ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

Из полученных значений вычисляют содержание определяемого

компонента или компонентов. Если указано в частной статье, процентное

содержание одного или нескольких компонентов анализируемой пробы

определяют посредством вычисления процентной доли площади

соответствующего пика или пиков к суммарной площади всех пиков, исключая

пики растворителей или добавленных реактивов

(метод внутренней

нормализации).

В этих случаях рекомендуется

использование

широкодиапазонного усилителя и автоматического интегратора.

# КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Абсолютная градуировка. Если нет других указаний в частной статье,

испытуемый раствор и раствор сравнения попеременно хроматографируют на

жидкостном хроматографе, получая не менее пяти хроматограмм, в условиях,

указанных в частной статье. Для испытуемого раствора и раствора сравнения

рассчитывают средние значения площадей или высот пиков анализируемого

вещества. По полученным средним значениям рассчитывают концентрацию

анализируемого вещества в испытуемом растворе.

Метод внутреннего стандарта. Для каждой хроматограммы сначала

рассчитывают отношение площади или высоты пика анализируемого вещества к

площади или высоте пика внутреннего стандарта. Полученные отношения

усредняют для испытуемого раствора и раствора сравнения и по найденным

средним значениям определяют концентрацию анализируемого вещества в

испытуемом растворе.

# КОНТРОЛЬ ПРИМЕСЕЙ

Для контроля примесей обычно используют следующие подходы.

1. Количественное определение примеси с использованием раствора

сравнения с известной концентрацией примеси (обычно в методе абсолютной

калибровки). Такой подход предполагает одинаковый сигнал примеси в

присутствии и в отсутствии основного вещества.

2. Метод внутренней нормализации. Такой подход предполагает

выполнение линейности в широком диапазоне и может потребовать учета

различий в чувствительности детектора по отношению к примеси и основному

веществу. Его часто применяют для определения суммы примесей. При этом

сумму площадей всех пиков на хроматограмме (без учета пика растворителя)

принимают за 100% и содержание каждой конкретной примеси или суммы

примесей находят как долю площади пика этой примеси или суммы площадей

пиков примесей в общей сумме площадей всех пиков на хроматограмме.

3. Сравнение с разбавленным раствором основного вещества.

4. Метод стандартных добавок. К анализируемой пробе прибавляют

известное количество примеси. По данным хроматографирования испытуемой

пробы и испытуемой пробы с добавкой определяют содержание примеси. Для

повышения точности возможно использование метода внутреннего стандарта.

# Пригодность хроматографической системы. Результаты анализа

считаются достоверными, если выполняются требования теста

«Проверка

пригодности хроматографической системы». Данный тест обычно проводят с

использованием растворов сравнения.

Если нет других указаний в частной статье, хроматографическая система

считается пригодной при выполнении следующих условий:

- относительные времена удерживания указанных веществ должны быть около

регламентируемых значений;

- число теоретических тарелок

(эффективность хроматографической

системы), рассчитанное по указанному пику, должно быть не менее

регламентируемой величины;

- коэффициент разделения указанных пиков, рассчитанный из

хроматограмм раствора сравнения, должен быть не менее указанной

величины;

- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для высоты или

площади указанного пика или их отношений к высоте или площади

внутреннего стандарта из хроматограмм раствора сравнения, должно быть не

более указанной величины; для расчета относительного стандартного

отклонения используют данные пяти параллельных хроматограмм;

- коэффициент симметрии указанного пика, рассчитанный из хроматограмм

раствора сравнения, должен быть в пределах, указанных в частной статье.

Для обеспечения выполнения требований теста «Проверка пригодности

хроматографической системы» допускается модификация хроматографических

условий, описанных в частной статье.

2.2.30. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Эксклюзионная хроматография представляет собой хроматографический

метод, в котором процесс распределения молекул в растворе происходит в

соответствии с их размерами. В случае использования органической

подвижной фазы метод называют гель-проникающей хроматографией, а в

случае использования водной подвижной фазы

- гель-фильтрационной

хроматографией. Проба вводится в колонку, заполненную гелем или

пористыми частичками наполнителя, и переносится подвижной фазой через

колонку. Распределение в соответствии с размерами происходит в процессе

движения и многоразовых обменов молекул растворенного вещества между

молекулами растворителя (подвижной фазы) и тем же самым растворителем,

находящимся в порах материала, которым заполнена колонка. Диапазон

размеров распределенных молекул определяется диапазоном размеров пор

наполнителя.

Достаточно маленькие молекулы, способные проникать во все поры

материала, элюируются в полном объеме колонки (V_t - полный проникающий

объем или граница эксклюзии). Молекулы с размерами, превышающими

размер всех пор материала колонки, мигрируют лишь сквозь простор между

частицами наполнителя, не препятствуя им, и элюируются в свободном объеме

колонки (Vo - объем эксклюзии или мертвый объем). Распределение молекул в

соответствии с размерами происходит между свободным объемом и полным

объемом колонки; наиболее эффективное распределение происходит в первые

две трети даного диапазона.

Оборудование.

Специфичной частью оборудования

является

хроматографическая колонка подходящих размеров, заполненная материалом,

который обеспечивает распределение молекул соответствующих размеров в

необходимом диапазоне. Если необходимо, колонку термостатируют. Через

колонку с постоянной скоростью пропускают элюент. К одному концу колонки

обычно присоединяют приспособление для введения пробы, например,

инжектор с прерывателем потока, шприцевой инжектор с мембраной для

введения пробы без приостановки потока или петлевой инжектор с клапаном,

который перекрывает поток. К этому же концу колонки также может быть

присоединен соответствующий насос для подачи элюента с контролируемой

скоростью. Проба может также наноситься непосредственно на сухую

поверхность материала колонки или, если вязкость пробы превышает вязкость

элюента, проба может наслаиваться на поверхность материала колонки под

элюент. Другой конец колонки обычно присоединяют к соответствующему

детектору с приспособлением, регистрирующим и обеспечивающим контроль

соответствующих концентраций распределенных компонентов пробы. Обычно

используют детекторы: фотометрический, рефрактометрический или

люминесцентный. При необходимости, может быть присоединен

автоматический коллектор фракций.

В качестве наполнителя может использоваться или мягкий материал,

такой как набухший гель, или твердый, такой как пористое стекло, силикагель

или подходящий для данного растворителя поперечно-сшитый органический

полимер. При использовании твердых материалов обычно применяют

принудительную подачу подвижной фазы под давлением, что ускоряет разделение.

Подвижную фазу выбирают исходя из природы пробы, наполнителя и метода

детектирования.

Указания по обработке материала для заполнения колонки перед

выполнением распределения и наполнения колонки представлены в

соответствующей частной статье или инструкции изготовителя.

# Условия хроматографирования, такие, например, как размер колонки,

скорость подвижной фазы, объем вводимой пробы и другие параметры,

обозначенные в частной статье, не являются строго регламентированными и могут

варьировать. При этом должны выполняться условия теста

«Пригодность

хроматографической системы» (2.2.46), и данный тест может учитывать влияние

таких изменений на полученные результаты.

Определение относительного компонентного состава смесей

Распределение проводят, как описано в частной статье. При возвожности

записывают хроматограмму, полученную в процессе распределения, и

измеряют площадь соответствующих пиков. Если чувствительность одинаковая

для всех компонентов пробы

(например, они имеют одинаковое удельное

оптическое поглощение), относительное содержание каждого компонента

рассчитывают как отношение площади пика соответствующего компонента к

сумме площадей пиков всех компонентов. Если для разных компонентов пробы

чувствительность разная, содержание каждого компонента рассчитывают с

помощью градуировочных графиков, полученных с использованием

соответствующих стандартных веществ для градуировки, как указано в частной

статье.

Определение молекулярных масс

Эксклюзионная хроматография может быть использована для

определения молекулярных масс веществ путем сравнения с

соответствующими стандартными веществами для градуировки, указанными в

частной статье.

Для молекулярных масс стандартных веществ строят график зависимости

объема удерживания от логарифма молекулярных масс.

График, выстроенный в пределах, ограниченных значениями объема

эксклюзии и полного объема проникновения обычно приближается к прямой

линии для данной колонки в данных экспериментальных условиях. На

основании этого графика могут быть рассчитаны молекулярные массы.

Использование метода градуировки для молекулярно-массового разделения

позволяет получать достоверные результаты лишь для частных случаев систем

высокомолекулярное вещество/растворитель в описанных экспериментальных

условиях.

Определение молекулярно-массового рапределения полимеров

Эксклюзионная хроматография может быть использована для

определения молекулярно-массового распределения полимеров. Однако

сравнить между собой результаты можно лишь в одинаковых

экспериментальных условиях. Стандартные вещества, используемые для

градуировки, и методики анализа описывают в соответствующих частных

статьях.

2.2.31. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ОБЩИЙ ПРИНЦИП

Под действием электрического поля заряженные частички, растворенные или

диспергированные в растворе электролита, передвигаются в направление к

электроду противоположной полярности,

# а молекулы с положительными и

отрицательными зарядами передвигаются в направлении их суммарного заряда.

# Скорость передвижения прямо пропорциональна суммарному заряду частицы и

обратно пропорциональна ее размеру, либо молекулярной массе.

# Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для

данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую

подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность под влиянием

градиента потенциала

1 В на

1 см измеряется в сантиметрах в секунду.

Относительная электрофоретическая подвижность есть отношение подвижности

исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.

В гель-электрофорезе движение частиц замедляется взаимодействием с

окружающей матрицей геля, что действует как молекулярное сито. Встречные

взаимодействия электрической силы и молекулярного сита приводят к

диференциации скорости передвижения частиц в зависимости от их размеров,

форм и зарядов. В ходе электрофореза из-за различия физико-химических свойств,

разные макромолекулярные смеси передвигаются с разной скоростью и, таким

образом, разделяются на дискретные фракции. Электрофоретическое разделение

может быть проведено в системах без неподвижных фаз (например, свободное

разделение раствора в капилярном электрофорезе) и в стабилизированных средах,

таких как тонкослойные пластинки, пленки или гели.

# Существует два различных метода электрофореза: фронтальный и

зональный. Фронтальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной

среде, и он является единственным способом определения абсолютной

электрофоретической подвижности. Зональный электрофорез проводят в

закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических

зон.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ СО СВОБОДНОЙ ИЛИ ПОДВИЖНОЙ ГРАНИЦЕЙ

Этот метод обычно используется для определения электрофоретической

подвижности, экспериментальной характеристики веществ, непосредственно

измеренной и воспроизведенной. Этот метод обычно применяется для веществ с

высокой молекулярной массой, которые имеют малую диффузию. Границы

первоначально определяются физическими методами, например, рефрактометрией

или кондуктометрией. Под действием определенного электрического поля в

течение точно измеряемого времени определяют новые границы и их

относительное положение. Условия испытания подбирают так, чтобы можно было

определять столько границ, сколько веществ присутствует в испытуемом образце.

ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАЗЫ НОСИТЕЛЯ

Этот метод обычно используется лишь для небольших образцов испытуемых

веществ.

Природа носителя, например, бумага, гель агара, ацетат целлюлозы,

крахмал, агароза, полиакриламид, смешанный гель, служит причиной ряда

дополнительных факторов, влияющих на подвижность:

- а) вследствие наличия каналов в фазе носителя, среднее растояние, которое

проходит вещество, становится меньше реально пройденного расстояния;

- б) некоторые фазы носителя электрически не нейтральны. Поскольку носители

являются неподвижной фазой, это иногда может приводить к значительно

большему электроэндоосмотическому потоку;

- в) какое-нибудь нагревание в результате эффекта Джоуля может вызвать

некоторое испарение жидкости с фазы носителя, что, в следствие

капиллярности, приводит к движению раствора в направлении от краев к центру.

Ионная сила в этом случае возрастает.

Следовательно, скорость передвижения зависит от таких главных факторов:

подвижности заряженной частицы, потока скорости электроэндоосмоса и испарения

жидкости с фазы носителя, а также силы (напряжения поля). Поэтому необходимо

проводить испытание в строго определенных экспериментальных условиях и, по

возможности, использовать стандартные вещества.

Прибор для электрофореза состоит из:

- источника постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и,

желательно, стабилизировать;

- электрофоретической камеры. Обычно это камера из стекла или твердой

пластмассы, которая состоит из двух отдельных резервуаров - анодного и

катодного, содержащих раствор электролита. В каждый резервуар камеры

погружается электорд, напрмер, платиновый или графитовый. Они

присоединяются изолированной схемой к соответствующему выходу источника

питания и образуют анод и катод. Уровень жидкости в обоих резервуарах

камеры поддерживается одинаковым для избежания переливания через сифон.

Электрофоретическая камера снабжена воздухонепроницаемой крышкой,

которая поддерживает атмосферу насыщенной влажности на протяжении

испытания и уменьшает испарение растворителя. При снятии крышки ток

отключается предохранителем. Если электродвижущая сила измерена в интервале,

превышающим 10 В, желательно охладить носитель;

- приспособления установки носителя:

Электрофорез на полосках. Полоски с носителем, поочередно смоченные

электродным раствором, погружают в электродный резервуар, закрепляют и

фиксируют соответствующим держателем для предупреждения диффузии

электролита. Такими держателями можут быть горизонтальная рамка,

направленный V-образный штатив или однородная поверхность с точками контакта

через определенные интервалы.

Гель-электрофорез. Приспособление в основном состоит из стеклянной

пластинки, на поверхность которой нанесен слой хорошо закрепленного геля

одинаковой толщины. Соединение геля с электродным раствором осуществляется

разными способами в зависимости от типа используемого прибора. Необходимо

принять меры для предупреждения конденсации воды или высушивания твердого

слоя;

- измерительного устройства или детектора.

Методика. Раствор электролита помещают в электродный резервуар.

Соответствующим образом импрегнированный носитель с электролитным

раствором помещают в камеру с обозначенными для используемого прибора

условиями. Устанавливают линию старта и наносят образец. Подают электрический

ток в течение определенного времени. После отключения тока носитель вынимают

из камеры, высушивают и проявляют.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ С ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ

При электрофорезе на колонках с полиакриламидным гелем стационарной

фазой является гель, приготовленный из смеси акриламида и N,N'-

метиленбисакриламида. Колонку с гелем готовят с использованием трубок длиной

7,5 см и внутренним диаметром 0,5 см.

Прибор. Состоит из двух вставленных вертикально один над одним

резервуаров для буферного раствора, приготовленных из подходящего материала,

например, поли(метил метакрилата). Каждый резервуар снабжен платиновым

электродом. Электроды присоединены к источнику тока, что позволяет проводить

испытание или при постоянном токе, или при постоянном напряжении. В основании

верхнего резервуара имеется ряд держателей, равноудаленных от электрода.

Методика. Обычно растворы дегазируют до начала полимеризации и гели

используют сразу после приготовления. Готовят предписанную смесь компонентов,

заливают в соответствующие закрытые снизу стеклянные колонки до одинакового

уровня около 1 см от верхнего края, избегая попадания пузырьков воздуха в

колонки. На смесь геля наслаивают слой воды Р, чтобы исключить попадания

воздуха, и оставляют для полимеризации. Гелеобразование обычно занимает

около 30 минут и завершается, когда образуется четкое разделение поверхности

геля и водного слоя. Водный слой удаляют. Нижний резервуар наполняют

указанным буферным раствором. Колонки открывают и вставляют в держатели

верхнего резервуара так, чтобы дно колонок было погружено в буферный раствор

нижнего резервуара. Колонки осторожно наполняют указанным буферным

раствором. Готовят испытуемые образцы и образцы сравнения, содержащие

индикаторный краситель, и уплотняют путем растворения в них, например,

сахарозы Р. Приготовленные образцы наслаивают на поверхность геля, используя

для каждого образца отдельную колонку. Верхний резервуар наполняют тем же

буферным раствором. Электроды подключают к источнику тока и проводят процесс

электрофореза при указанных условиях: темературе, постоянном напряжении или

токе. Источник тока отключают, когда индикаторный краситель почти переходит в

нижний резервуар. Каждую колонку сразу вынимают из прибора и извлекают гель.

Локализуют положение полос на электрофореграмме.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С НАТРИЕМ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ

ГЕЛЕ (ДСН-ПАГ)

Отрасль применения. Электрофорез в полиакриламидном геле

применяется для качественной идентификации белков в биологических препаратах,

контроля их чистоты и количественных определений.

Цель. Аналитический гель-электрофорез

- метод, позволяющий

идентифицировать и оценить гомогенность белков в лекарственных средствах.

Метод обычно используется для определения молекулярных масс белковых

субъединиц и субъединичного состава очищенных белков.

На рынке имеется разнообразный ассортимент готовых к использованию

гелей и реактивов, которые могут быть использованы вместо описанных в общей

статье, если получаются эквивалентные результаты и выполняются условия

раздела “Валидация испытания”, приведенного ниже.

СВОЙСТВА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Ситовые свойства полиакриламидных гелей обусловлены тримерной сеткой

геля, образующегося бифункциональным бисакриламидом, поперечно связанным

(сшитым) с соседними акриламидными цепями. Процесс полимеризации

катализируется свободно-радикалгенерирующей системой, образующейся с

аммонием персульфатом и тетраметилэтилендиамином.

При увеличении концентрации акриламида в геле уменьшается эффективный

размер пор. Эффективный размер пор геля оперативно определяется ситовыми

свойствами, то есть, сопротивлением миграции макромолекул. Акриламид может

использоваться только в определенных концентрациях. При высоких концентрациях

акриламида гели чаще ломаются и являются сложными в обработке. Поскольку

размер пор геля уменьшается, уменьшается скорость миграции белка через гель.

Регулируя размер пор геля, изменяя концентрацию акриламида, можно

оптимизировать условия разделения испытуемого белкового продукта.

Следовательно, данный гель характеризуется содержанием и массовым

соотношением акриламида и бисакриламида.

Кроме состава геля важным компонентом электрофоретической подвижности

является структура белка. В случае определения белков, электрофоретическая

подвижность зависит от значения рК заряженных групп и размера молекулы. На это

влияют тип, концентрация и рН буфера, температура и сила электрического поля, а

также природа материала носителя.

ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Данный метод является примером анализа мономерных полипептидов с

молекулярной массой от 14000 дальтон до 100000 дальтон. Возможно расширение

границ молекулярных масс (например, путем использования градиентных гелей,

особенностей буферной системы), но такие методики анализа не обсуждаются в

данной статье.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием

натрия додецилсульфата (ДСН-ПАГ; SDS-PAGE) является наиболее общепринятым

методом электрофореза, который используется для оценки качества белковых

лекарственных средств и описан ниже в качестве примера указанного метода.

Обычно аналитический электрофорез белков проводят в полиакриламидных гелях в

условиях, обеспечивающих диссоциацию белков на отдельные полипептидные

субъединицы, что минимизирует их агрегацию.Чаще всего перед нанесением на

гель белки подвергают диссоциации, нагревая их с сильным анионным детергентом

- ДСН. Денатурированные полипептиды связываются с ДСН, превращаясь в

отрицательно заряженные частички с постоянным отношением массы к заряду,

независимо от типа белка. Поскольку количество связанного ДСН почти всегда

пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от его

последовательности,

ДСН-полипептидные

комплексы

мигрируют

полиакриламидном геле со скоростью, зависящей от размера полипептида.

Электрофоретическая подвижность полученных детергентполипептидных

комплексов находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными

массами. Миграция ДСН-комплексов происходит в направлении к аноду

предположительно комплексы с низкими молекулярными массами движутся

быстрее, чем с высокомолекулярными массами. Следовательно, молекулярная

масса белка может быть определена калибровкой ДСН-ПАГ, и наличие единичной

полосы в геле является критерием чистоты белка.

Однако модификации полипептидной цепи, например, N- или О-

гликозидными, приводят к значительной смене средней молекулярной массы белка,

так как ДСН не связывается с карбогидратным компонентом так, как с

полипептидным. В этом случае постоянное отношение заряда к молекулярной

массе не сохраняется. Средняя молекулярная масса белков, подвергнутых

посттрансляционной модификации, не является подлинным отображением массы

полипептидной цепи.

ВОССТАНОВЛЕННЫЕ УСЛОВИЯ

Состав и тримерная структура белков часто поддерживаются присутствием

дисульфидных связей. Целью ДСН-ПАГ испытаний в восстановленных условиях

является разрушение структуры белка восстановлением дисульфидных связей.

Полная денатурация и диссоциация белков обработкой 2-меркаптоэтанолом или

дитиотреитолом

(ДТТ) приводит к развертыванию полипептидной цепи и

дальнейшему комплексообразованию с ДСН. В этих условиях молекулярную массу

полипептидных субъединиц можно расчитать по линейной регрессии

соответствующего стандарта молекулярных масс.

НЕВОССТАНОВЛЕННЫЕ УСЛОВИЯ

Для ряда испытаний полная диссоциация белка на субъенидичные пептиды

невозможна. Из-за отсутствия восстанавливающих агентов, таких как

меркаптоэтанол или ДТТ, дисульфидные ковалентные связи становятся

недоступными, сохраняя олигомерную форму белка. Олигомерные ДСН-белковые

комплексы мигрируют свободнее, чем их ДСН-полипептидные субъединицы. Кроме

того, невосстановленные белки не могут быть целиком насыщены ДСН и,

соответственно, поэтому не могут связывать детергент с постоянным

соотношением масс. Это делает молекулярно-массовое определение этих молекул

с помощью ДСН-ПАГ неадекватным в сравнении с анализом полностью

денатурированных полипептидов, так как необходимо наличие стандартов, которые

имеют идентичную с испытуемым неизвестным белком конфигурацию для

адекватного сравнения. Напротив проявление одной полосы в таком геле является

критерием чистоты белка.

СВОЙСТВА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ С ПРЕРЫВИСТОЙ БУФЕРНОЙ

СИСТЕМОЙ

Наиболее широко используемый электрофоретический метод исследования

сложных белковых смесей включает использование прерывистой буферной

системы, который состоит из двух гелей: разрешающего или разделяющего

(нижнего) геля и концентрирующего

(верхнего) геля. Два геля отличаются

пористостью, рН и ионной силой. Кроме того, используются разные по подвижности

ионы в геле и электродных буферах. Буферная прерывистость приводит к

концентрации большого объема образцов в концентрирующем геле и улучшению их

разделения. При прохождении тока через испытуемый раствор падает напряжение,

что вносит белки в концентрирующий гель. Ионы глицината с электродного буфера

движутся за белками в концентрирующий гель. Быстро образуется область

подвижной границы с высокоподвижными ведущими хролид-ионами и относительно

медленными замыкающими ионами глицината. Образуется локализованный

высоковольтный градиент между фронтами лидирующих и отстающих ионов,

заставляя ДСН-белковые комплексы формировать тонкие зоны

(полосы) и

мигрировать между фазами хлорида и глицината. В широких границах, независимо

от высоты нанесенного образца, все ДСН-белки конденсируются в очень узкую

область и движутся к разделяющему гелю в виде четко определяемой тонкой зоны

с высокой плотностью белка. Крупнопористый концентрирующий гель не

задерживает миграцию большинства белков и, в основном, служит

антиконвекторной средой.

На поверхности как концентрирующего, так и разделяющего гелей белки

встречаются с резким возрастанием эффекта задерживания вследствие

ограниченного размера пор разделяющего геля. Одновременно движение белков

разделяющего геля продолжает замедляться вследствие ситовых свойств матрицы.

Ионы глицината догоняют белки, а затем передвигаются в пространстве с

постоянным рН, образованным трис(гидроксиметил)аминометаном и глицином.

Молекулярно-ситовые свойства фазы приводят к разделу ДСН-полипептидных

комплексов по их молекулярным массам.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНЫХ ПРЕРЫВИСТО-БУФЕРНЫХ ДСН-

ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Составление кассет, формирующих гель. Две стеклянные пластинки

(например, размером 10 см х 8 см), политетрафторэтиленовую гребенку, две

прокладки и силиконовые трубки (например, диаметром 0.6 мм и длиной 35 см)

моют с мягким детергентом и ополаскивают водой. Все указанное сушат бумажным

полотенцем или тканью. Прокладки и трубки смазывают несиликоновым маслом.

Прокладки укладывают вдоль двух коротких сторон стеклянных пластин на

расстоянии 2 мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном геля.

Используя одну прокладку в качестве основы, начинают укладывать трубку.

Осторожно просовывают трубку к низу прокладки и протягивают вдоль длинной

стороны стеклянной пластинки. Придерживая трубку вдоль длинной стороны

пластинки, укладывают трубку по короткой стороне стеклянной пластинки,

используя прокладку в качестве направляющей. Накрывают другой стеклянной

пластинкой, плотно прижимая кассету руками. Устанавливают по два зажима на две

короткие стороны кассеты. Осторожно устанавливают четыре зажима на длинную

сторону кассеты геля, формируя дно кассеты. Необходимо удостовериться, чтобы

трубка проходила вдоль края стеклянной пластинки и нигде не выдавливалась при

размещении зажимов. Кассета готова для заливания гелем.

Приготовление геля. В случае прерывистого буферного ДСН-

полиакриламидного геля рекомендуется залить разделительный гель, дождаться

его полимеризации и затем залить концентрирующий гель, поскольку гели

отличаются содержанием акриламида-бисакриламида, буфером и рН.

Приготовление разделительного геля. В конической колбе готовят

соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для

формирования геля, используя указания, приведенные в Табл.

2.2.31.-1.

Компоненты смешивают в указанной последовательности. Если необходимо, перед

прибавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина

(ТЕМЭД) раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную мембрану

(диаметр пор

0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая

фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков.

Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и

ТЕМЭД, как указано в Табл.

2.2.31.-1, взбалтывают и сразу заливают в

пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходимое место

для формирующего геля (к длине зубца гребеня прибавляют 1 см). Используя

заостренную стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой

раствор изобутанола. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной

температуре до полимеризации.

Таблица 2.2.31.-1

Приготовление разделительного геля

Компоненты раствора

Объемы компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью

5мл

10мл

15мл

20мл

25мл

30мл

40мл

50мл

6% акриламид

Вода Р

2,6

5,3

7,9

10,6

13,2

15,9

21,2

26,5

Раствор акриламида ⁽¹⁾

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

8,0

10,0

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,3

2,5

3,8

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,004

0,008

0,012

0,016

0,02

0,024

0,032

0,04

8% акриламид

Вода Р

2,3

4,6

6,9

9,3

11,5

13,9

18,5

23,2

Раствор акриламида ⁽¹⁾

1,3

2,7

4,0

5,3

6,7

8,0

10,7

13,3

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,3

2,5

3,8

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,003

0,006

0,009

0,012

0,015

0,018

0,024

0,03

10% акриламид

Вода Р

1,9

4,0

5,9

7,9

9,9

11,9

15,9

19,8

Раствор акриламида ⁽¹⁾

1,7

3,3

5,0

6,7

8,3

10,0

13,3

16,7

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,3

2,5

3,8

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,016

0,02

12% акриламид

Вода Р

1,6

3,3

4,9

6,6

8,2

9,9

13,2

16,5

Раствор акриламида ⁽¹⁾

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

16,0

20,0

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,3

2,5

3,8

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,016

0,02

14% акриламид

Вода Р

1,4

2,7

3,9

5,3

6,6

8,0

10,6

13,8

Раствор акриламида ⁽¹⁾

2,3

4,6

7,0

9,3

11,6

1,.9

18,6

23,2

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,2

2,5

3,6

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,016

0,02

15% акриламид

Вода Р

1,1

2,3

3,4

4,6

5,7

6,9

9,2

11,5

Раствор акриламида ⁽¹⁾

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

20,0

25,0

1.5М Трис (рН 8.8) ⁽²⁾

1,3

2,5

3,8

5,0

6,3

7,5

10,0

12,5

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,4

0,5

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,016

0,02

(1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1) Р.

(2)

1.5М Трис (рН 8.8): 1.5М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 8.8 Р.

(3) Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфоната Р.

(4) Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Аммония персульфат

доставляет свободные радикалы, которые ускоряют полимеризацию акриламида и

бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата разлагается, следует готовить

еженедельно свежие растворы

(5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин Р.

Приготовление концентрирующего геля. После завершения полимеризации

(около 30 минут) сливают изобутанол и промывают верхнюю поверхность геля

несколько раз водой для удаления нанесенного изобутанола и каких-либо

неполимеризованных излишек акриламида. Удаляют как можно больше жидкости с

поверхности геля при помощи кончика бумажной салфетки.

В конической колбе готовят соответствующий объем концентрирующего геля

с необходимой концентрацией акриламида, используя значения, указанные в Табл.

2.2.31.-2. Компоненты смешивают в обозначенной последовательности. Если

необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭД

раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр

пор 0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая фильтрационное

приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Прибавляют

соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭД, как указано

в Табл. 2.2.31.-2, взбалтывают (встряхивают вращательными движениями) и сразу

заливают в пространство между двумя пластинками кассеты прямо на поверхность

полимеризованного разделительного геля. В раствор концентрирующего геля сразу

вкладывают чистый политетрафторэтиленовый гребень для избежания появления

воздушных пузырьков. Прибавляют еще раствор концентрирующего геля до

полного заполнения пространства гребня. Гель выдерживают в вертикальном

положении при комнатной температуре до полимеризации.

Таблица 2.2.31.-2

Приготовление концентрирующего геля

Компоненты раствора

Объемы компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью

1мл

2мл

3мл

4мл

5мл

6мл

8мл

10мл

Вода Р

0,68

1,4

2,1

2,7

3,4

4,1

5,5

6,8

Раствор акриламида ⁽¹⁾

0,17

0,33

0,5

0,67

0,83

1,0

1,3

1,7

1.0М Трис (рН 6.8) ⁽²⁾

0,13

0,25

0,38

0,5

0,63

0,75

1,0

1,25

Раствор 100 г/л ДСН ⁽³⁾

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,08

0,1

Раствор 100 г/л АПС ⁽⁴⁾

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,08

0,1

ТЕМЭД ⁽⁵⁾

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,008

0,01

(1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1) Р.

(2) 1.0М Трис (рН 6.8): 1.5М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 6.8 Р.

(3) Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфоната Р.

(4) Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Аммония персульфат

доставляет свободные радикалы, которые ускоряют полимеризацию акриламида и

бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата разлагается, следует готовить

еженедельно свежие растворы

(5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин Р.

Сборка

электрофоретического

прибора

проведение

электрофоретического разделения. После завершения полимеризации (около 30

минут) осторожно удаляют политетрафторэтиленовый гребень. Сразу

ополаскивают стенки водой или буферным рабочим раствором для

электрофореза в системе ДСН-ПАГ Р для удаления излишков

неполимеризованного акриламида. При необходимости поправляют выступ

концентрирующего геля тупой гиподермичной иголкой, надетой на шприц. Снимают

зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивая трубку. Аналогично

снимают зажимы с другой короткой стороны. Затем удаляют трубку со дна геля.

Помещают гель в электрофоретичный прибор. Верхний и нижний резервуары

наполняют буфером для электрофореза. Удаляют все пузырьки, образующиеся на

поверхности геля между двумя стеклянными пластинками. Для этих целей лучше

всего использовать иголку, надетую на шприц. Не следует проводить

первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к

нарушению непрерывности буферной системы. Перед нанесением образцов

осторожно ополаскивают отверстие буфрным рабочим раствором для

электрофореза в системе ДСН-ПАГ Р. Готовят испытуемые растворы и растворы

сравнения в рекомендованном буфере для образцов и обрабатывают, как указано в

частной статье. Наносят необходимое количество каждого раствора в карманы

концентрирующего геля. Начинают электрофорез в условиях, указанных в

инструкции к прибору. Изготовители ДСН-ПАГ приборов могут поставлять гели

разных размеров и толщины. Для получения оптимального разделения необходимо

подбирать время проведения электрофореза, а также силу тока/напряжения

соответственно с указанием изготовителя приборов.

Необходимо удостовериться, что окрашенный фронт доходит до

разделительного геля. Когда краситель доходит до нижнего края геля,

электрофорез заканчивают. Кассету геля вынимают из прибора и отделяют

стеклянные пластинки. Вытаскивают прокладки, отрезают, отделяют

концентрирующий гель и окрашивают полученный гель.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ

Наиболее широко применяется метод окрашивания белков красителем

Кумасси (# кислотный синий 92), позволяющий определить от 1 мкг до 10 мкг белков

в одной полосе. Окрашивание серебром - наиболее чувствительный метод для

окрашивания белков в гелях, при этом определяются полосы, содержащие от 10 нг

до 100 нг белка.

Все стадии окрашивания геля проводят при комнатной температуре,

осторожно встряхивая (например, на платформе шейкера) в подходящей посуде.

При окрашивании гелей необходимо надевать рукавицы, так как на геле остаются

отпечатки пальцев.

Краска Кумасси. Гель погружают в большой объем раствора краски

Кумасси Р, выдерживают продолжительностью не менее 1 часа. Затем сливают

раствор для окрашивания.

Гель обесцвечивают большим объемом обесцвечивающего раствора Р.

Обесцвечивающий раствор меняют несколько раз до четкого проявления белковых

полос на прозрачном фоне. Чем тщательнее обесцвечивают гель, тем меньшее

количество белков можно найти этим методом. Обесцвечивание можно ускорить

использованием нескольких граммов анионобменной смолы или маленькой губки,

смоченной обесцвечивающим раствором Р.

ПРИМЕЧАНИЕ. Кислотно-спиртовые растворы, используемые в указанных

методиках, не полностью фиксируют белки в геле. Это может привести к

потерям некоторых низкомолекулярных белков в процессе окрашивания и

обесцвечивания тонких гелей. Стойкая фиксация обеспечивается

выдерживанием геля в смеси трихлоруксусная кислота Р - метанол Р - вода Р

(1:4:5) в течение 1 часа перед погружением геля в раствор краски Кумасси Р.

Окрашивание серебром. Гель погружают в большой объем фиксирующего

раствора Р и выдерживают продолжительностью 1 час. Фиксирующий раствор

сливают, гель заливают свежим фиксирующим раствором и выдерживают

продолжительностью не менее 1 часа и, если возможно, оставляют на ночь.

Фиксирующий раствор сливают и гель промывают большим объемом воды Р в

течение

1 ч. Затем гель выдерживают в растворе

1% (об/об) глутарового

альдегида Р в течение 15 мин, дважды промывают большим объемом воды Р,

каждый раз продолжительностью 15 минут, помещают в свежеприготовленный

реактив серебра нитрата Р и выдерживают по 15 мин в темном месте. Затем

трижды промывают большим объемом воды Р, каждый раз по 5 мин. Гель

выдерживают в растворе проявителя Р около

1 минуты до достаточного

окрашивания. Проявление останавливают, помещая гель в блокирующий растор Р

на 15 мин. Ополаскивают гель водой Р.

ВЫСУШИВАНИЕ ОКРАШЕННЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Гели высушивают в зависимости от использованного метода окрашивания.

Кумасси-окрашенные гели после стадии обесцвечивания выдерживают в растворе

100 г/л глицерина Р в течение

2 ч (возможно инкубирование на ночь). При

окрашивании серебром на конечной стадии ополаскивания выдерживают гель в

растворе 20 г/л глицерина Р в течение 5 мин.

Два листа пористой целлюлозной пленки погружают в воду Р и выдерживают

от 5 до 10 мин. Один из листов помещают на рамку высушивания, осторожно

наносят на него гель, удаляют воздушные пузырьки и наносят несколько

миллилитров воды Р по краям геля, накрывают другим листом, удаляют воздушные

пузырьки и завершают сборку рамки высушивания. Рамку помещают в сушилку и

оставляют при комнатной температуре до высушивания геля.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

Молекулярную массу белков определяют, сравнивая их подвижность с

известными белками известной молекулярной массой. Имеются заранее

смешанные смеси белков с известными и разными интервалами молекулярных

масс для равномерного окрашивания и калибрования гелей. Концентрированные

растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим

буферным раствором для образцов и наносят на тот же гель, что и испытуемый

белок.

Сразу после проведения электрофореза определяют электрофоретический

фронт красителя бромфенолового синего. Это можно сделать нанесением насечки

на край геля или введением иголки, смоченной индигокармином на фронт

красителя. После окрашивания измеряют расстояние миграции каждой белковой

полосы (известных и неизвестных) от края разделительного геля. Расстояние

передвижения каждого белка делят на расстояние, пройденное сопутствующим

красителем. Полученные результаты передвижения называются относительной

подвижностью белков (относительно фронта красителя) и условно обозначаются R_f.

Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс (М.м.)

белковых стандартов от условно полученных значений R_f. Обычно график имеет

слегка сигмовидную форму. Неизвестные молекулярные массы определяют

методом линейной регрессии интерполяцией графика зависимости log М.м. от R_f.,

если значения, полученные для неизвестных образцов, располагаются на линейной

части графика.

ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ

Результаты испытания признаются достоверными если молекулярные массы

известных белков расположены вдоль

80% длины геля и по всей области

необходимого деления (то есть, области, покрывающей образец и его димеры или

образец и сопровождающие примеси), разделение соответствующих белковых

полос проявляет линейную зависимость логарифма молекулярной массы от R_f.

Дополнительные условия к валидации по отношению к испытуемым растворам

указываются в частной статье.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ

Если в частной статье указывают предел содержания примесей, в испытании

необходимо использовать раствор сравнения соответствующего разведения.

Например, если предел содержания примесей составляет

5%, необходимо

использовать раствор сравнения, разведенный по отношению к испытуемому

раствору в соотношении 1:20. На электрофореграмме испытуемого раствора ни

одна примесь (ни одна полоса, кроме основной) не должна быть интенсивнее

основной полосы на электрофореграмме раствора сравнения.

Для валидированной методики содержание примесей может определяться

методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с

использованием интегрирующего денситометра. При валидации методики

необходимо подтвердить линейность сигнала.

2.2.32. ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ ВЫСУШИВАНИИ

Определение потери в массе при высушивании проводят одним из

приведенных способов и выражают в процентах (масса/масса).

Методика. Указанное в частной статье количество испытуемого вещества

помещают во взвешенный бюкс, предварительно высушенный в условиях,

описанных для испытуемого вещества. Вещество сушат до постоянной массы или

в течение времени, указанного в частной статье, одним из следующих способов:

а) «в эксикаторе»: высушивание проводят над фосфора (V) оксидом Р

при атмосферном давлении и комнатной температуре;

б) «в вакууме»: высушивание проводят над фосфора (V) оксидом Р при

давлении от 1,5 кПа до 2,5 кПа и комнатной температуре;

в)

«в вакууме» в пределах указанного температурного интервала:

высушивание над фосфора (V) оксидом Р при давлении от 1,5 кПа до 2,5 кПа и

температуре, указанной в частной статье;

с)

«в пределах указанного температурного интервала»: высушивание в

сушильном шкафу при температурном интервале, указанном в частной статье;

д) «в глубоком вакууме»: высушивание над фосфора (V) оксидом Р при

давлении не более 0,1 кПа и температуре, указанной в частной статье.

Если указаны иные условия, используемая методика полностью

описывается в частной статье.

2.2.33. СПЕКТРОМЕТРИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Спектрометрия ядерного магнитного резонанса

(ЯМР) основана на

существовании постоянного магнитного момента ядер ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P. Во внешнем

магнитном поле (основное поле) такие ядра приобретают целиком определенную

ориентацию по отношению к направлению этого поля; ориентация вектора

магнитного момента атома соответствует определенным уровням энергии. При

заданном напряжении поля переходы между соседними энергетическими уровнями

происходят

вследствие

поглощения

электромагнитного

излучения

характеристических длин волн в диапозоне радиочастот.

Соответствующие частоты могут быть найдены или путем последовательного

поиска резонансных положений

(непрерывная спектрометрия), или путем

одномоментного возбуждения всех возможных переходов многочастотным

импульсом с дальнейшей компьютерной обработкой спада свободной индукции

излучения, которая удаляется системой при возврате в основное положение

(импульсная спектрометрия).

Спектр протонного магнитного резонанса представляет собой набор

сигналов, которые соответствуют протонам и характеризуют их ядерное и

электронное окружение в молекуле. Сдвиг частоты данного сигнала относительно

сигнала стандартного вещества называется химическим сдвигом (δ) и выражается

в миллионных долях (ppm); химический сдвиг характеризует протон в зависимости

от его электронного окружения. Сигналы часто расщепляются на группы

родственных пиков, называемых дуплетами, триплетами, квартетами…

мультиплетами. Это обусловлено присутствием постоянных магнитных полей,

вызванных соседними ядрами, особенно других протонов, расположенных в

радиусе двух-пятивалентных связей. Интенсивность сигнала, который

определяется как площадь под соответствующей кривой, пропорциональна числу

эквивалентных протонов.

Прибор. ЯМР-спектрометр для спектрометрии непрерывного действия

состоит из магнита, генератора низкочастотного разрешения, держателя образца,

радиочастотных выпрямителей и приемника, регистрирующего устройства и

электронного интегратора. Импульсный спектрометр снабжается кроме этого

импцульсным выпрямителем и компьютером для сбора, хранения и

математического преобразования данных к спектру обычного вида.

Используются ЯМР-спектрометры, которые работают при частоте не менее

60 МГц для

¹Н. Если отсутствуют специальные указания, руководствуются

инструкцией изготовителя. Прежде чем проводить регистрацию спектра,

необходимо убедиться, что:

1. Разность равна не более 0,5 Гц; для этого измеряют при подходящем

масштабе шкалы ширину пика на половине высоты; или полосу δ 7,33 ppm

симметричного мультиплета раствора

20%

(об/об) дихлорбензола Р в

дейтерированном ацетоне Р; или полосы при δ 7,51 ppm раствора 5% (об/об)

тетраметилсилана Р в дейтерированном хлороформе Р.

2. Отношение сигнал/шум (S/N), измеренное в диапозоне от δ 2 ppm до δ 5

ppm для спектра раствора

1% (об/об) этилбензола Р в дейтерированном

хлороформе Р составляет как минимум 25:1. Эти отношения расчитываются как

среднее из пяти последовательных измерений по формуле:

где:

А - амплитуда, в милиметрах, наибольшего из пиков метиленового квартета

этилбензола с центром при δ 2,65 ppm. Амплитуду измеряют от базовой линии,

что образуется от центра области шума с какой-нибудь из сторон квартета на

расстоянии как минимум 1 ppm от этого центра;

Н - полная амплитуда шума базовой линии, в милиметрах, между δ 4 ppm и δ 5

ppm.

3. Амплитуда боковых полос, обусловленных вращением, не превышает 2%

высоты пика образца при соответствующей данному пику спектрометра скорости

вращения ампулы с образцом.

При

проведении

количественных

измерений

проверяют

воспроизводимость сигналов интегратора, используя раствор

(об/об)

этилбензола Р в дейтерированном хлороформе Р. Проводят пять измерений для

протонов этильных групп и расчитывают среднее значение. Ни один из измеренных

результатов не должен отличаться от среднего более чем на 2,5%.

Методика. Испытуемый образец растворяют, как указано в частной статье, и

фильтруют; раствор должен быть прозрачным. Для определения химического

сдвига используют внутренний стандарт. Если нет других указаний, в качестве

внутреннего стандарта используют или раствор (от 0,5% (об/об) до 1,0% (об/об))

тетраметилсилана Р (ТМС) в тейтерированных органических растворителях, или

раствор от 5 г/л до 10 г/л натрия тетрадейтеродиметилсилапентаноата Р в

дейтерия оксиде Р. Подбирают необходимое количество и проводят регистрацию

спектра.

СПЕКТРОСКОПИЯ НЕПРЕРЫВНОГО ДЕЙСТВИЯ

Прибор настраивают к работе настолько близко к модели чистого

поглощения, насколько это возможно, используя также радиочастотную настройку,

что позволяет избежать насыщения сигналов. Чувствительность спектрометра

регулируют таким образом, чтобы наибольший из пиков в спектре испытуемого

вещества занимал практически всю шкалу регистрирующего приспособления и

чтобы сигнал внутреннего стандарта соответствовал химическому сдвигу δ 0,00

ppm. Регистрируют спектр в указанной области при разрешающей скорости не

более 2 Гц/с, если нет других указаний в частной статье. Снимают интегральный

спектр в той же области при подходящей разрешающей скорости в зависимости от

используемого спектрометра. Количественные измерения проводятся так, как

указано в частной статье.

ИМПУЛЬСНАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ

Параметры спектрометра, например, угол вращения, амплитуда импульса,

интервал между импульсами, спектральная ширина, число экспериментальных

точек и скорость поступления данных в компьютер, определяются соответственно

инструкцией изготовителя прибора, и регистрируется спад свободной индукции

необходимое число раз. После математической компьютерной обработки данных

регулятор фазы устанавливают таким образом, чтобы получить при возможности

чистый спектр поглощения, и калибруют спектр по отношению резонансной к

чистоте химического сдвига внутреннего стандарта. Спектр, сохраняемый в

компьютере, выводят на подходящее приспособление и в случае количественных

измерений обсчитывают интеграл с учетом возможностей прибора.

2.2.34. ТЕРМОГРАВИМЕТРИЯ

Термический анализ объединяет группу методов, при помощи которых

определяется зависимость различных физических свойств веществ от

температуры. Обычно в большинстве используемых методов определяют

изменение энергии или массы испытуемого образца.

# Характерной особенностью термических методов анализа является их

универсальность. Инструментальные методы термического анализа дают

информацию о кристаллической структуре, температуре кипения, способности к

сублимации, дегидратации, твердофазном взаимодействии. Эта информация

может быть использована для идентификации, определения чистоты, влажности и

стабильности веществ, количественного определения термонестойких веществ,

выявления присутствия полиморфных форм, для характеристики совместимости

субстанций и вспомогательных веществ в лекарственных средствах, выбора

упаковки и контроля качества.

# Различают термогравиметрию, термометрическое титрование,

дифференциальный термический анализ, дифференциальную отраженную

колориметрию, дериватографию, термомикроскопию.

# Термические методы анализа, как правило, не требуют больших количеств

веществ, непродолжительны по времени выполнения. В частности, определение

потери в массе при высушивании методом термогравиметрии включают в

частные статьи на дорогие субстанции. В частных статьях следует указывать

параметры, необходимые для корректного выполнения методики, например:

скорость и температуру нагревания, инертный газ и скорость его потока.

Термогравиметрия представляет собой метод, при помощи которого

регистрируют изменение массы испытуемого образца от программированного

изменения температуры.

Прибор. Основными составляющими частями прибора являются:

приспособление для нагревания или охлаждения вещества соответственно

заданной температурной программы, камера для образца с контролируемой

атмосферой, электровесы и регистрирующее устройство. К прибору может быть

присоединено приспособление для анализа летучих веществ.

Проверка температурной шкалы. Проверку температурной шкалы проводят

в соответвии с инструкцией изготовителя с использованием никеля или другого

подходящего материала.

Градуировка весов. Подходящее количество ФСО кальция оксалата

моногидрата помещают в контейнер и регистрируют его массу. Начинают

нагревание образца по программированному изменению температуры

соответственно инструкции изготовителя. Термогравиметрическую кривую

регистрируют в виде графика: показания температуры откладывается по оси абсцис

по возрастанию значений слева направо; показания массы откладывается по оси

ординат по возрастанию значений снизу вверх. При температуре около 230^оС

повышение температуры приостанавливают. На графике измеряют расстояние

между начальным и конечным плато, что соответствует изменению массы образца.

Полученную величину сопоставляют с величиной, указанной в маркировке кальция

оксалат моногидрат ФСО.

Методика. Изменение массы испытуемого образца определяют в условиях,

указанных в частной статье. Потерю в массе испытуемого образца определяют

измеряя расстояние между начальным и конечным плато на гравиметрической

кривой и выражают в процентах (м/м).

При регулярном использовании прибора периодически проводят градуировку

и проверку температурной шкалы.

2.2.35. ОСМОЛЯЛЬНОСТЬ

Осмоляльность — это показатель, позволяющий оценить суммарный вклад

различных растворенных веществ в осмотическое давление раствора.

Приближенный расчет осмоляльности ξ_m водного раствора проводят по формуле:

mФ

m =J

где:

J — суммарное число ионов, образующихся из одной молекулы растворенного

вещества в результате диссоциации. В случае, если растворенное

вещество не диссоциирует на ионы, J = 1;

т — моляльность раствора, т.е. число молей растворенного вещества на

килограмм растворителя;

Ф — моляльный осмотический коэффициент, учитывающий взаимодействие между

ионами противоположного знака в растворе и зависящий от величины т.

По мере усложнения состава раствора усложняется и определение

величины Ф.

Единицей осмоляльности является осмоль на килограмм растворителя

(осмоль/кг), но на практике обычно используется единица милллиосмоль на

килограмм растворителя (мосмоль/кг).

Осмоляльность определяют по понижению температуры замерзания

раствора, если нет других указаний в частной статье. Зависимость между

осмоляльностью и понижением температуры замерзания ΔТ выражают

соотношением:

100мосмоль/кг

1,86

Прибор. Составными частями прибора (осмометра) являются:

— приспособление для охлаждения сосуда с измерительной кюветой;

— система для измерения температуры, состоящая из чувствительного к

температуре сопротивления (термистора) с соответствующим устройством для

измерения тока или разности потенциалов. Измерительное устройство может

быть градуировано в градусах понижения температуры или непосредственно в

единицах осмоляльности;

— как правило, приспособление для перемешивания образца.

Методика. Готовят стандартные растворы в соответствии с таблицей 2.2.35.-

Таблица 22.2.35.-1.

Стандартные растворы для калибровки осмометра

Масса натрия

Фактическая

Теоретическая

Моляльный

Криоскопическое

хлорида Р, в

осмоляльность

осмотический

понижение

граммах на

(мосмоль/кг)

идеального

коэффициент

температуры

килограмм воды Р

раствора

(°С)

(мосмоль/кг)

3,087

100

105,67

0,9463

0,186

6,260

200

214,20

0,9337

0,372

9,463

300

323,83

0,9264

0,558

12,684

400

434,07

0,9215

0,744

15,916

500

544,66

0,9180

0,930

19,147

600

655,24

0,9157

1,116

22,380

700

765,86

0,9140

1,302

Устанавливают нулевое значение на шкале прибора, используя воду Р.

Проводят градуировку прибора, используя стандартные растворы: помещают от

50 мкл до 250 мкл стандартного раствора в измерительную ячейку и начинают

охлаждение системы. Чтобы предотвратить переохлаждение, измерительное

устройство, как правило, программируют на работу при температурах более

низких, чем ожидаемое криоскопическое понижение температуры.

Соответствующее устройство указывает на достижение равновесия. Перед

каждым измерением ячейку ополаскивают соответствующим стандартным

раствором.

Те же операции проводят с испытуемым раствором. При этом перед

каждым измерением кювету ополаскивают испытуемым раствором. Результаты

либо непосредственно определяют по шкале прибора, либо рассчитывают по

измеренному понижению температуры замерзания. Результаты считают

достоверными, если полученное значение осмоляльности испытуемого раствора

не выходит за пределы значений осмоляльности двух стандартных растворов,

использованных для калибровки.

# Наряду с понятием «осмоляльность» в практике используется понятие

«осмолярность». Аналогично осмоляльности осмолярность

- показатель,

позволяющий оценить суммарный вклад различных растворенных веществ в

осмотическое давление раствора.

# Данные показатели близки и отличаются друг от друга только

различным способом выражения концентрации растворов

— моляльной и

молярной.

# Осмоляльность — количество осмолей на 1 кг растворителя;

# Осмолярность — количество осмолей на 1 л раствора.

Для идеальных растворов масса осмоля, в граммах, представляет собой

отношение грамм-молекулярной массы вещества к числу частиц или ионов,

образующихся при его растворении.

# Для разбавленных растворов, близких к идеальным, осмоляльность и

осмолярность могут быть рассчитаны теоретически.

# Осмолярность идеальных растворов может быть рассчитана по формуле:

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 6