содержание .. 3 4 5 6 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 5
Проверка шкалы волновых чисел. Шкала волновых чисел может быть
проверена с использованием пленки полистирола, которая имеет минимум
пропускания (максимум поглощения) при волновых числах (см-1), приведенных в
Табл. 2.2.24.-1.
Таблица 2.2.24.-1.
Минимумы пропускания (допустимые пределы)
пленки полистирола
3060,0 (+1,5) см-1
2849,5 (+1,5) см-1
1942,9 (+1,5) см-1
1601,2 (+1,0) см-1
1583,0 (+1,0) см-1
1154,5 (+1,0) см-1
1028,3 (+1,0) см-1
# Для проверки шкалы волновых чисел могут использоваться методики,
приведенные в инструкции к прибору.
Методика. Испытуемый образец готовят к испытанию согласно инструкции,
приложенной к эталонному спектру. Используя условия, при которых проводилась
проверка разрешающей способности, записывают спектр испытуемого образца и
поверх него полосы поглощения полистирольной пленки при 2849,5 см-1 (3,51 мкм),
1601,2 см-1 (6,25 мкм) и 1028,3 см-1 (9,72 мкм). Сравнивают два спектра (эталонный
и спектр испытуемого образца) и полосы поглощения пленки полистирола,
указанные выше. Положения значимых полос в спектре испытуемого образца и
эталонном спектре должны соответствовать в пределах 0,5% от шкалы волновых
чисел. Относительная величина полос обоих спектров должна согласовываться
между собой.
ПРИМЕСИ В ГАЗАХ
Для анализа примесей используют кювету, прозрачную для инфракрасного
излучения и имеющую соответствующую длину оптического пути (например, от 1 м
до 20 м). Кювету заполняют так, как указано в разделе «Газы». Для определения и
количественной оценки примесей используют методики, указанные в частных
статьях.
2.2.25. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ И
ВИДИМОЙ ОБЛАСТЯХ
Определение оптической плотности. Оптическая плотность (А) раствора
представляет собой десятичный логарифм обратной величины пропускания (Т) для
монохроматического излучения и выражается соотношением:
A=
log10
(1:T)= log
10
(I
0
:
I)
T =
I
:
I
0
,
где:
I0
- интенсивность падающего монохроматического излучения;
I
- интенсивность прошедшего монохроматического излучения.
В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая
плотность (А) пропорциональна длине пути (b), через который проходит излучение,
и концентрации (с) вещества в растворе в соответствии с уравнением:
A=e×c×
b,
где:
e
- молярный показатель (коэффициент) погашения;
b - концентрация вещества в растворе, в молях на литр;
c - длина оптического пути, в сантиметрах.
1%
Величина
А
представляет собой удельный показатель поглощения, то есть
1см
оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л в кювете с
толщиной слоя 1 см, то есть:
10×
e
1%
А1
см
=
М
м
Если нет других указаний в частной статье, измерение оптической плотности
проводят при указанной длине волны с использованием кюветы 1 см и при
температуре (20+1)оС. Если нет других указаний в частной статье, измерение
проводят по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей,
в которой растворено вещество. Оптическая плотность растворителя, измеренная
против воздуха при указанной длине волны, не должна превышать
0,4 и
желательно, чтобы она была меньше 0,2. Спектр поглощения представляют таким
образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены
по оси ординат, а длина волны или некоторая функция от длины волны - по оси
абсцисс.
Если в частной статье приводят только одно значение для положения
максимума поглощения, то это означает, что полученное значение максимума не
должно отличаться от указанного более чем на +2 нм.
Прибор. Спектрофотометр, предназначенный для измерений в
ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоит из оптической системы,
выделяющей монохроматическое излучение в области от 200 нм до 800 нм, и
устройства для измерения оптической плотности.
Проверка шкалы длин волн. Для проверки шкалы длин волн используют
линии водородной или дейтериевой разрядной лампы или линии паров ртути, а
также максимумы поглощения раствора гольмия перхлората Р, которые
представлены в Табл. 2.2.25.-1. Допустимое отклонение составляет +1 нм для
ультрафиолетового и +3 нм для видимого диапазонов.
Таблица 2.2.25.-1.
Максимумы поглощения (или испускания) для проверки шкалы длин волн
241,15 нм (Но)
404,66 нм (Hg)
253,7 нм (Hg)
435,83 нм (Hg)
287,15 нм (Но)
486,0 нм (Dβ)
302,25 нм (Hg)
486,1 нм (Нβ)
313,16 нм (Hg)
536,3 нм (Но)
334,15 нм (Hg)
546,07 нм (Hg)
361,5 нм (Но)
576,96 нм (Hg)
365,48 нм (Hg)
579,07 нм (Hg)
Проверка шкалы оптической плотности. Проверяют значения оптических
плотностей, используя раствор калия дихромата Р при длинах волн, указанных в
Табл.
2.2.25.-2. В таблице
2.2.25.-2 приведены точные значения удельного
показателя погашения и его допустимые пределы для каждой длины волны.
Для проверки шкалы оптических плотностей используют раствор калия
дихромата, приготовленный следующим образом. От 57,0 мг до 63,0 мг (точную
навеску) калия дихромата Р, предварительно высушенного до постоянной массы
при температуре 130оС, растворяют в 0,005 М растворе кислоты серной и доводят
до 1000,0 мл этим же растворителем.
Таблица 2.2.25.-2.
Длина волны,
Удельный показатель
Допустимые пределы
в нанометрах
поглощения А1%1см
А1%1см
235
124,5
от 122,9 до 126,2
257
144,5
от 142,8 до 146,2
313
48,6
от 47,0 до 50,3
350
107,3
от 105,6 до 109,0
Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть
определен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров
или растворов: например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида Р в
кювете с толщиной слоя 1 см при 200 нм, при использовании воды Р в качестве
компенсационного раствора, должна быть больше 2.
Разрешающая способность (для качественного анализа). Если указано в
частных статьях, то определяют разрешающую способность спектрофотометра
следующим образом. Записывают спектр 0,02% (об/об) раствора толуола Р в
гексане Р. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в
максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения
при 266 нм указывают в частной статье.
Ширина спекральной щели (для количественного анализа). В случае
использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при
выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели.
Для их исключения ширина спектральной щели должна быть малой по сравнению с
полушириной полосы поглощения и в то же время должна быть максимально
велика для получения высокого уровня Iо. Таким образом, ширина щели должна
быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой
оптической плотности.
Кюветы. Допустимые вариации в толщине слоя используемых кювет должны
быть не более
+0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого и
компенсационного растворов, должны иметь одинаковое пропускание
(или
оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В
противном случае это различие следует учитывать.
ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
В производной спектрофотометрии используется преобразование исходного
спектра поглощения (нулевой порядок) в производные спектры первого, второго и
более высоких порядков.
Производный спектр первого порядка представляет собой график
зависимости градиента кривой поглощения
(скорость изменения оптической
плотности с длиной волны,dA/dλ) от длины волны.
Производный спектр второго порядка представляет собой график
зависимости кривизны спектра поглощения от длины волны
(d2A/dλ2). Вторая
производная при любой длине волны λ связана с концентрацией следующим
соотношением
2
2
1%
2
d
A
d
A
d
e
1cv
c`b
=
×
=
× c`b,
2
2
2
dl
dl
10
dl
где:
с′ - концентрация поглощающего раствора, в граммах на литр.
Прибор. Используют спектрофотометр, отвечающий указанным выше
требованиям
и
оснащенный
аналоговым
резистентноемкостным
дифференцирующим модулем или цифровым дефференциатором, или другими
средствами получения производных спектров. Некоторые методы получения
производных спектров второго порядка сдвигают их относительно спектра нулевого
пордяка, что следует учитывать там, где это необходимо.
Разрешающая способность. Если указано в частных статьях, записывают
производный спектр второго порядка для раствора 0,2 г/л толуола Р в метаноле Р,
используя метанол Р в качестве компенсационного (сравнения) раствора. На
спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум,
расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм
и 268 нм, соответственно, как показано на Рис. 2.2.25.-1. Если нет других указаний в
частных статьях, отношение А/В (см. Рис.2.2.25.-1) должно быть не менее 0,2.
Рис. 2.2.25.-1.
Методика. Готовят раствор испытуемого вещества, устанавливают
различные инструментальные характеристики в соответствии с инструкцией к
прибору и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в
частной статье.
# ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой
областях спектра обычно применяют для идентификации лекарственного средства
в следующих вариантах:
1. Сравнение спектров поглощения испытуемого раствора и раствора
сравнения; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение
положений максимумов, минимумов, плечей и точек перегиба.
2. В указанной области спектра при указанных длинах волн должны
наблюдаться максимумы, минимумы, плечи и точки перегиба; возможно указание
только некоторых из этих характеристик. Расхождение между наблюдаемыми и
указанными длинами волн не должно обычно превышать 2 нм.
3. В дополнение к варианту
2 приводят еще и удельные показатели
поглощения при указанных длинах волн.
4. В дополнение к варианту 2 приводят отношения оптических плотностей
при указанных длинах волн.
Возможны и другие варианты применения, оговоренные в частных статьях.
# КОЛИЧЕСТЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Рекомендуется такая схема проведения спектрофотометрических измерений:
“В измерительную кювету помещают испытуемый раствор и определяют его
оптическую плотность по сравнению с компенсационным раствором. Затем
кювету вынимают, удаляют ее содержимое, снова помещают испытуемый
раствор и снова определяют оптическую плотность. Операцию повторяют,
получая не менее трех значений оптической плотности для испытуемого
раствора. Таким же образом получают не менее трех значений оптической
плотности для раствора сравнения. Следует избегать попадания исследуемого
раствора на внешнюю стенку кюветы. Для расчетов используют среднее
значение полученных оптических плотностей испытуемого раствора и
раствора сравнения”.
1.
Однокомпонентный одноволновой анализ. Однокомпонентный
одноволновой анализ (или “обычная спектрофотометрия”) - это количественное
определение одного из компонентов лекарственного средства посредством
измерения оптической плотности раствора испытуемого образца при одной
аналитической длине волны (АДВ).
Такой анализ может проводиться методом показателя поглощения (МПП) и
методом стандарта (МС).
При использовании МПП количественное определение проводят
посредством измерения оптической плотности (А) раствора испытуемого образца
при АДВ и расчете концентрации (с) анализируемого компонента по формуле:
А
с=
,
(1)
1%
А
1см
где:
1%
А
- удельный показатель поглощения анализируемого компонента при
1см
АДВ;
с - концентрация анализируемого вещества, в процентах (масса/об).
При использовании МС количественное определение проводят посредством
измерения при АДВ оптических плотностей раствора испытуемого образца (А) и
раствора сравнения
(Ао) с концентрацией со и расчете концентрации
(с)
анализируемого компонента, исходя из формулы:
c
A
=
,
(2)
c0
A
0
Измерение оптических плотностей испытуемого раствора и раствора
сравнения следует проводить в одних и тех же условиях с минимальным
интервалом времени.
В общем случае, более надежным является МС. Возможность применения
МПП необходимо в каждом конкретном случае обосновывать, исходя из допусков
количественного содержания анализируемого компонента, метрологических
характеристик методики и требований к спектрофотометру. Обычно МПП применим
при допусках содержания анализируемого компонента не менее
+10% от
номинального содержания.
Во всех случаях применения одноволнового однокомпонентного анализа
необходимо, чтобы остальные компоненты препарата не оказывали существенного
влияния на результаты. Обычно доля их суммарного поглощения в оптическом
поглощении образца при АДВ не должна превышать десятой части допусков
содержания анализируемого компонента.
2.
Многокомпонентный
спектрофотометрический
анализ.
Многокомпонентный
спектрофотометрический
анализ
применяют для
одновременного количественного определения
компонентов лекарственных
средств.
В
обычной
спектрофотометрии
погрешность
собственно
спектрофотометрических измерений (“спектрофотометрическая погрешность”) мало
зависит от типа анализируемого вещества и выбора аналитической длины волны, а
определяется классом спектрофотометра и не превышает обычно 0.5%. С учетом
погрешностей приготовления растворов, это приводит к суммарной погрешности
анализа, не превышающей обычно 1%.
В отличие от обычной спектрофотометрии, спектрофотометрическая
погрешность многокомпонентного анализа определяется не только классом
прибора, но и сильно зависит от состава анализируемого лекарственного средства
и особенно выбора аналитических длин волн. Эта погрешность может быть
охарактеризована коэффициентом усиления К, который показывает, во сколько раз
спектрофотометрическая погрешность определения данного вещества в
анализируемой смеси с помощью многокомпонентной спектрофотометрии
превышает спектрофотометрическую погрешность определения этого же вещества
в чистом растворе (без других компонентов) методом обычной спектрофотометрии.
Способы расчета коэффициентов усиления для каждого компонента при
использовании различных методов представлены ниже.
Обычными являются величины К=5-10, но возможны и значения К=100 и
более, что может приводить к общей погрешности анализа, составляющей десятки
и даже сотни процентов.
Для получения надежных результатов при количественном определении
лекарственных средств коэффициенты усиления К не должны обычно превышать 5.
Поэтому прогноз погрешности определения и сравнение ее с допусками
содержания анализируемого компонента является обязательным условием при
обосновании применимости методик многокомпонентной спектрофотометрии. Если
нет соответствующего обоснования, то должно выдерживаться следующее
соотношение между полной относительной погрешностью количественного
определения
k
i
компонента анализируемого образца (Δk,r%) и допусками
(+В)
содержания этого компонента в образце:
D
£
0,32
× В
(3)
k,r
D
к,r
=2×S
ck,r
(4)
где:
Sck,r,
-
относительное генеральное стандартное отклонение полной
погрешности количественного определения
k
i
компонента анализируемого
образца.
Количественное
определение
в
многокомпонентном
спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании
уравнения:
m
A
=
E
×
c
,
i=1…n,
(5)
Â
i
ij
j
i=1
где:
A
i
- оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;
E
ij
- показатели поглощения
(зависящие от способа выражения
концентрации) j-ого компонента образца при i-ой аналитической длине волны;
i
c
- концентрация j-ого компонента образца.
Для решения данного уравнения могут применяться различные подходы,
среди которых можно выделить три основных: метод наименьших квадратов (МНК),
модифицированный метод наименьших квадратов (ММНК) и метод отношения
рассчитанных концентраций (МОРК).
Метод наименьших квадратов. Метод наименьших квадратов
(МНК)
является обобщением метода показателя поглощения одноволнового
однокомпонентного анализа. В рамках МНК решение уравнения (3) имеет вид:
n
с
к
=
Â
a
ki
×
A
i
,
k =1...n,
(6)
i=1
Расчетные коэффициенты аМНК находят в соответствии с матричным
соотношением:
мнк
Т
-1
Т
a
=
(Е
× Е)
Е
,
(7)
где:
аМНК - матрица расчетных коэффициентов;
Е
- матрица показателей поглощения;
Т
- символ транспонирования.
Выбор аналитических длин волн (АДВ). Выбор АДВ описан в разделе
«Модифицированный метод наименьших квадратов».
Прогноз погрешности определения. Полная погрешность количественного
определения
k
i
компонента с помощью МНК определяется из соотношения:
2
MHK
2
2
2
2
S
=
(K
)
× (S
+
S
) +
S
,
(8)
ck,r
k
A,r
E,r
V,r
2
n
st
a
×
A
МНК
2
ki
i
(К
k
)
=
(
)
,
(9)
Â
st
i
=1
C
k
где:
S
ck,r
- относительное стандартное отклонение полной погрешности
количественного определения k-ого компонента образца;
st
i
A
- оптическая плотность раствора модельной смеси образца, содержащей
номинальные концентрации всех компонентов;
st
C
- номинальная концентрация k-ого компонента образца в модельной
k
смеси;
S
A
,r
- относительное стандартное отклонение сходимости оптической
плотности на спектрофотометре (включая кюветную погрешность);
S
E
,r
- относительное стандартное отклонение правильности оптической
плотности на спектрофотометре;
S
V
,r
- относительное стандартное отклонение погрешности приготовления
растворов.
Величины
S
A,r
и
S
E,r
известны из паспортных данных спектрофотометра, а
S
V,r
оценивают, исходя из погрешностий взятия навесок и разбавлений.
При этом должны выполняться соотношения (3-4).
Преимуществом МНК является то, что его применение не требует
использования стандартных образцов. Однако из-за значительной погрешности
правильности оптической плотности (из Табл. 2.2.25.-2 видно, что величины
V
r
S
,
могут достигать нескольких процентов) и ее неконтролируемости, полная
погрешность анализа посредством МНК может достигать десять и более процентов,
что деляет МНК ненадежным методом. Его применение предъявляет очень высокие
требования к спектрофотометрам и уровню работы аналитического персонала,
поэтому он применим обычно только в научных исследованиях на стадии
разработки лекарственных средств при больших колебаниях в концентрации
анализируемых компонентов.
Модифицированный метод наименьших квадратов. Модифицированный
метод наименьших квадратов является одним из вариантов обобщения метода
стандарта на случай многокомпонентной спектрофотометрии и основан на
уравнениях:
m
m
A
i
c
i
d
=
=
r
×
=
r
×
X
(10)
i
Â
ij
Â
ij
i
st
st
A
i
j=1
c
j
j=1
st
E
× c
ij
j
rij
=
,
(11)
m
st
E
Â
ik c
k
k
=1
где переменные имеют тот же смысл, что и в уравнениях (5) и (9), величины rij
представляют собой информационные коэффициенты, а
X
i
×100
представляет
собой концентрацию j-ого компонента препарата в процентах к его номинальному
содержанию.
Решение уравнения (10) имеет вид:
n
MMHK
X
=
a
×
d
,
i=1…n,
(12)
k
Â
ki
i
i=1
где расчетные коэффициенты аММНК находят по матричному уравнению
ММНК
T
-1
T
a
=
(r
× r)
r
,
(13)
Выбор аналитических длин волн (АДВ). АДВ находят, исходя из критерия
минимума коэффициента усиления КММНК, получаемого из соотношения:
2
m
m
n
ММНК
2
2
MMHK
(К
)
=
K
=
(a
)
,
(14)
Â
j
ÂÂ
ij
j
=1
j
-1
i
=1
где:
k
i
- коэффициент усиления для j-ого компонента образца.
В случае анализа двух соединений по двум длинам волн, АДВ можно
находить из условия максимума информационных коэффициентов каждого
компонента при одной из двух длин волн.
Схема проведения анализа. Готовят модельную смесь, содержащую все
компоненты препарата точно в номинальных концентрациях (раствор сравнения).
Проводят необходимые разбавления, измеряют попеременно оптические плотности
испытуемого раствора и раствора сравнения при АДВ и проводят расчет по
уравнениям (10-11).
Прогноз погрешности определения. Полную погрешность количественного
определения
k
i
компонента с помощью ММНК определяют из соотношения:
2
MMHK
2
2
2
S
ck,r
=
2×[(K
k
)
×
S
A,r
+
S
V,r
]
(15)
Должно выполняться соотношение (3).
Недостатком ММНК является необходимость приготовления точной
номинальной смеси образца, однако он является самым надежным и точным из
всех многоволновых методов количественного определения лекарственных
средств.
Частный случай - количественное определение одного компонента смеси
по одной длине волны. Если информационный коэффициент (r,k)
k
i
компонента при
i-ой длине волны значительно превосходит все остальные, то количественное
определение этого компонента можно проводить по упрощенной формуле:
X
k
=
d
i
(16)
Максимальная погрешность такого приближенияне превосходит 2В(1- r,k).
Данное приближение является обоснованным при r,k ≥ 0.95.
Метод отношения рассчитанных концентраций. Метод отношения
рассчитанных концентраций
(МОРК) является одним из вариантов обобщения
метода стандарта на случай многокомпонентной спектрофотометрии и основан на
допущении, что отношение концентраций, рассчитанных для испытуемого раствора
и раствора сравнения, является более точным, чем сами рассчитанные
концентрации, то есть:
n
a
×
A
Â
ki
i
c
k
i=1
X
=
=
,
(17)
k
st
n
c
k
st
a
×
A
Â
ki
i
i
=1
Здесь aki - коэффициенты расчетной матрицы, полученные с помощью МНК
(уравнение (7)) или другими методами цифровой фильтрации, например, методом
производной спектрофотометрии. В отсутствии фона поглощения самым точным
является применение МНК.
Выбор аналитических длин волн (АДВ). Смотрите выбор АДВ и ММНК.
Процедура проведения анализа. Такая же как для ММНК, но для
изготовления модельной смеси можно использовать концентрации компонентов,
близкие (а не точно равные) к номинальным. Расчет концентраций проводят по
уравнению (17).
Прогноз погрешности определения (в случае использования МНК) проводят
по соотношению:
2
MHK
2
2
2
S
=
2×[(K
)
×
S
+
S
]
ck,r
k
A,r
V,r
(18)
Должно выполняться соотношение (3).
МОРК менее точен, чем ММНК, но он не требует приготовления точно
номинальной смеси и поэтому проще в применении.
# ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Производную спектрофотометрию используют для количественного
определения обычно в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное
присутствием веществ, содержание которых не регламентируется. Она может
применяться в двух вариантах.
В первом случае получение производной проводит сам аналитик с помощью
производных полиномов, которые представляются в уравнении (17) вместо величин
aki. Прогноз погрешности концентрации должен учитывать в этом случае
погрешность неполного обращения в нуль поглощения других компонентов смеси.
Во втором случае непосредственно используют значения производных,
получаемых на спектрофотометре. Процедура анализа при этом аналогична
применению метода стандарта в обычной спектрофотометрии, но вместо
оптических плотностей используют производные.
2.2.26. БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
# Хроматография на бумаге представляет собой хроматографический метод
разделения, при котором подвижная жидкая фаза перемещается по капиллярам и
поверхности фильтровальной бумаги, либо веществ, предварительно нанесенных
на ее волокна. В бумажной хроматографии используют хроматографическую бумагу
нужной плотности квалификации «Для хроматографии».
ВОСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
Оборудование. Представляет собой стеклянную камеру с тщательно
пришлифованной крышкой, соответствующую по размерам используемой
хроматографической бумаге. Камера в верхней части должна быть снабжена
приспособлением для закрепления хроматографической бумаги, с помощью
которого ее можно опускать не открывая камеры. На дне камеры помещена емкость
(лодочка) для подвижной фазы, в которую должен быть погружен нижний край
бумаги. Хроматографическая бумага представляет собой соответствующую
фильтровальную бумагу, разрезанную на полоски достаточной длины и шириной не
менее 2,5 см; бумага должна быть разрезана так, чтобы подвижная фаза двигалась
вдоль направления волокна бумаги.
# В некоторых случаях допускается использование хроматографических
камер других типов с описанием их в частной статье.
Методика. Обозначенную в частной статье подвижную фазу помещают в
лодочку в количестве, достаточном для образования слоя не более 2.5 см. Как
указано в частной статье, между стенками камеры и лодочки помещают
хроматографическую бумагу. Для насыщения камеру закрывают крышкой и
выдерживают обычно 24 часа при температуре от 20оС до 25оС. Поддерживают
такую температуру камеры на протяжении всего испытания.
На расстоянии
3 см от одного края по всей ширине полоски бумаги
карандашом наносят тонкую горизонтальную линию. Обозначенный в частной
статье объем раствора наносят на полученную линию при помощи микропипетки.
Если весь обозначенный раствор образует пятно диаметром более 10 мм, раствор
наносят небольшими порциями, давая каждому из них высухнуть перед нанесением
следующего. Если на одной полоске бумаги должно быть получено больше одной
хроматограммы, растворы наносят вдоль линии так, чтобы расстояние между
точками нанесения частных проб было не менее 3 см.
# Если условия насыщения хроматографической камеры, нанесения пятен
или хроматографирования отличаются от условий, описанных выше, они должны
быть описаны в частной статье.
Бумагу помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают 1.5
часа. Бумагу опускают в подвижную фазу и проводят элюирование в соответствии с
указанным временем или на указанное растояние, которое должна пройти
подвижная фаза. На протяжении всего процесса элюирования бумагу защищают от
воздействия прямых солнечных лучей. Полоску бумаги вынимают из камеры и
сушат на воздухе.
# После прохождения подвижной фазы необходимого расстояния,
обозначенного в частной статье, бумагу вынимают, отмечают карандашом конец
положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в
частной статье способом.
# Визуальную оценку, количественное определение, проверку пригодности
хроматографической системы, способы оценки определения примесей, контроль
специфических примесей, контроль общего содержания примесей проводят в
соответствии со статьей 2.2.27 «Тонкослойная хроматография».
НИСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
Оборудование. Представляет собой стеклянную камеру с тщательно
пришлифованной крышкой, соответствующую по размерам используемой
хроматографической бумаге. В центре крышки должно быть отверстие с диаметром
около 1,5 см, закрытое тяжелой стеклянной пластиной или пробкой. В верхней
части камеры располагается лодочка для подвижной фазы, снабженная
приспособлением для закрепления хроматографической бумаги. От каждой
стороны лодочки параллельно ей и немного выше верхнего ее края размещены два
прямых стеклянных стержня, которые поддерживают бумагу в таком положении,
чтобы она не соприкасалась со стенками камеры. Хроматографическая бумага
представляет собой соответствующую фильтровальную бумагу, разрезанную на
полоски достаточной длины и шириной не менее 2,5 см и не более длины кюветы;
бумага должна быть разрезана таким образом, чтобы подвижная фаза двигалась
вдоль направления волокна бумаги.
# В необходимых случаях допускается использование хроматографических
камер других типов с описанием их в частной статье.
Методика. Обозначенную в частной статье подвижную фазу помещают в
лодочку в количестве, достаточном для образования слоя не более 2,5 см. Для
насыщения камеру закрывают крышкой и выдерживают обычно
24 часа при
температуре от
20оС до
25оС. Поддерживают такую температуру камеры на
протяжении всего испытания.
По всей ширине полоски бумаги карандашом наносят тонкую горизонтальную
линию от закрепленного в лодочке края на таком растоянии, чтобы линия была
размещена параллельно стеклянным стержням и несколькими сантиметрами ниже
их. Обозначенный в частной статье объем раствора наносят на полученную линию
при помощи микропипетки. Если весь обозначенный раствор образует пятно
диаметром более 10 мм, раствор наносят небольшими порциями, давая каждому из
них высохнуть перед нанесением следующего. Если на одной полоске бумаги
должно быть получено больше одной хроматограммы, растворы наносят вдоль
линии так, чтобы расстояние между точками нанесения частных проб было не
менее 3 см.
# Если условия насыщения хроматографической камеры, нанесения пятен
или хроматографирования отличаются от условий, описанных выше, они должны
быть описаны в частной статье.
Бумагу помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают 1,5
часа. Через отверстие в крышке в кювету помещают достаточное количество
подвижной фазы и проводят элюирование в соответствии с указанным временем
или на указанное растояние, которое должна пройти подвижная фаза. На
протяжении всего процесса элюирования бумагу защищают от воздействия прямых
солнечных лучей.
# После прохождения подвижной фазой необходимого расстояния,
обозначенного в частной статье, бумагу вынимают, отмечают карандашом конец
положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в
частной статье способом.
# Визуальную оценку, количественное определение, проверку пригодности
хроматографической системы, способы оценки определения примесей, контроль
специфических примесей, контроль общего содержания примесей проводят в
соответствии со статьей 2.2.27 «Тонкослойная хроматография».
2.2.27. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения,
в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала,
нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из
стекла, металла или пластмассы. Перед хроматографированием растворы
анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах
адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и
осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе)
исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси
растворителей (подвижной фазе).
ОБОРУДОВАНИЕ
Пластинки. Хроматографирование проводят с использованием пластинок,
полученных, как указано в разделе «Реактивы».
# Допускается использование пластинок, приготовленных в промышленных
условиях, если они отвечают требованиям раздела 4.1.1. «Реактивы», а также
выдерживают испытание «Проверка пригодности хроматографической системы»,
описанное в частной статье. Рекомендуется каждую партию получаемых пластинок,
приготовленных в промышленных условиях, проверять на близость величин Rf.
# Близость величин Rf. Испытания проводят не менее чем на трех
пластинках испытуемой партии. Для этого используют методику проверки
хроматографической разделяющей способности, указанной в разделе
4.1.1.
«Реактивы» («ТСХ пластинка с слоем силикагеля»). На линию старта каждой
пластинки наносят по 5 пятен раствора для проверки пригодности ТСХ пластинок
Р, хроматографируют и рассчитывают величины Rf красителей для каждого
нанесения. В пределах каждой пластинки наибольшая разница величин Rf среди
разных нанесений для каждого красителя не должна превышать 0.02. В противном
случае такие пластинки не рекомендуется использовать для фармакопейного
анализа.
Предварительная подготовка пластинок. В некоторых случаях может
понадобиться промывка пластинок перед хроматографированием, которая может
быть выполнена посредством предварительного элюирования чистых пластинок
подходящим растворителем. Пластинки могут быть также импрегнированы
(пропитаны) посредством таких процедур, как элюирование, погружение или
опрыскивание. Перед использованием пластинки активируют, если необходимо,
посредством нагревания в термостате при температуре от 100оС до 105оС в
течение 1 часа.
# Допускаются другие условия активации пластинок, описанные в частных
статьях.
Хроматографическая камера представляет собой емкость с плотно
подогнанной крышкой и с плоским дном или дном с двумя желобами из инертного
прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым пластинкам.
Для горизонтального элюирования хроматографическая камера имеет желоб для
подвижной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи подвижной
фазы к неподвижной фазе.
# В необходимых условиях допускается использование хроматографических
камер других типов с описанием их в частных статьях.
Микропипетки, микрошприцы, калиброванные капилляры или другие
устройства, пригодные для нанесения растворов.
Устройство для обнаружения или тушения флуоресценции.
Проявляющие реактивы
- для обнаружения разделенных веществ
посредством опрыскивания, обработки парами или погружения.
МЕТОДИКА
# Если нет других указаний в частной статье, хроматографическое
разделение выполняют восходящим способом в насыщенной атмосфере.
# Предпочтительнее использовать такие подвижные фазы, которые
обеспечивают величины Rf испытуемых соединений в пределах от 0,3 до 0,7.
Вертикальное элюирование. Стенки хроматографической камеры
выстилают фильтровальной бумагой. Подвижную фазу наливают в камеру в
количестве, достаточном для того, чтобы после смачивания фильтровальной
бумаги покрыть дно камеры слоем жидкости, необходимым для
хроматографирования. Для насыщения хроматографическую камеру с подвижной
фазой закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 часа при температуре от
20оС до 25оС.
# Слой жидкости в хроматографической камере должен быть таким, чтобы
после помещения в него пластинки пятна или полосы находились над уровнем
жидкости.
Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье,
наносят небольшими порциями, получая полосы или круглые пятна на подходящем
расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки. Растворы наносят на
линию, параллельную нижнему краю пластинки, с расстоянием не менее 10 мм
между пробами.
# Если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на
расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых краев
пластинки.
После испарения растворителей из нанесенных проб пластинку помещают в
хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы
пятна или полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру
закрывают, оставляют ее при температуре от 20оС до 25оС в защищенном от
прямых солнечных лучей месте. После того как подвижная фаза пройдет
расстояние, указанное в частной статье, пластнику вынимают, сушат и
обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.
В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования
пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении,
перпендикулярном первому.
Горизонтальное элюирование. Объемы растворов анализируемых
веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая
круглые пятна (от 1 мм до 2 мм в диаметре) или полосы (длиной от 5 мм до 10 мм и
шириной от 1 мм до 2 мм) на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых
краев пластинки (# если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы
наносят на расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от
боковых краев пластинки). Растворы наносят на линию, параллельную нижнему
краю пластинки, с интервалом не менее 5 мм между нанесенными пробами.
После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб
хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное
количество подвижной фазы, помещают пластинку горизонтально в
хроматографическую камеру и подсоединяют устройство для подачи подвижной
фазы в соответствии с инструкцией производителя. Если указано в частной статье,
пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и
проводят хроматографирование при температуре от 20оС до 25оС. После того, как
подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку
вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.
В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования
пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении,
перпендикулярном первому.
ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА
Идентификация. Основное пятно на хроматограмме, полученной для
испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на
хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца
(раствора
сравнения), сравнивая окраску
(цвет флуоресценции), размер и величину
удерживания (Rf) обоих пятен.
Величину удерживания (Rf) определяют как отношение расстояния от точки
нанесения пятна до центра кромки пятна после хроматографирования к
расстоянию, пройденному фронтом растворителя от точки нанесения.
Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для
идентификации. Обычно для оценки пригодности достаточно испытания на
пригодность неподвижной фазы, описанного в разделе «Реактивы». В особых
случаях дополнительные требования указывают в частных статьях.
Испытание на сопутствующие примеси. Дополнительное пятно (пятна) на
хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с
соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме, полученной для раствора
сравнения. В качестве стандартного образца для приготовления раствора
сравнения используют как саму примесь (примеси), так и различные разбавления
испытуемого раствора.
Проверка разделяющей способности. Требования для проверки
разделяющей способности приводят в соответствующих частных статьях.
Проверка
чувствительности.
Чувствительность
считается
удовлетворительной, если пятно или полоса четко обнаруживаются на
хроматограмме, полученной с наиболее разбавленным раствором сравнения.
# Проверка пригодности хроматографической системы. Результаты
анализа методом тонкослойной хроматографии считаются достоверными, если
выполняются требования испытания «Проверка пригодности хроматографической
системы».
Хроматографическая система считается пригодной если:
- на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки
пригодности хроматографической системы, четко разделяются пятна указанных в
частной статье веществ;
- величина Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора
должна быть близка, указанной в частной статье;
- на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки
чувствительности хроматографической системы, должно быть четко видно пятно.
# СПОСОБЫ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ПРИМЕСЕЙ МЕТОДОМ ТСХ
При контроле примесей нежелательно включение в частную статью
требования отсутствия пятна контролируемой примеси на хроматограмме
испытуемого раствора.
Методом ТСХ могут контролироваться как конкретно указываемые
(специфические) примеси, так и общее содержание примесей.
Контроль специфических примесей. Контроль специфических примесей
применяют в тех случаях, когда содержание каких-то конкретных примесей,
возникающих в процессе производства лекарственного средства или его хранения,
должно быть ограничено ввиду их токсичности или по другим соображениям.
При контроле специфических примесей обычно используют сравнение пятен
регламентированных примесей на хроматограммах испытуемого раствора и
раствора сравнения.
Контроль общего содержания примесей. В тех случаях, когда нет
оснований считать какие-то примеси особо токсичными, часто не так важно знать их
истинное содержание. Важно знать, что это содержание не превосходит
определенного уровня. В таких случаях используют метод внутренней
нормализации - в качестве растворов сравнения обычно используют растворы
самой испытуемой субстанции различной концентрации, а содержание примесей
находят в пересчете на эту субстанцию.
В зависимости от количества различных растворов субстанции, наносимых
на хроматограмму в виде растворов сравнения, контроль общего содержания
примесей может быть одноуровневым, двухуровневым и трехуровневым.
В двух- и трехуровневом вариантах возможна регламентация и общей
суммы примесей.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ
Требования к разрешению и разделению приводят в частных статьях.
В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной
хроматографии, поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом
свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке,
используя подходящее оборудование. Для этого измеряют отражение или
пропускание падающего света, передвигая пластинку или измеряющее устройство.
Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно
измерять флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть
количественно определены тремя способами:
- непосредственно на пластинке
- передвижением пластинки вдоль
подходящего счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль
пластины («Радиофармацевтические препараты»);
- разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на
каждой полосе, используя подходящий счетчик радиоактивности;
- соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем
сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с использованием
жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на
пластинке включает в себя:
- устройство для прямого нанесения в определенном месте пластинки
необходимого количества вещества;
- механическое устройство для передвижения пластинки или измерительного
устройства вдоль осей Х или У;
- самописец и интегратор или компьютер;
- для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом
или видимом свете: для измерения отражения или пропускания используются
фотометр с источником света, оптическое устройство, генерирующее
монохроматический свет, и фотоячейку соответствующей чувствительности; в том
случае, когда измеряется флуоресценция, требуюется дополнительно
монохроматический фильтр для выбора соответствующей спектральной области
излучаемого света;
-
для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик
радиоактивности; для него необходимо проверить линейный диапазон.
Методика. Готовят способом, указанным в частной статье, раствор
анализируемого вещества (испытуемый раствор) и, если необходимо, растворы
стандартных образцов анализируемых веществ в том же растворителе (растворы
сравнения). Наносят одинаковый объем каждого раствора на пластинку и
хроматографируют.
Для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом
или видимом свете. Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения,
концентрации которых охватывают ожидаемое значение концентрации в
испытуемом растворе
(около
80%,
100% и
120% от этой концентрации).
Опрыскивают, если необходимо, указанным реактивом и регистрируют отражение,
пропускание или флуоресценцию на хроматограммах, полученных для испытуемого
раствора и растворов сравнения. По полученным данным рассчитывают количество
вещества в испытуемом растворе.
Для веществ, содержащих радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый
раствор, содержащий около 100% ожидаемого значения концентрации. Измеряют
радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность
каждого полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.
Если нет других указаний в частной статье, результаты определения
считают недействительными, если коэффициент разделения
(RS) между
измеряемыми на хроматограмме пиками менее 1,0.
2.2.28. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Газовая хроматография (ГХ) представляет собой метод разделения, в
котором подвижной фазой является газ (газ-носитель), а неподвижной фазой,
помещенной в колонку, является твердое вещество или жидкость, нанесенные
на твердый инертный носитель или равномерно покрывающие внутренние
стенки колонки.
Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции и/или
распределения.
Оборудование. Оборудование состоит из системы подачи газов, устройства
ввода пробы, хроматографической колонки, детектора и регистрирующего
устройства. Колонки обычно изготавливают из стекла или нержавеющей стали и
заполняют неподвижной фазой. Газ-носитель проходит с заданной скоростью
через устройство ввода пробы, колонку, а затем через детектор.
Определение проводят при постоянной температуре колонки или в
соответствии с заданной температурной программой.
Используемый детектор должен обеспечивать определение тех количеств
анализируемых веществ, которые элюируются из колонки. Обычно используют
пламенно-ионизационный детектор, детектор по теплопроводности,
термоионный детектор и электронозахватный детектор.
Методика. Колонку, устройство ввода пробы и детектор термостатируют при
указанной температуре
(# перед использованием колонка должна быть
кондиционирована). Готовят испытуемый раствор и раствор(ы) сравнения, как
указано в частной статье. При помощи растворов сравнения настраивают
прибор и подбирают объемы вводимых проб, которые позволяют получить
необходимый сигнал. Выполняют повторные введения для проверки
сходимости сигнала и проверяют, если необходимо, число теоретических
тарелок.
Вводят растворы и регистрируют результаты хроматографирования. Для
проверки сходимости сигнала выполняют повторные введения. Определяют
площади пиков анализируемых компонентов. В случае, если коэффициент
симметрии, вычисленный, как описано ниже, имеет значение от 0,8 до 1,20,
допускается определение по высоте пиков. При использовании
программирования температуры необходимо проводить определение по
площадям пиков. При использовании внутреннего стандарта следует
удостовериться, что ни один из пиков, относящихся к анализируемому веществу
или его примеси, не маскируется пиком внутреннего стандарта.
Если указано в частной статье, процентное содержание одного или
нескольких компонентов анализируемой пробы определяют посредством
вычисления процентной доли площади соответствующего пика или пиков в
суммарной площади всех пиков, исключая пики растворителей или добавленных
реактивов (метод внутренней нормализации). В этих случаях рекомендуется
использование широкодиапазонного усилителя и автоматического интегратора.
# КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Абсолютная градуировка. Испытуемый раствор и раствор сравнения
попеременно хроматографируют на газовом хроматографе в условиях,
указанных в частной статье. Для испытуемого раствора и раствора сравнения
рассчитывают средние значения площадей или высот пиков анализируемого
вещества. По полученным средним значениям рассчитывают концентрацию
анализируемого вещества в испытуемом растворе.
Метод внутреннего стандарта. Для каждой хроматограммы сначала
рассчитывают отношение площади или высоты пика анализируемого вещества к
площади или высоте пика внутреннего стандарта. Полученные отношения
усредняют для испытуемого раствора и раствора сравнения и по найденным
средним значениям определяют концентрацию анализируемого вещества в
испытуемом растворе.
Методика. Полная неопределенность методики анализа должна
соответствовать требованиям статьи «Валидация аналитических методик и
испытаний. Раздел D. Критерии проведения валидации методик
количественного определения».
При этом необходимо, чтобы неопределенность пробоподготовки была
незначима по-сравнению с полной неопределенностью методики анализа (см.
там же).
Рекомендуется использовать следующую методику проведения конечной
аналитической операции (хроматографирования). Хроматографируют несколько
раз
(no) раствор сравнения и определяют относительное стандартное
отклонение (RSD) хроматографического сигнала (площадь или высота пика в
случае абсолютной калибровки, отношения площади или высоты пика к площади
или высоте пика внутреннего стандарта в методе внутреннего стандарта).
Величина no является достаточной, если значение RSD не превышает значение
RSDmax. Значение RSDmax. является характеристикой теста
“Проверка
пригодности хроматографической системы” и должна соответствовать
требованиям Табл. 1.
Таблица 1.
Требования к RSDmax. При проведении количественного определения на
этапе проверки пригодности хроматографической системы (предполагается,
что неопределенность пробоподготовки незначительна в сравнении с полной
неопределенностью методики анализа)
no
2
3
4
5
6
7
8
RSDmax.(%)
Превышение верхнего
Субстанции
предела определения
испытуемого вещества
над 100% (%)
1
0.16
0.42
0.60
0.74
0.86
0.96
1.06
1.5
0.24
0.63
0.90
1.11
1.29
1.44
1.58
2
0.32
0.84
1.20
1.48
1.72
1.93
2.11
3
0.48
1.26
1.80
2.23
2.58
2.89
3.17
Полусумма верхнего и
Готовые лекарственные средства
нижнего предела
содержания
испытуемого вещества
к номинальному
значению (%)
5
0.25
0.67
0.96
1.19
1.38
1.54
1.69
7.5
0.38
1.01
1.44
1.78
2.06
2.31
2.53
10
0.51
1.34
1.92
2.37
2.75
3.08
3.38
15
0.76
2.01
2.88
3.56
4.13
4.62
5.07
20
1.01
2.68
3.85
4.75
5.50
6.16
6.76
Если полученное значение RSD. не превышает значение RSDmax.,
приведенное в Табл.1., попеременно хроматографируют одинаковое количество
n > no раз раствор сравнения и испытуемый раствор (или несколько испытуемых
растворов, если анализируют несколько серий).
Возможно значительное изменение величины n за предел объединения
выборок растворов сравнения и анализируемого (ых) раствора (ов) от предела
объединенного стандартного отклонения (см. статью «Статистический анализ
результатов химического эксперимента»).
# КОНТРОЛЬ ПРИМЕСЕЙ
Для контроля примесей обычно используют следующие подходы.
1 . Количественное определение примеси с использованием раствора
сравнения с известной концентрацией примеси (обычно в методе абсолютной
калибровки). Такой подход предполагает одинаковый сигнал примеси в
присутствии и в отсутствии основного вещества.
2. Метод внутренней нормализации. Такой подход предполагает
выполнение линейности в широком диапазоне и может потребовать учета
различий в сигналах примеси и основного вещества. Его часто применяют для
определения суммы примесей. При этом сумму площадей всех пиков на
хроматограмме (без учета пика растворителя) принимают за 100% и содержание
каждой конкретной примеси или суммы примесей находят как долю площади
пика этой примеси или суммы площадей пиков примесей в общей сумме
площадей всех пиков на хроматограмме.
3. Сравнение с разбавленным раствором основного вещества.
4. Метод стандартных добавок. К анализируемой пробе прибавляют
известное количество примеси. По данным хроматографирования испытуемой
пробы и испытуемой пробы с добавкой определяют содержание примеси. Для
повышения точности возможно использование метода внутреннего стандарта.
# Пригодность хроматографической системы. Результаты анализа
считаются достоверными, если выполняются требования теста
«Проверка
пригодности хроматографической системы». Данный тест обычно проводят с
использованием растворов сравнения.
Если нет других указаний в частной статье, хроматографическая система
считается пригодной при выполнении следующих условий:
- относительные времена удерживания указанных веществ должны быть около
регламентируемых значений;
- число теоретических тарелок
(эффективность хроматографической
системы), рассчитанное по указанному пику, должно быть не менее
регламентируемой величины;
- коэффициент разделения указанных пиков должен быть не менее
указанной величины;
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для высоты или
площади указанного пика или их отношений к высоте или площади
внутреннего стандарта из хроматограмм раствора сравнения, должно быть не
более регламентируемой величины; для расчета относительного
стандартного отклонения используют данные пяти параллельных
хроматограмм; если требуемое относительное стандартное отклонение
превышает 2.0%, его расчет проводят, используя данные шести или более
параллельных хроматограмм;
- коэффициент асимметрии указанного пика, рассчитанный из
хроматограмм раствора сравнения, должен быть в пределах, указанных в
частной статье.
Для обеспечения выполнения требований теста «Проверка пригодности
хроматографической системы» допускается модификация хроматографических
условий, описанных в частной статье (изменение температуры термостата
колонок и/или расход газа-носителя).
ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Парофазная газовая хроматография является методом, наиболее
подходящим для разделения и определения летучих соединений, которые
присутствуют в твердых или жидких образцах. Метод основан на анализе газовой
фазы, находящейся в равновесии с твердой или жидкой фазой.
Оборудование. Оборудование состоит из газового хроматографа,
снабженного устройством для ввода газовой фазы, находящейся над испытуемым
образцом. Устройство ввода может быть подсоединено к блоку, автоматически
контролирующему и регулирующему давление и температуру. При необходимости
используют устройство для удаления растворителей.
# Возможно использование других способов ввода газовой фазы в
хроматографическую колонку.
Анализируемую пробу вводят в контейнер, снабженный подходящей пробкой и
клапанной системой, которая регулирует прохождение газа-носителя. Контейнер
помещают в термостатируемую камеру с температурой, устанавливаемой в
соответствии со свойствами анализируемого образца.
Пробу выдерживают при заданной температуре в течение времени,
достаточном для установления равновесия между твердой или жидкой фазой и
газовой фазой.
В контейнер вводят газ-носитель и по истечении указанного времени
открывают клапан, чтобы газ поступал в хроматографическую колонку, перенося с
собой перешедшие в газовую фазу компоненты.
Методика. Настраивают прибор для получения необходимого сигнала,
используя подготовленные образцы сравнения
а) Метод прямой градуировки
В одинаковые флаконы раздельно помещают анализируемую пробу и каждый из
образцов сравнения, приготовленные, как указано в частной статье, избегая
контакта между устройством для ввода проб и образцами.
Флаконы герметично закрывают и помещают в термостатируемую камеру с
температурой и давлением, указанными в частной статье. После установления
равновесия газовую фазу хроматографируют в указанных условиях.
б) Метод стандартных добавок
Равные объемы анализируемой пробы помещают в одинаковые указанные в
частной статье флаконы. Во все флаконы, кроме одного, прибавляют указанные
количества раствора сравнения, содержащего известную концентрацию
анализируемого вещества, для получения ряда образцов, с равномерно
увеличивающимися концентрациями этого вещества.
Флаконы герметично закрывают и помещают в термостатируемую камеру с
температурой и давлением, указанными в частной статье. После установления
равновесия хроматографируют газовую фазу в указанных условиях.
Уравнение линейной зависимости рассчитывают методом наименьших
квадратов. По полученному уравнению определяют концентрацию анализируемого
вещества в испытуемой пробе.
Допускается определение концентрации с использованием графического
метода. Для этого по оси ординат откладывают средние значения полученных
результатов, а по оси абсцисс - концентрации стандартных добавок анализируемого
вещества. Экстраполируют линию, проходящую через полученные точки, до
пересечения с осью абсцисс. Расстояние между этой точкой и началом координат
представляет собой концентрацию анализируемого вещества в испытуемом
растворе.
с) Метод последовательных отборов
Применение данного метода описывают в частной статье.
2.2.29. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Жидкостная хроматография (ЖХ) представляет собой метод разделения,
в котором подвижной фазой является жидкость, а неподвижной фазой,
помещенной в колонку, является тонкодисперсное твердое вещество или
жидкость, нанесенная на твердый тонкодисперсный носитель, или химически
модифицированный тонкодисперсный носитель посредством введения
органических групп.
Жидкостная хроматография основана на механизмах адсорбции,
распределения, ионного обмена или разделения по размерам молекул.
Оборудование. Оборудование обычно состоит из системы подачи
подвижной фазы, устройства ввода пробы (с использованием автосамплера
или петлевого дозатора), хроматографической колонки, детектора, дегазатора и
регистрирующего устройства. Подвижная фаза обычно подается под
давлением из одной или нескольких емкостей и протекает через устройство
ввода пробы, колонку, а затем через детектор с заданной скоростью.
Температуру хроматографической колонки поддерживают постоянной.
Состав подвижной фазы, в зависимости от указанного в частной статье, может
или оставаться постоянным на протяжении всего анализа
(изократическое
элюирование), или может изменяться в соответствии с задаваемой программой
(градиентное элюирование).
Используемый детектор должен обеспечивать определение тех
количеств анализируемых веществ, которые элюируются из колонки. Обычно
для детектирования используют абсорбционную спектрофотометрию, а также
дифференциальную рефрактометрию, флуориметрию, сжигание и
электрохимические методы.
Методика. Колонку уравновешивают при указанном составе подвижной
фазы. Готовят испытуемый раствор и раствор(ы) сравнения, как указано в
частной статье. Растворы не должны содержать твердых частиц. Используя
растворы сравнения, настраивают прибор и подбирают объемы вводимых
проб, которые позволяют получить необходимый
(адекватный) сигнал.
Выполняют повторные введения для проверки сходимости сигнала и проверяют,
если необходимо, число теоретических тарелок.
Вводят растворы и регистрируют результаты хроматографирования. Для
проверки сходимости сигнала выполняют повторные введения. Определяют
площади пиков анализируемых компонентов. В случае, если коэффициент
асимметрии, вычисленный, как описано ниже, имеет значение от 0.8 до 1.20,
допускается проводить определение по высоте пиков. При использовании
градиентного элюирования необходимо проводить определение по площадям
пиков. При использовании внутреннего стандарта следует удостовериться,
что ни один из пиков анализируемого вещества или его примеси не маскируется
пиком внутреннего стандарта.
содержание .. 3 4 5 6 ..