.
2.2.37. РЕНТГЕНОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ
Рентгенофлуоресцентная спектрометрия с волновой дисперсией - это метод
анализа, в котором измеряют интенсивность флуоресцентного излучения,
испускаемого элементом, имеющим атомный номер от 11 до 92, возбуждаемого
непрерывным первичным
рентгеновским
излучением.
Интенсивность
флуоресценции элемента зависит от его концентрации в образце, а также от
поглощения матрицей возбуждающего и испускаемого излучения. При следовых
количествах определяемого вещества, в области линейности градуировочного
графика, измеренная при определённой длине волны интенсивность
флуоресценции элемента, находящегося в матрице определённого состава, прямо
пропорциональна концентрации данного элемента и обратно пропорциональна
массовому коэффициенту ослабления
(поглощения) матрицы при этой длине
волны.
Методика. Настройку и использование прибора проводят в соответствии с
инструкциями производителя. Жидкие образцы помещают непосредственно в
прибор; твёрдые образцы предварительно прессуют в таблетки (гранулы), иногда
после смешивания с подходящим связывающим материалом.
Для определения концентрации элемента в образце измеряют скорость счёта
для нескольких стандартных образцов, содержащих известные количества данного
элемента в матрицах определённого состава, и рассчитывают или измеряют
массовый коэффициент ослабления матрицы анализируемого образца.
Градуировка. С помощью градуировочного раствора или серии растворов,
содержащих разные концентрации определяемого элемента в различных матрицах,
определяют угловой коэффициент градуировочного графика b0 по уравнению:
N
1
I
C
b
=
0
m
C
M
μм - рассчитанный или измеренный массовый коэффициент ослабления матрицы
M,
N
I
- скорость счёта,
C
C - концентрация определяемого элемента в стандартном образце.
Массовый коэффициент ослабления матрицы образца. Если эмпирическая
формула анализируемого образца известна, его массовый коэффициент
ослабления рассчитывают исходя из справочных значений массовых
коэффициентов ослабления составляющих элементов. Если элементный состав
образца неизвестен, измеряют интенсивность рассеянного рентгеновского
излучения IU
(Комптоновское рассеяние) и рассчитывают величину массового
коэффициента ослабления матрицы образца по уравнению:
1
= a + bI
U
m
MP
μMP - массовый коэффициент ослабления образца,
IU - рассеянное рентгеновское излучение.
Определение скорости счёта для определяемого элемента в образце.
Рассчитывают скорость счёта I N
для определяемого элемента по измеренным
EP
интенсивностям флуоресцентной линии и фоновой линии (линий).
Расчёт содержания следов. Если концентрация элемента входит в область
линейности градуировочного графика, её можно рассчитать по уравнению
N
I
EP
C
=
¥
f
1
b
0
m
MP
f
= фактор разбавления.
2.2.38. УДЕЛЬНАЯ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТЬ
Удельная электропроводность раствора (k) - величина обратная удельному
сопротивлению
(ρ). Удельное сопротивление определяют
как отношение
напряженности электрического поля к плотности тока. Сопротивление R
(Ω)
проводника, имеющего площадь сечения S (см2) и длину L (см), вычисляют по
формуле:
L
R=r
S
Таким образом,
1
L
1
L
R
=
или
k
=
k
S
R
S
Единица удельной электропроводности в системе СИ - сименс на метр
(См·м-1). На практике удельную электропроводность растворов выражают в
сименсах на сантиметр (См · см-1) или в микросименсах на сантиметр (мкСм · см-1).
Единица удельного сопротивления в системе СИ - ом-метр (Ом · м). На практике
обычно используют часть единицы - ом-сантиметр (Ом · см). Если нет других
указаний в частной статье, значение удельной электропроводности или удельное
сопротивление обозначают для температруры 20оС.
Прибор. Принцип работы используемого прибора
(кондуктомера или
омметра) основан на измерении удельной электропроводности столба жидкости
между электродами
иммерсионного
измерительного
приспособления
(электропроводной камеры). Для избежания поляризации электродов используют
переменный ток. Прибор снабжают температурным компенсатором или
прецизионным термометром.
Измерительная камера вмещает два платиновых электрода, покрытых
платиновой чернью, электроды с площадью поверхности S располагаются
параллельно один к другому на расстоянии L. Обычно, оба электрода защищены
стеклянной трубкой, обеспечивающей хороший ионный обмен между раствором и
электродами.
Постоянная измерительной камеры С (см-1) рассчитывается по формуле:
L
C=a
,
S
где:
a - безразмерный числовой коэффициент, зависящий от конструкции камеры.
Реактивы. Готовят три стандартных раствора калия хлорида Р, содержащих
соответственно 0,7455 г, 0,0746 г и 0,0149 г калия хлорида Р в 1000,0 г раствора. В
качестве растворителя используют воду, свободную от диоксида углерода, Р,
приготовленную из воды дистиллированной Р, электропроводность которой не
превышает 2 мкСм · см-1.
Значения удельной электропроводности и удельного сопротивления
растворов при температуре 20оС приведены в Табл. 2.2.38.1.
Таблица 2.2.38.1.
Значения удельной электропроводности и удельного сопротивления раствора
калия хлорида
Концентрация г/1000,0 г
Удельная
Удельное
раствора
электропроводность
сопротивление Ом · см
мкСм · см-1
0,7455
1330
752
0,0746
133,0
7519
0,0149
26,6
37594
Если измерения не могут быть проведены при температуре 20оС, значения
электропроводности растворов калия хлорида, указанные в Табл.
2.2.38.1,
корректируют по уравнению, действующем в температурном интервале (20+5)оС:
СТ = С20 [1 + 0,021 (Т-20)],
где:
Т - температура, при которой проводят измерения, указанная в частной статье;
СТ - электропроводность раствора при ТоС;
С20 - электропроводность раствора при температуре 20оС.
ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
Определение постоянной камеры
Выбирают измерительную камеру, соответствующую электропроводности
испытуемого растора. Чем выше ожидаемая электропроводность, тем большей
должны быть постоянная камеры (ниже ρ), то есть измеряемое значение R должно
быть настолько высоким, насколько позволяет используемый прибор. Обычно
определения измерительной камеры имеют постоянную порядка 0,1 см-1, 1 см-1 и 10
см-1. Определяют тот из стандартных растворов калия хлорида Р, который больше
подходит для проведения измерений. Измерительную камеру несколько раз
промывают водой, свободной от диоксида углерода, Р, приготовленной из воды
дистиллированной Р, и по крайней мере дважды раствором калия хлорида,
используемого для определения постоянной камеры. Измеряют удельное
сопротивление заполненной раствором калия хлорида камеры при температуре
(20+0,1)оС или при температуре, указанной в частной статье. Постоянную С (см-1)
измерительной камеры рассчитывают по формуле:
С = RKCl · k KCl ,
где:
RKCl - сопротивление измерений в мегоомах;
k KCl - электропроводность используемого стандартного раствора калия хлорида Р,
в мкСм · см-1.
Измеренное значение постоянной С камеры не должно отличаться от
указанного более, чем на 5%.
Определение удельной электропроводности испытуемого раствора
После того, как прибор откалиброван с использованием одного из
стандартных растворов, измерительную камеру промывают несколько раз водой,
свободной от диоксида углерода, Р, приготовленной из воды дистиллированной Р,
и по крайней мере дважды водным испытуемым раствором при температуре
(20+0,1)оС или при температуре, указанной в частной статье. Затем измерения
проводят так, как указано в частной статье.
2.2.39. МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕКСТРАНОВ
Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (2.2.30).
Испытуемый раствор.
0,200 г испытуемой субстанции растворяют в
подвижной фазе и доводят объем раствора этим же растворителем до 10 мл.
Маркерный раствор. 5 мг глюкозы Р и 2 мг декстрана Vo ФСО растворяют в
1 мл подвижной фазы.
Градуировочные растворы. Навеску каждого из указанных стандартных
образцов: 15 мг декстрана 4 для градуировки ФСО, 15 мг декстрана 10 для
градуировки ФСО, 20 мг декстрана 40 дляградуировки ФСО, 20 мг декстрана 70
для градуировки ФСО и 20 мг декстрана 250 для градуировки ФСО отдельно
растворяют в 1 мл подвижной фазы.
# Возможно использование стандартных образцов декстранов для
градуировки с другими паспортными данными
М
w
, в этом случае для градуировки
хроматографической системы рекомендуется использовать дополнительно еще не
менее двух стандартных образцов декстранов.
# Условия хроматографирования как, например, размер и количество
колонок, тип сорбента, состав и скорость подвижной фазы, объем вводимой пробы
и другие параметры, указываются в частных статьях и могут варьировать. При этом
должны выполняться требования к градуировке и условия теста
«Проверка
пригодности хроматографической системы»
Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. 20 мг
декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы ФСО
(для анализа субстанции декстрана 40) или 20 мг декстрана 60/70 для проверки
пригодности хроматографической системы ФСО
(для анализа субстанций
декстрана 60 и декстрана 70) растворяют в 1 мл подвижной фазы.
Хроматографирование может быть проведено на хроматографе с
дифференциальным рефрактометрическом детектером при следующих условиях:
- колонка, заполненная агарозой поперечно-сшитой для хроматографии Р или
серий колонок размером 0,3 м х 10 мм каждая, заполненные полиэфирным
гидроксилованным гелем для хроматографии Р;
- подвижная фаза: раствор
7 г натрия сульфата безводного Р и
1 г
хлорбутанола Р в 1 л воды Р;
- скорость подвижной фазы от
0,5 мл/мин до
1 мл/мин, поддерживаемая
постоянно с точностью +1% в час;
- петлевой дозатор с объемом петли от 100 мкл до 200 мкл;
- температура системы поддерживается постоянной с точностью +0,1оС.
ГРАДУИРОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Хроматографируют несколько раз выбранный объем маркерного раствора.
На хроматограмме должны присутствовать два пика: первый пик соответствует
декстрану Vо ФСО, второй пик соответствует декстрозе (глюкозе) Р. Исходя из
объема элюирования декстрана Vо, рассчитывают объем эксклюзии Vо; полный
объем Vt рассчитывают по пику, соответствующему глюкозе.
Хроматографируют определенный объем каждого из градуировочных
растворов. Для каждой полученной хромотограммы проводят базовую линию,
обращая внимание на правильнойть определения начала и конца пика. Каждую
хроматограмму делят вертикальными равноудаленными линиями на р секций
(количеством не менее 60), что соответствует равным объемам элюирования. Для
каждой секции i, соответствующей объему элюирования Vi, измеряют высоту (yi) от
базовой линии до линии хроматограммы и рассчитывают коэффициенты
распределения (Кi) по формуле:
(V
i
-V
o
)
K
=
,
(1)
i
(V
t
-V
o
)
где:
Vo - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему декстрану Vo
ФСО на хроматограмме маркерного раствора ;
Vt
- полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на
хроматограмме маркерного раствора;
Vi
- объем элюирования для секции i, полученный для хроматограммы каждого из
градуировочных растворов.
Градуировку проводят, используя один из следующих методов.
Градуировка по градуировочному графику. По уравнению (1) для каждого из
декстранов для градуировки рассчитывают коэффициент распределения Кmax,
соответствующий
максимальной
высоте
пика
хроматограммы.
На
полулогарифмической бумаге строят зависимость значений Кmax (ось абсцисс) от
молекулярной массы для максимальной высоты пика (Мmax) каждого из декстранов
для градуировки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят
первую градуировочную линию, экстраполируя ее из точки Кmax, полученной для
декстрана 250 для градуировки ФСО, до более низких значений К, полученных для
тех же стандартных растворов (см. Рис. 2.2.39.-1).
Рис. 2.2.39.1. Пример градуировочного графика
Пунктиром указана часть градуировочного графика,
полученная экстраполированием. Горизонтальными
линиями в нижней части рисунка указаны ширина и
положения хроматографических линий, полученных для
каждого декстрана для градуировки
Используя полученный первый градуировочный график, находят для всех
значений Кi для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс
Мi, получая в таком способе графическую зависимость для рассчета молекулярно-
массового распределения. Для всех декстранов для градуировки расчитывают
среде массовую молекулярную массу
М
w
по уравнению (3), приведенному ниже.
Градуировочный график может быть использован для расчетов, если расчеты
значения
М
w
для каждого из декстранов для градуировки не отличаются от
указанных в паспорте значений больше чем на 5% и средние отклонения для всех
декстранов не превышает
+3%. Если данные условия не выполняются,
градуировочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные
операции пока рассчитанные и указанные в паспорте значения
М
w
будут
отличаться не более чем на 5%.
Градуировка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и
(3), приведенных ниже, и подходящего метода
(возможно использование
итеративного метода Гаусса-Ньютона, модифицированного метода Хартли. Также
возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые
используют принцип нелинейного регрессивного анализа) рассчитывают значения
коэффициентов b1, b2, b3, b4 и b5, для которых полученные значения
М
w
могут
отличаться не более чем на 5% от соответственных паспортных значений
М
w
для
каждого декстрана для калибровки и должны быть 180+2 для глюкозы.
# При расчетах
М
w
глюкозы в уравнении (2) допускают Кi=1.
2
3
(b
4
+b
1
×K
1
+b
2
×K
i
+b
3
×K
i
)
Мi = b5 + е
(2)
p
(y
M
)
Â
i
i
i+1
Mw
=
,
p
(3)
Â
yi
i
=1
n
y
M
)
Â(
i
i
i+1
Mw
=
,
n
(4)
y
Â
i
i=
1
где:
р - число секций, на которые поделена хроматограмма;
уi - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;
Мi - молекулярная масса для секции i.
ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Хроматографируют выбранный объем соответствующего раствора для
проверки пригодности хроматографической системы.
Средняя молекулярная масса декстрана для проверки пригодности
ФСО. Рассчитывают значение
М
w
,
как указано в разделе
«Градуировка
хроматографической системы» используя или градуировочный график, или
значения коэффициентов b1, b2, b3, b4 и b5. Результаты анализа считаются
достоверными, если полученное значение
М
w
находится в пределах:
- от 41000 до 47000 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);
- от 67000 до 75000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).
Средняя молекулярная масса
10% высокомолекулярной фракции
декстрана. Значение
М
w
для
10% высокомолекулярной фракции декстрана,
которая элюируется в секциях от 1 до n включительно, рассчитывают по формуле:
n
y
M
)
Â(
i
i
i
=1
Mw
=
,
n
(4)
y
Â
i
i
=1
где:
n - номер секции, для которой выполняются неравенства:
n
p
Ê
ˆ
у
i
£
,
Á
у
i
˜
(5)
Â
Á
Â
˜
i
=1
Ë i=
1
¯
n +1
p
Ê
ˆ
у
i
Ò
0,
1Á
у
i
˜,
(6)
Â
Á
Â
˜
i
=1
Ë i=
1
¯
где:
р - количество секций, на которые разделена хроматограмма;
уi - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;
Мi - молекулярная масса для секции i.
Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение
М
w
для 10% высокомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:
- от 110000 до 130000 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);
- от 190000 до 230000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).
Средняя молекулярная масса 10% низкомолекулярной фракции декстрана.
Значение
М
w
для
10% низкокомолекулярной фракции декстрана, которая
элюируется в секциях хроматограмм от секции р до секции m включительно,
рассчитывают по формуле:
р
y
M
)
Â(
i
i
i=m
Mw
=
,
p
(7)
Â
yi
i=m
где:
m - номер секции, для которой выполняются неравенства:
p
p
Ê
ˆ
у
i
£
,
Á
у
i
˜
(8)
Â
Á
Â
˜
i
=
m
Ë i=
1
¯
p
p
Ê
ˆ
у
i
Ò
0,
1Á
у
i
˜,
(9)
Â
Á
Â
˜
i
=m
-1
Ë
i
=1
¯
где:
р - количество секций, на которые разделена хроматограмма;
уi - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;
Мi - молекулярная масса для секции i.
Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение
w
М
для 10% низкомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:
- от 6000 до 8500 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);
- от 7000 до 11000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).
# Параллельно с раствором проверки пригодности хроматографической системы
хроматографируют также маркерный раствор.
# Для получения более надежных результатов в частных статьях рекомендуется
регламентировать такие отношения сигнал/шум, степень разделения пиков
декстрана 40 и глюкозы, эффективность пика глюкозы и близость расчета
М
w
для
повторных хроматограмм для проверки пригодности хроматографической системы.
МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ДЕКСТРАНА
Хроматографируют выбранный объем испытуемого раствора и значение
М
w
для молекулярно-массового распределения декстрана, значение
М
w
для 10%
высокомолекулярной фракции декстрана и значение
М
w
для
10%
низкомолекулярной фракции декстрана, рассчитывают, как описано в разделе
«Пригодность хроматографической системы».
# Параллельно с испытуемым раствором хроматографируют маркерный
раствор.
# Полученные результаты молекулярно-массового распределения округляют
до 10 значащих единиц.
# В настоящей документации к декстранам для градуировки ФСО и к
декстрану для проверки пригодности ФСО приводятся паспортные значения средне
массовой молекулярной массы
w
М
, значения молекулярной массы в максимуме
пика, а также пределы для средней молекулярной массы, средней молекулярной
массы для 10% высокомолекулярной фракции декстрана и средней молекулярной
массы для 10% низкомолекулярной фракции декстрана.
2.2.40. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ БЛИЖНЕГО ИК-ДИАПАЗОНА
Спектрофотометрия ближнего ИК-диапазона
- метод, который особенно
полезен для идентификации органических веществ. Несмотря на то, что такие
спектры ограничены поглощением связей C-H, N-H, O-H и S-H, они, обычно, имеют
высокую информативность. Спектры зависят от различных параметров, таких как
размер частиц, полиморфизм, остаточные растворители, влажность, которые не
всегда могут быть учтены. По этой причине прямое сравнение спектра вещества и
спектра образца сравнения обычно невозможно и требуется проведение
соответствующей валидированной математической обработки полученных данных.
АППАРАТУРА
Спектрофотометры, предназначенные для получения спектров в ближнем
ИК-диапазоне, состоят из:
- фильтра, дифракционной решётки или интерферометра, способных обеспечить
целый диапазон электромагнитного излучения в области приблизительно от 780 нм
до 2500 нм (12821 см−1 до 4000 см−1),
- устройств сбора и измерения интенсивности прошедшего или отражённого
излучения
(пропускание или отражение), таких как интегрирующая сфера,
оптоволоконный датчик и т.д., соединённых с соответствующим детектором,
- устройств математической обработки полученных спектральных данных.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА
Для измерения пропускания. Данный способ обычно используется в случае
разбавленных или неразбавленных жидкостей, а также твёрдых веществ,
находящихся в растворе.
Пробы исследуют в кювете с подходящей длиной оптического пути (обычно
от
0,5 мм до 4 мм), прозрачной для излучения ближнего ИК-диапазона либо
погружают в них оптоволоконный датчик подходящей конфигурации, которая
создаёт спектр в области пропускания совместимой со спецификациями прибора и
соответствующей предполагаемой цели.
При получении спектров жидкой пробы в ближнем ИК-диапазоне должны
приниматься во внимание возможность зависящих от температуры отклонений
спектров или любых других эффектов, оказывающих влияние на спектры.
Во всех случаях способом, соответствующим оптической конфигурации
прибора, должны быть внесены поправки, учитывающие влияние фона, например,
из спектра исследуемой пробы может быть вычтен спектр сравнения воздуха (для
жидкостей) или растворителя (для растворов).
Для измерения диффузного отражения. Данный способ обычно
используется для твёрдых тел.
Пробы исследуют с помощью подходящего устройства. При помещении в
пробу оптоволоконного датчика следует обращать внимание на положение датчика,
необходимо, чтобы в течение получения спектра он оставался неподвижным и
чтобы условия измерения были как можно более воспроизводимыми от одной
пробы к другой.
Во всех случаях способом, соответствующим оптической конфигурации
прибора, должны быть внесены поправки, учитывающие влияние фона, например,
из спектра исследуемой пробы должен быть вычтен спектр внутреннего или
внешнего стандарта отражения.
Следует также учитывать размер частиц и степень гидратации или
сольватации.
Для измерения двойного пропускания Данный способ обычно
используется в случае разбавленных или неразбавленных жидкостей, а также
твёрдых веществ, находящихся в растворе или суспензии.
Исследуемую пробу помещают в кювету с подходящим диффузным
отражателем, сделанным из металла либо из инертного вещества (например, оксид
титана), не дающего спектра в ближнем ИК-диапазоне, и введённого в подходящей
концентрации в пробу. Пробы исследуют так, как описано для измерения
пропускания или диффузного отражения.
КОНТРОЛЬ ЗА РАБОТОЙ ПРИБОРА
При использовании прибора следуют инструкциям производителя; регулярно,
в зависимости от применения прибора и исследуемых веществ, проводят
предписанные испытания.
Проверка шкалы длин волн
(кроме прибора, оснащённого
светофильтром). Используемую шкалу длины волны, обычно в области между 780
нм и 2500 нм, проверяют с помощью подходящего стандарта (стандартов) длин
волн, который имеет характеристические максимумы при исследуемых длинах
волн; такими стандартами могут быть, например, полистирол или оксиды
редкоземельных элементов.
Проверка повторяемости
(сходимости) длин волн
(кроме прибора,
оснащённого светофильтром). Повторяемость длин волн проверяют с помощью
подходящего стандарта
(стандартов), например, полистирола или оксидов
редкоземельных элементов. Стандартное отклонение длин волн зависит от
спецификации спектрофотометра.
Проверка повторяемости отклика. Повторяемость отклика проверяют с
помощью подходящего стандарта
(стандартов), например, отражающих
термопластических смол, покрытых сажей. Стандартное отклонение отклика
зависит от спецификации прибора.
Проверка фотометрического шума. Для определения фотометрического
шума используют подходящий стандарт отражения, например, отражающие
керамические плитки или отражающие термопластические смолы. Сканируют
стандарт отражения в соответствии с рекомендациями производителя
спектрофотометра и рассчитывают фотометрический шум пика к пику либо при
данной длине волны. В последнем случае фотометрический шум характеризуется
стандартным отклонением откликов. Фотометрический шум зависит от
спецификации прибора.
СОЗДАНИЕ СПЕКТРАЛЬНОЙ БИБЛИОТЕКИ СРАВНЕНИЯ
Снимают спектры подходящего числа серий веществ, полностью
исследованных, как описано в монографии материалов, и которые имеют отличия
(например, в производителе, размерах частиц) типичные для анализируемого
материала.
Набор спектров даёт информацию, которая определяет границы подобия для
данного вещества в спектральной базе данных, которая используется для
идентификации вещества. Число веществ в базе данных зависит от особенностей
её применения
Коллекция спектров в базе данных может быть представлена различными
способами, определяемыми математической методикой, используемой для
идентификации. Это могут быть:
- индивидуальные спектры, представляющие вещество,
- усреднённые спектры для каждого вещества и описание их изменчивости.
Селективность базы данных, которая позволяет положительно
идентифицировать данный материал либо достоверно отличить его от других
материалов, содержащихся в базе данных, должна быть установлена во время
процедуры. Для уверенности в пригодности базы данных эта селективность должна
регулярно проверяться; в особенности это необходимо делать после любых
значительных изменений, произошедших с веществом, например, изменение
поставщика или производственного процесса.
База данных пригодна только для исходного прибора, либо для подобного
прибора при условии определения того, что перенесенная на прибор база данных
остаётся пригодной.
Методика. Подготовку и исследование пробы проводят таким же образом,
как и при создании базы данных. Для облегчения сравнения спектров могут быть
использованы подходящие математические преобразования lg (1/T) или lg (1/R)
спектра для образца и спектральной библиотеки сравнения, например, получение
второй производной.
Сравнение преобразований спектров исследуемого образца и спектральной
библиотеки сравнения включает использование подходящей методики
хемометрической классификации.
2.2.41. КРУГОВОЙ ДИХРОИЗМ
Круговым дихроизмом называют разность оптических плотностей в пределах
полосы поглощения для света с левой и правой круговой поляризацией, присущую
оптически активным веществам.
Прямое измерение даёт величину:
DA =
A
-
A
L
R
ΔA
-
оптическая плотность кругового дихроизма,
AL
-
оптическая плотность для света с левой круговой поляризацией,
AR
-
оптическая плотность для света с правой круговой поляризацией.
Круговой дихроизм рассчитывают по уравнению:
DA
De = e
-e
=
L
R
c¥l
Δε
-
молярный круговой дихроизм или молярный дифференциальный
дихроичный коэффициент поглощения, выраженный в л×моль-1 ×см-1,
εL
-
молярный коэффициент поглощения (2.2.25) для света с левой круговой
поляризацией,
εR
-
молярный коэффициент поглощения для света с правой круговой
поляризацией,
c
-
концентрация вещества в исследуемом растворе в моль×л−1,
l
-
длина оптического пути в сантиметрах.
Для характеристики кругового дихроизма могут быть также использованы
следующие единицы:
Фактор диссимметрии:
De
g
=
e
ε
-
молярный коэффициент поглощения (2.2.25).
Молярная эллиптичность:
Некоторые типы приборов непосредственно показывают величину
эллиптичности Θ, выраженную в градусах. При использовании таких приборов
молярная эллиптичность [Θ] может быть рассчитана по следующему уравнению:
Q
¥
M
[Q] =
c¥l
¥10
[Θ]
-
молярная эллиптичность, выраженная в градус×см2×децимоль−1,
Θ
-
величина эллиптичности, показываемая прибором,
M
-
относительная молекулярная масса исследуемого вещества,
c
-
концентрация исследуемого вещества в растворе в г/мл,
l
-
длина оптического пути в сантиметрах.
Молярная эллиптичность также связана с молярным круговым дихроизмом
следующим уравнением:
4500
[Q]=
2,303De
ª 3300De
p
Молярная эллиптичность часто используется при анализе белков и
нуклеиновых кислот. В этом случае молярная концентрация, выраженная в
единицах мономерных остатков, рассчитывается, исходя из выражения:
молекулярная масса
число аминокислот
Для белков среднее значение относительной молекулярной массы
мономерного остатка составляет от 100 до 120 (в среднем 115), для нуклеиновых
кислот (в виде натриевой соли) - около 330.
Прибор. Источником света (S) является ксеноновая лампа (Рис. 2.2.41.-1);
свет проходит через двойной монохроматор
(M), снабжённый кварцевыми
призмами (P1, P2).
Рис. 2.2.41.-1. - Оптическая схема дихрографа
Линейный луч из первого монохроматора расщепляется на два компонента,
поляризуемые под правым углом вторым монохроматором. Дополнительный луч
устраняется выходной щелью монохроматора.
Поляризованный и монохроматический свет
проходит
через
двоякопреломляющий модулятор (Cr): в результате образуется переменный свет с
круговой поляризацией.
Затем луч проходит через исследуемый образец
(C) и попадает на
фотоумножитель
(PM), за которым следует усилитель, производящий два
электрических сигнала: один постоянного тока Vc, а другой переменного тока с
частотой модуляции Vac характерной для исследуемого образца. Фаза является
показателем кругового дихроизма. Отношение Vac/Vc пропорционально
дифференциальной оптической плотности ΔA, которая создаётся сигналом.
Дихрограф обычно позволяет проводить измерения в диапазоне длин волн от 170
до 800 нм.
Градуировка прибора. Точность шкалы оптической плотности.
Растворяют 10,0 мг изоандростерона R в диоксане R и доводят до 10,0 мл этим же
растворителем. Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 280
нм до 360 нм. Величина Δε, измеренная в максимуме при 304 нм, равна + 3,3.
Также может быть использован раствор (1S)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты
R.
Линейность модуляции. Растворяют 10,0 мг 1S)-(+)-10-камфорсульфоновой
кислоты R в воде R и доводят этим же растворителем до 10,0 мл. Определяют
точную концентрацию камфорсульфоновой кислоты в растворе методом УФ-
спектрофотометрии (2.2.25), используя величину удельного показателя поглощения
при 285 нм, равную 1,49.
Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 185 нм до 340
нм. Величина Δε, измеренная в максимуме при 290,5 нм, равна от + 2,2 до + 2,5, а
измеренная в максимуме при 192,5 нм - от - 4,3 до - 5.
Может быть использован (1S)-(+)- или его оптический изомер
-(1R)-(+)-
камфорсульфонат аммония R.
2.2.42. Плотность твердых тел
Плотность твердых тел соответствует их средней массе единицы объема и
обычно выражается в граммах на сантиметр кубический
(г/см3), хотя
международной единицей является килограмм на метр кубический (1 г/см3=1000
кг/м3).
В отличие от газов и жидкостей, плотность которых определятся только
температурой и давлением, плотность твердых тел зависит также от строения
молекул и поэтому изменяется в зависимости от структуры кристалла и степени
кристалличности.
В том случае, когда твердые частицы являются аморфными или частично
аморфными, их плотность зависит от способа получения и обработки.
Поэтому, в отличие от жидкостей, плотности двух химически эквивалентных
твердых веществ могут быть различными, и это отличие отражает
соответствующие различия в строении твердых тел.
Плотность частиц - важная физическая характеристика фармацевтических
субстанций.
Плотность твердой частицы может принимать различные значения в
зависимости от метода, используемого для измерения ее объема. Следует
различать три уровня выражения плотности:
- кристаллическая плотность, которая используется только для твердой
фракции материала; кристаллическую плотность также называют истинной
плотностью;
- плотность частиц, которая характеризует также объем пор внутри твердых
частиц;
- объемная плотность, которая включает объемы пустот между частицами,
образованные в слое порошка; объемную плотность называют также кажущейся
плотностью (насыпной массой).
Кристаллическая плотность - это средняя масса единицы объема вещества, не
считая всех пустот, которые не являются неотъемлемой характеристикой кристаллической
решетки вещества. Это свойство, присущее веществу и, поэтому ее величина не должна
зависеть от способа определения. Кристаллическая плотность может быть определена как
расчетным путем, так и путем простого измерения.
А. Расчетную
кристаллическую плотность
получают исходя из
кристаллографических данных (размер и состав элементарной ячейки) идеального
кристалла, например, при анализе дифракции рентгеновских лучей, и молекулярной
массы вещества.
В. Измеренная кристаллическая плотность - это отношение массы к объему,
определенных для монокристалла вещества.
Плотность частицы вещества
Плотность частицы вещества учитывает как кристаллическую плотность, так и
пористость частицы вещества (закрытые и открытые поры). Таким образом, плотность
частицы зависит от величины установленного объема, что в свою очередь зависит от
метода измерения. Плотность частицы вещества может быть установлена следующими
двумя методами.
А. Пикнометрическая плотность определяется путем измерения объема,
занимаемого известной массой порошкообразного вещества, который эквивалентен
объему газа, вытесненного веществом (для его определения используется пикнометр
газового вытеснения 2.9.23). Объем вещества, установленный таким способом, включает
объем, занимаемый открытыми порами, однако он не включает объем закрытых не
доступных для газа пор. Благодаря высокой диффузионной активности гелия, который
является наиболее предпочтительным для определения газом, большинство открытых
пор доступны для газа. Поэтому пикнометрическая плотность тонко измельченного
порошка, в общем, не сильно отличается от значений кристаллической плотности.
В. Плотность, установленная при помощи ртутного измерителя пористости, также
называемая гранулярной плотностью. В этом методе также не учитывается объем,
занимаемый закрытыми порами, однако объем открытых пор учитывается только для пор,
размер которых превышает некоторый предел. Значение этой предельной величины пор
зависит от давления, под которым подается ртуть во время измерения, и при обычных
условиях измерения ртуть не проникает в мельчайшие поры, доступные для гелия. Для
одного образца могут быть получены различные значения гранулярной плотности, так как
возможно определение плотности для каждого используемого рабочего давления, что
соответствует различным значениям предельных величин пор при различных давлениях.
Плотность (насыпная масса) при свободной засыпке и уплотнении
Плотность при свободной засыпке порошка учитывает вклад свободного объема
между частицами порошка. Следовательно, плотность при свободной засыпке зависит как
от плотности частиц порошка, так и от их пространственного расположения в слое
порошка.
Плотность при свободной засыпке зачастую очень сложно измерить, так как
самые незначительные нарушения в слое могут приводить к новому значению плотности.
Таким образом, важным требованием при сообщении значений насыпной плотности
является указание метода ее определения.
А. Значение плотности при свободной засыпке определяется измерением объема
известной массы порошка, прошедшего через сито, мерным цилиндром (2.9.15).
В. Плотность при уплотнении достигается путем механического постукивания
мерным цилиндром, содержащим образец порошка. После измерения начального объема
цилиндр подвергается механическому постукиванию, и наблюдение за объемом
продолжают до тех пор, пока дальнейшее изменение объема становится
незначительным (2.9.15).
2.2.43. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ
Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к
числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов
(m/z),
полученных из анализируемого вещества и находящихся в газовой фазе. Данное
отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой
массы нуклида 12С) или в дальтонах (1 Да = массе атома водорода).
Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются и перед попаданием
в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия
происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10−3 до
10−6 Па.
Результирующий
масс-спектр
является
графиком
зависимости
относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал,
отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими
статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такой сигнал
называется изотопным профилем, а пик
(по крайней мере, для небольших
молекул), представляющий наиболее распространённые изотопы для каждого
атома, - моноизотопным пиком.
Масс-спектрометрический анализ даёт важную качественную (определение
молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых
фрагментов) и количественную
(с использованием внешнего или внутреннего
стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля.
содержание .. 5 6 7 8 ..