ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

ВВОД ОБРАЗЦА

Первой стадией анализа является ввод образца в прибор без значительного

нарушения вакуума. В широко распространённом методе, называемом прямым

вводом жидкости, образец помещается на конец цилиндрического штока

(в

кварцевом тигле, на проволоке или на металлической поверхности). Этот шток

через вакуумный шлюз, в котором поддерживается первичный промежуточный

вакуум между атмосферным давлением и вторичным вакуумом прибора, вводится в

спектрометр.

Другие системы ввода позволяют проанализировать компоненты смеси, так

как они разделяются с помощью соответствующего прибора, соединённого с масс-

спектрометром.

Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании

подходящих колонок

(капиллярных или полукапиллярных) возможно

непосредственное введение конца колонки в ионный источник прибора без

применения сепаратора.

Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация

особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются

недостаточно летучими либо слишком термолабильными, для того чтобы их можно

было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-

спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой

фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких

как:

- прямой жидкостный ввод: подвижная фаза распыляется и растворитель

испаряется перед ионным источником прибора,

- интерфейс с пучком частиц: подвижная фаза, скорость которой может достигать

0,6 мл/мин, распыляется в десольватационной камере, в результате в ионный

источник прибора попадают лишь анализируемые вещества в нейтральной форме;

данный способ может быть использован для соединений с относительно низкой

полярностью и молекулярными массами меньше 1000 Да,

- интерфейс с движущейся полосой: подвижная фаза, скорость которой может

достигать

1 мл/мин, наносится на поверхность движущейся полосы; после

выпаривания растворителя анализируемые вещества переносятся к ионному

источнику прибора, где подвергаются ионизации; данный способ плохо подходит

для очень полярных или термолабильных соединений.

Другие виды интерфейсов

(электрораспыление, термораспыление,

химическая ионизация при атмосферном давлении) могут рассматриваться как

самостоятельные методы ионизации и описаны в разделе, посвящённом способам

ионизации.

Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия.

Подвижная фаза, обычно состоящая из находящегося в сверхкритическом

состоянии диоксида углерода, переходит в газообразное состояние после

прохождения через нагретую заслонку, находящуюся между колонкой и ионным

источником.

Капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия. Элюент вводится в

ионный источник, в некоторых случаях после добавления дополнительного

растворителя, для того чтобы достичь скорости потока порядка нескольких

миллилитров в минуту. Ограничениями данного метода являются малые

количества вводимого образца и необходимость использовать летучие буферные

растворы.

СПОСОБЫ ИОНИЗАЦИИ

Электронный удар. Образец, находящийся в газообразном состоянии,

ионизируется потоком электронов, энергия которых (обычно 70 эВ) больше энергии

ионизации образца. При этом кроме молекулярного иона M⁺ образуются

осколочные ионы характерные для данной молекулярной структуры. Главным

ограничением данного способа является необходимость испарения образца, что

делает невозможным его применение для полярных, термолабильных или

высокомолекулярных соединений. Ионизация электронным ударом может быть

использована в газовой хроматографии, соединённой с масс-спектрометрией, а в

некоторых случаях и в жидкостной хроматографии.

Химическая ионизация. Этот тип ионизации предполагает использование

реагентного газа, такого как метан, аммиак, монооксид азота, диоксид азота или

кислород. Спектр характеризуется ионами (M + H)⁺ или (M − H)^- типов или ионами-

аддуктами, образованными из аналита и используемого газа. Осколочные ионы

образуются реже, чем при ионизации электронным ударом. Для термолабильных

веществ используется разновидность данного метода ионизации, при которой

образец, находящийся на проволоке, очень быстро испаряется вследствие

эффекта Джоуля-Томсона (десорбционная химическая ионизация).

Бомбардировка быстрыми атомами

(FAB) или ионизация

бомбардировкой быстрыми ионами

(жидкостная масс-спектрометрия

вторичных ионов - LSIMS). Образец, растворённый в вязкой матрице, например в

глицерине, наносится на металлическую поверхность и ионизируется потоком

нейтральных атомов, например, аргона или ксенона или обладающими большой

кинетической энергией ионами цезия. Образуются ионы (M + H)⁺ или (M − H)^- типов

либо ионы-аддукты, сформированные матрицей или образцом. Данный тип

ионизации хорошо подходит для полярных, термолабильных соединений, имеющих

молекулярную массу до 10000 Да. При добавлении к подвижной фазе 1 - 2%

глицерина он может быть использован для жидкостной хроматографии, однако

скорость подвижной фазы должна быть очень низкой (несколько микролитров в

минуту). При нанесении тонкого слоя матрицы на поверхность хроматографических

пластинок такой способ ионизации может быть использован и в тонкослойной

хроматографии.

Полевая десорбция или полевая ионизация. Образец испаряется около

вольфрамовой проволоки, покрытой микроиглами

(полевая ионизация) или

помещается на эту проволоку (полевая десорбция). Сильное электрическое поле

(напряжение около 10 кВ), возникающее между проволокой и противоэлектродом,

ионизирует образец. При данных способах ионизации образуются

преимущественно молекулярные ионы M⁺ и

+ H)⁺ ионы. Эти способы

используются для малополярных и/или термолабильных соединений.

Лазерная десорбция - ионизация с помощью матрицы (MALDI). Образец

смешанный с подходящей матрицей и помещённый на металлическую подложку,

ионизируется импульсным лазерным излучением с длиной волны от УФ- до ИК-

диапазона (продолжительность импульсов может составлять от пикосекунды до

нескольких наносекунд). Данный способ ионизации играет важную роль при анализе

соединений с очень большой молекулярной массой (более чем 100 000 Да), но

ограничен использованием времяпролётного анализатора (см. ниже).

Электрораспылительная ионизация. Данный способ ионизации проводится

при атмосферном давлении. Образец, находящийся в растворе, вводится в

источник через капилляр, конец которого имеет потенциал порядка 5 кВ. Для

облегчения распыления может использоваться газ. Испарение молекул

растворителя из образующихся микрокапель приводит к образованию в газовой

фазе однозарядных или многозарядных ионов. Скорости подвижной фазы при

данном виде ионизации могут изменяться от нескольких микролитров в минуту до 1

мл/мин. Такая ионизация подходит для полярных соединений, а также для

исследования биомолекул с молекулярными массами до 100 000 Да. Она может

сочетаться с жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом.

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). Ионизация

проводится при атмосферном давлении под действием электрода, имеющего

потенциал несколько киловольт и помещённого на пути подвижной фазы, которая

распыляется как вследствие тепловых эффектов, так и благодаря использованию

потока азота. Образующиеся ионы являются однозарядными и относятся к (M + H)⁺

типу в случае положительного заряда и к (M − H)^- типу в случае отрицательного.

Возможность использования высоких скоростей подвижной фазы

(до 2 мл/мин)

делает этот способ ионизации идеальным для сочетания с жидкостной

хроматографией.

Термораспылительная ионизация. Образец, находящийся в подвижной

фазе, состоящей из воды, органических модификаторов и содержащей летучий

электролит

(обычно ацетат аммония) вводится в распыленной форме после

прохождения через металлический капилляр, температура которого

контролируется. Допускаются скорости подвижной фазы порядка 1 мл/мин - 2

мл/мин. Ионы электролита ионизируют анализируемое соединение. Такой процесс

ионизации может быть заменён или усилен электрическим разрядом величиной

около 800 вольт, особенно при использовании только органического растворителя.

Данный способ ионизации может быть использован в методе жидкостной

хроматографии-масс-спектрометрии.

АНАЛИЗАТОРЫ

Различия в работе анализаторов зависят, главным образом, от двух

параметров:

- диапазон, в котором могут быть измерены отношения m/z (массовый диапазон),

- разрешение, характеризуемое возможностью разделить два иона одинаковой

интенсивности с отношениями m/z, отличающимися на ΔM и перекрывающиеся при

определённом процентном превышении базовой линии; например, разрешение

(M/ΔM) равное 1000 с 10% превышением базовой линии позволяет провести

разделение отношений m/z 1000 и 1001 с интенсивностями, на 10% превышающими

базовую линию. В некоторых случаях

(времяпролётные анализаторы,

квадрупольные анализаторы, ионные ловушки) разрешение может быть

определено как отношение между молекулярной массой и шириной пика на

половине высоты (50% превышение базовой линии).

Магнитные и электростатические анализаторы. Ионы, образовавшиеся в

ионном источнике, ускоряются потенциалом V и сосредотачиваются, в зависимости

от устройства прибора, между магнитным

(магнитное поле B) или

электростатическим анализаторами (электростатическое поле E). В соответствии с

законом Лапласа они перемещаются по траектории с радиусом r:

²r

Для накопления и измерения различных ионов, образовавшихся в источнике,

могут быть использованы два типа сканирования: изменение B при постоянной

величине V или изменение V при постоянной величине B. За магнитным

анализатором обычно следует электрический сектор, который действует как фильтр

кинетической энергии и позволяет заметно увеличить разрешение прибора.

Максимальное разрешение такого прибора (двойной сектор) изменяется от 10000

до 150000 и в большинстве случаев позволяет достаточно точно оценить величину

отношений m/z для определения элементного состава соответствующих ионов. Для

однозарядных ионов массовый диапазон равен от 2000 до 15000 Да. Некоторые

ионы могут разрушаться спонтанно

(метастабильные переходы) или при

столкновении с газом

(диссоциация, активированная столкновением

(CAD)) в

областях между ионным источником и детектором, где отсутствует поле.

Исследование этих процессов разрушения очень полезно для определения

структуры и характеристики определённого соединения, входящего в состав смеси,

и делает возможным использование тандемной масс-спектрометрии. В зависимости

от места, в котором протекают процессы разрешения, известно много методик,

которые могут быть использованы для этого:

- режим дочернего иона

(определение состава ионов, образовавшихся при

разрушении определённого родительского иона): B/E = константа, MIKES (Mass-

analysed Ion Kinetic Energy Spectroscopy),

- режим родительского иона

(определение всех ионов, образовавшихся при

разрушении иона с определённым отношением m/z): B²/E = константа,

- режим нейтральных частиц

(определение всех ионов, которые теряют

идентичные фрагменты):

B/E(1 − E/E₀)^1/2 = константа, где E₀ базовый потенциал электрического сектора.

Квадрупольные анализаторы. Анализатор состоит из четырёх

параллельных металлических стержней, имеющих цилиндрическое или

гиперболическое поперечное сечение. Они расположены симметрично по

отношению к траектории движения ионов; пары противоположных стержней

присоединены к электрическому источнику. Потенциалы двух пар стержней

противоположны. Они состоят из постоянного и изменяющегося компонентов. Ионы,

образовавшиеся в ионном источнике, пропускаются и разделяются вследствие

изменения потенциалов, приложенных к стержням, причём отношение постоянного

потенциала к переменному должно оставаться неизменным. Квадрупольные

анализаторы обычно имеют массовый диапазон от 1 атомной единицы массы до

2000 атомных единиц массы., хотя в некоторых случаях он может достигать 4000

атомных единиц массы. Несмотря на то, что такие анализаторы имеют меньшее

разрешение, чем магнитные, они позволяют получать моноизотопный профиль

однозарядных ионов, полученных во всём массовом диапазоне. Для получения

спектров можно использовать три квадруполя, соединённых друг с другом, Q₁, Q₂,

Q₃

(Q₂ служит ионизационной камерой, и в действительности не является

анализатором; чаще всего в качестве ионизирующего газа применяют аргон).

Наиболее часто используемыми режимами сканирования являются:

- режим дочернего иона: Q₁ выбирает m/z ион, фрагменты которого, полученные

при ионизации в квадруполе Q₂, анализируются квадруполем Q₃,

- режим родительского иона: Q₃ пропускает ионы только с определённым

соотношением m/z, в то время как Q₁ сканирует определённый массовый диапазон.

Детектируются только ионы, при разрушении которых образуется ион, отбираемый

квадруполем Q₃.

- режим нейтральных частиц: Q₁ и Q₃ сканируют определённый массовый

диапазон, но в интервале, соответствующем фрагментам, которые теряет

определённое вещество или группа веществ.

Для получения спектров возможно сочетание квадрупольных анализаторов с

магнитными или электростатическими, такие приборы называют гибридными масс-

спектрометрами.

Ионные ловушки. Данные анализаторы имеют такой же принцип работы, что

и квадрупольные, но в них используются трёхмерные электрические поля.

Анализаторы такого типа позволяют получать спектры ионов нескольких генераций

(MSⁿ).

Циклотронно-резонансные масс-анализаторы. Ионы, образовавшиеся в

ячейке и подвергнутые действию интенсивного магнитного поля, движутся по

круговым траекториям с частотами, которые могут быть непосредственно связаны с

величинами отношений m/z для этих ионов при помощи преобразования Фурье.

Данное явление называется ионно-циклотронным резонансом. Анализаторы такого

типа состоят из сверхпроводящих магнитов и обладают очень высокой

разрешающей способностью (до 1000000 и выше), а также позволяют получать MSⁿ

спектры. Их недостатком является необходимость использования очень глубокого

вакуума (порядка 10⁻⁷ Па).

Времяпролётные анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионном

источнике, ускоряются потенциалом величиной от 10 кВ до 20 кВ. Они проходят

через анализатор, состоящий из бесполевой трубы длиной от 25 см до 1,5 м,

обычно называемой пролётной трубой.

Время (t), за которое ион достигает детектора, пропорционально квадратному

корню из отношения m/z. Теоретически массовый диапазон для такого анализатора

бесконечен. Практически он определяется методом ионизации или десорбции.

Времяпролётные анализаторы используются, главным образом, для

высокомолекулярных соединений (вплоть до нескольких сотен тысяч дальтон).

Данный способ ионизации обладает очень высокой чувствительностью (достаточно

несколько пикомолей вещества). Точность измерений и разрешение таких приборов

могут быть значительно улучшены при использовании электростатического зеркала

(рефлектрона).

ПОЛУЧЕНИЕ СИГНАЛА

Имеются три возможных режима получения сигнала.

Режим полного спектра. Записывается полный сигнал, полученный для

выбранного массового диапазона. Спектр представляет собой зависимость

относительной интенсивности различных ионов от величины m/z. Получаемые

результаты являются, главным образом, качественными. Для более быстрой

идентификации возможно использование библиотек спектров сравнения.

Фрагментометрический режим

(селективное сканирование ионов).

Получаемый сигнал ограничен одним

(сканирование одного иона, single-ion

monitoring (SIM)) или несколькими (множественное ионное сканирование, multiple-

ion monitoring (MIM)) ионами, характерными для анализируемого вещества. В этом

режиме предел обнаружения значительно ниже. При использовании внутреннего

или внешнего стандартов (например, дейтерированные стандарты) могут быть

проведены количественные или полуколичественные измерения. При

использовании времяпролётных анализаторов такие измерения невозможны.

Двойной фрагментометрический масс-спектрометрический режим

(множественный мониторинг реакций, multiple reaction monitoring

(MRM)).

Включает специфическую мономолекулярную или бимолекулярная реакцию

разрушения выбранного иона-предшественника, характерного для анализируемого

вещества. Селективность и высокая специфичность данного режима получения

сигнала обеспечивают превосходную чувствительность и делают его наиболее

подходящим для количественных определений с использованием подходящих

внутренних стандартов

(например, дейтерированных стандартов). Данный вид

анализа может быть проведен только при использовании приборов, снабжённых

тремя соединёнными квадруполями, ионными ловушками или циклотронно-

резонансными анализаторами.

ГРАДУИРОВКА

Градуировка позволяет установить соответствие между величиной m/z и

детектируемым сигналом. Как правило, она проводится с использованием вещества

сравнения. Градуировка может быть внешней (данные находятся в другом файле)

или внутренней (вещество (вещества) сравнения смешивается с исследуемым

веществом и результаты вносятся в файл с данными анализа). Число ионов или

точек, необходимое для надёжной градуировки, зависит от типа анализатора и

требуемой точности измерений, например, в случае магнитного анализатора, где

отношение m/z экспоненциально изменяется при изменении величины магнитного

поля необходимо брать настолько много точек, насколько это возможно.

ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА И ОБРАБОТКА ДАННЫХ

Ионы, разделённые анализатором, преобразуются в электрические сигналы

такими детектирующими системами, как фотоумножитель или электронный

умножитель. Затем данные сигналы усиливаются и превращаются в цифровые

сигналы, которые используются при обработке данных и позволяют проводить

различные операции: градуировку, получение спектров, автоматические

количественные расчёты, архивирование данных, создание или использование

библиотек масс-спектров. Различные физические параметры, требуемые для

работы прибора, в целом контролируются компьютером

2.2.44. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩЕГО ОРГАНИЧЕСКОГО УГЛЕРОДА В

ВОДЕ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Определение содержания общего органического углерода (ООУ) является

непрямым методом определения содержания сумм органических веществ в воде

для фармацевтического применения. Определение содержания ООУ может также

использоваться при контроле выполнения различных операций при производстве

лекарственных средств.

Поскольку для определения содержания ООУ могут применяться различные

методики, в данной статье приведены не описания методик, а их квалификация и

интерпретация результатов в предельных испытаниях. Испытания стандартного

раствора проводят через определенные интервалы времени, в зависимости от

частоты измерений; раствор готовят с использованием легкоокисялющейся

субстанции (например, сахароза) с такой концентрацией, чтобы отклик прибора

соответствовал измеряемому пределу содержания ООУ. Пригодность системы

проверяют с использованием трудноокисляющейся субстанции (например, 1,4-

бензохинон).

Разные типы приборов для определения ООУ в воде для фармацевтического

применения, как правило, предназначены для полного окисления органических

молекул в образце воды до углерода диоксида с последующим измерением его

количества, используемого затем для расчета концентрации углерода в воде.

Используемый прибор в процессе работы может определять органический и

неорганический углерод (неорганический углерод присутствует в виде карбонатов).

Это может обеспечиваться путем определения количества неорганического

углерода и вычитанием его из количества общего углерода или удалением

неорганического углерода из образца при помощи продувания перед окислением.

Органические молекулы могут удаляться с испытуемого образца в процессе

продувания, но часть углерода, связанного с ими, в воде для фармацевтического

применения, незначительна.

Прибор. Используют отградуированный прибор, установленный в режим “он-

лайн” или автономно. Пригодность системы проверяют, как описано ниже, через

определенный промежуток времени. Прибор должен иметь разрешающую

способность определения углерода - 0,05 мг/л или менее, соответственно паспорту

тзготовителя прибора.

Вода для определения содержания ООУ. Используют воду

высокоочищенную, соответствующую требованиям:

- удельная электропроводность: не более 1,0 мкСм·см^-1 при температуре 25^оС;

- содержание общего органического углерода: не более 0,1 мг/л.

В зависимости от типа используемого прибора, критическим параметром

может быть также содержание в воде тяжелых металлов или меди, что должно

быть указано в инструкции изготовителя прибора.

Подготовка посуды. Используют посуду, тщательно вымотую методом,

позволяющим удалить органические вещества. Для последнего промывания

используют воду для определения содержания ООУ.

Стандартный раствор. Сахарозу Р, предварительно высушенную при

температуре 105^оС в течение 3 ч, растворяют в воде для определения ООУ,

получая раствор, содержащий 1,19 мг/л сахарозы (0,50 сг/л углерода).

Испытуемый раствор. Испытуемую воду собирают, исключая минимальное

воздушное пространство, в плотноукупоренный контейнер, используя

приспособление для предотвращения загрязнения. Испытание проводят сразу с

целью устранения загрязнения воды от контейнера и его закрывающегося

ответстия.

Раствор для проверки пригодности системы. Готовят раствор 0,75 мг/л

1,4-бензохинона Р в воде для определения ООУ (0,50 мг/л углерода).

Контрольная вода для определения содержания ООУ. Используют воду

для определения содержания ООУ, полученную одновременно с водой для

приготовления стандартного раствора для проверки пригодности системы.

Контрольный раствор. Кроме контрольной воды для определения

содержания ООУ, готовят подходящий контролный раствор или другие растворы,

необходимые для восстановления базовой линии или корригирования градуировки

в соответствии с инструкцией изготовителя прибора; устанавливают ноль прибора с

использованием контрольных растворов.

Проверка пригодности системы. Проводят испытания указанных растворов и

записывают отклики прибора; эффективность откликов, в процентах, рассчитывают

по формуле:

-r

100,

-rW

где:

- отклик прибора, соответствующий воде для определения содержания ООУ;

- отклик прибора, соответствующий стандартному раствору;

- отклик прибора, соответствующий раствору для проверки пригодности

системы.

Система считается пригодной, если эффективность отклика прибора

составляет не менее 85% и не более 115% от теоретического отклика.

) для испытуемого раствора. Испытуемый

раствор выдерживает испытание, если значение

не превышает значение

Данная методика может быть выполнена в режиме «он-лайн» на приборе,

который соответствующим образом отградуирован и соответствует требованиям

пригодности системы. Прибор должен быть установлен таким образом, чтобы

обеспечить показания откликов, которые соответствуют испытуемой воде.

2.2.45. СВЕРХКРИТИЧЕСКАЯ ФЛЮИДНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Сверхкритическая флюидная хроматография

(СФХ, SFC)

- это метод

хроматографического разделения, в котором подвижная фаза является флюидом,

находящимся в сверхкритическом или субкритическом состоянии. Неподвижная

фаза, содержащаяся в колонке, состоит либо из тонко измельчённых твёрдых

частиц, таких как силикагель или пористый графит; химически модифицированная

неподвижная фаза, такая же, как и в жидкостной хроматографии, или, в случае

капиллярных колонок, плёнка жидкости, равномерно нанесённая на стенки колонки.

СФХ основана на механизмах адсорбции или распределения.

АППАРАТУРА

Прибор обычно состоит из охлаждённой насосной системы, инжектора,

хроматографической колонки, находящейся в термостатируемой печи, детектора,

регулятора давления и регистрирующего устройства (интегратор или самописец).

Насосная система.

Насосная система необходима для поддержания постоянной скорости

подвижной фазы. Колебания давления должны быть сведены к минимуму,

например, путём пропускания сжимаемой жидкости через устройство, подавляющее

пульсацию. Насосно-компрессорная система и соединительные линии устойчивы к

давлениям, создаваемым насосом.

Точная доставка подвижной фазы при постоянных либо изменяющихся по

определённой программе условиях осуществляется системами, контролируемыми

микропроцессором. В случае градиентного элюирования могут быть использованы

насосные системы, доставляющие растворитель

(растворители) из нескольких

резервуаров, смешивание растворителей может быть проведено как со стороны

насоса (насосов), имеющей низкое давление, так и со стороны, имеющей высокое

давление.

Инжекторы

Ввод пробы может быть осуществлён непосредственно в колонку с помощью

клапана.

Неподвижные фазы

Неподвижные фазы находятся в колонках, которые были описаны в главах,

посвящённых Жидкостной хроматографии (2.2.29) (набивные колонки) и Газовой

хроматографии

(2.2.28)

(капиллярные колонки). Максимальный внутренний

диаметр (Ø) капиллярной колонки равен 100 мкм.

Подвижные фазы

Обычно подвижной фазой является диоксид углерода, который может

содержать полярный модификатор, такой как метанол,

2-пропанол или

ацетонитрил. Состав, давление (плотность), температура и скорость используемой

подвижной фазы могут быть как постоянными в течение всего хроматографического

процесса

(изократическое, изотермическое элюирование, элюирование при

постоянной плотности), так и изменяться по определённой программе (градиентное

элюирование модификатора, давления (плотности), температуры или скорости

потока).

Детекторы

Наиболее часто используемыми детекторами являются спектрофотометры,

работающие в ультрафиолетовой и видимой областях

(UV/Vis) и пламенно-

ионизационные детекторы. Кроме того, могут применяться детекторы, работа

которых основана на измерении рассеяния света, ИК-спектрофотометры,

катарометры или другие специальные детекторы.

МЕТОД

Исследуемый раствор (растворы) и раствор (растворы) сравнения готовят

так, как описано в методике. Растворы не должны содержать твёрдых частиц.

Критерии для оценки пригодности системы были описаны в главе

Хроматографические методы разделения (2.2.46). В данной главе были также

приведены уровни,

до которых можно регулировать

параметры

хроматографической системы, для того, чтобы она оставалась пригодной.

2.2.46. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ

Хроматографическими называют многостадийные методы разделения, в

которых компоненты образца распределяются между двумя фазами, одна из

которых является неподвижной, а другая - подвижной. Неподвижная фаза может

быть твёрдым веществом, жидкостью, нанесённой на твёрдый носитель, либо

гелем. Неподвижная фаза помещается в колонку, распределяется в виде тонкого

слоя, плёнки и т.д. Подвижная фаза может быть газом, жидкостью или

сверхкритическим газом

(флюидом). Разделение основано на адсорбции,

распределении, ионном обмене и т.д., либо на различиях в физико-химических

свойствах молекул, таких как размер, масса, объём и т.д.

Данная глава содержит определения и расчёты общих параметров и

применимых ко всем хроматографическим методам требований для пригодности

системы. Принципы разделения, аппаратура и методики приводятся в следующих

общих статьях:

Бумажная хроматография (2.2.26)

Тонкослойная хроматография (2.2.27)

Газовая хроматография (2.2.28)

Жидкостная хроматография (2.2.29)

Эксклюзионная хроматография (2.2.30)

Сверхкритическая флюидная хроматография (2.2.45)

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для расчёта пределов в монографиях использованы следующие

определения.

При использовании некоторого оборудования ряд параметров, например

отношение сигнал/шум, может быть рассчитано с помощью программного

обеспечения, поставляемого производителем. На пользователе лежит

ответственность за соответствие способов расчётов, используемых в

программном обеспечении, требованиям Фармакопеи. В противном случае

должны быть сделаны соответствующие исправления.

Хроматограмма

Хроматограмма представляет собой графическое или иное представление

сигнала детектора на концентрацию веществ в элюате или другой количественной

величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате,

относительно времени, объёма или расстояния. Идеализированные

хроматограммы представлены сочетанием гауссовских пиков и базовой линии

(базовой линии).

ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ

Время удерживания и удерживаемый объём

Измерения удерживания в элюентной хроматографии могут быть

представлены временем удерживания

(t_R), определённом непосредственно по

положению максимума пика на хроматограмме. Из времени удерживания может

быть рассчитан удерживаемый объём (V_R).

t_R

R =

t_R

- время удерживания или расстояние, измеренное по базовой линии от точки

ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего

компоненту,

v - объёмная скорость подвижной фазы.

Концентрационный коэффициент распределения

Концентрационный коэффициент распределения (D_m) (также известный как

коэффициент ёмкости k’ или фактор удерживания k) определяется как:

количество ×вещества ×в ×неподвижной ×фазе

количество ×вещества ×в ×подвижной ×фазе

KC - коэффициент распределения,

VS - объём неподвижной фазы,

VM - объём подвижной фазы.

Значение D_m компонента может быть определено из хроматограммы при

использовании выражения:

R t

t_R- время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии

от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика,

соответствующего компоненту,

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное

по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из

максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

Коэффициент распределения

Характеристика элюирования в эксклюзионной хроматографии может быть

представлена коэффициентом распределения

(K₀), который рассчитывают с

помощью выражения:

-t

t_t

t_R - время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии

от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика,

соответствующего компоненту,

t₀ - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное

по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из

максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту,

t_t

- время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии

от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика,

соответствующего компоненту, который полностью проникает в поры неподвижной

фазы.

Фактор удерживания (подвижности)

Фактор удерживания

(подвижности R_F

), используемый в плоскостной

хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения

пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки

нанесения пробы.

R_F =

b - расстояние, пройденное веществом,

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Пик может быть охарактеризован площадью пика (A) или высотой пика (h) и

шириной пика на половине высоты (w_h) или высотой пика (h) и шириной пика

между точками перегиба

(w_i). Для гауссовских пиков

(Рисунок

2.2.46.-1)

справедливо соотношение:

Рисунок 2.2.46.-1.

Фактор асимметрии

Фактор асимметрии пика

(A_s)

(Рисунок

2.2.46.-2) рассчитывается из

выражения:

0,05

w_0,05- ширина пика на одной двадцатой высоты,

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика и передним

краем пика на одной двадцатой высоты.

Если фактор ассиметрии равен 1,0 - это означает полную (идеальную)

симметрию.

Рисунок 2.2.46.-2.

Эффективность колонки и число теоретических тарелок

Эффективность колонки, в зависимости от метода, может быть рассчитана из

данных, полученных как при изотермическом, изократическом режимах, так и при

режиме постоянной плотности, как число теоретических тарелок (n) из следующего

выражения, в котором величины t_R и w_h должны быть выражены в одинаковых

единицах (время, объём или расстояние).

= 5,54Á

Ëw h

t_R- время удерживания (или объём) или расстояние, измеренное по базовой линии

от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика,

соответствующего компоненту,

w_h - ширина пика на половине высоты.

Число теоретических тарелок зависит от компонента, колонки и времени

удерживания.

ПАРАМЕТРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ

Разрешение

Разрешение (R_s) близких по высоте пиков двух компонентов может быть

рассчитано из выражения:

1,18(t

-t

)

t_R1 и t_R2 - времена удерживания или расстояния, измеренное по базовой линии от

точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних

пиков,

w_h1 и w_h2 - ширина пиков на половине высоты.

Разрешение более 1,5 соответствует разделению пиков до базовой линии.

Выражение, приведенное выше, не может быть использовано в случае, когда

пики сильно различаются по высоте.

В количественной плоскостной хроматографии вместо времён удерживания

используются пройденные расстояния, и разрешение может быть рассчитано с

использованием выражения:

1,18a(R

)

R_F1 и R_F2 - отношения расстояний от точки нанесения пробы до центров пятен и

расстояния, прошедшего фронтом растворителя от точки нанесения пробы (фактор

подвижности),

w_h1 и w_h2- ширина пиков на половине высоты,

a - расстояние, прошедшее фронтом растворителя.

Коэффициент разделения пиков

Коэффициент разделения неполностью разделённых пиков (p/v-параметр)

может быть использован в качестве требования пригодности хроматографической

системы при выполнении испытания на родственные соединения в случае

неполного отделения примеси от анализируемого вещества (аналита) (Рисунок

2.2.46.-3).

p/v

Hp - высота пика примеси относительно экстраполированной базовой линии,

Hv - расстояние между экстраполированной базовой линией и нижней точкой

кривой, разделяющей пики примеси и аналита.

Рисунок 2.2.46.-3.

Относительное удерживание

Относительное удерживание (r) рассчитывается из выражения:

-t

t_R2 - время удерживания интересующего пика,

t_R1

- время удерживания пика сравнения

(обычно пик, соответствующий

исследуемому веществу),

t_M - «мёртвое» время (или объём): время (или объём) или расстояние, измеренное

по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из

максимума пика, соответствующего неудерживаемому компоненту.

В плоскостной хроматографии вместо t_R2 и t_R1 используются факторы подвижности

R_F2 и R_F1.

ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ

(ПРЕЦИЗИОННОСТЬ)

КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Отношение сигнал/шум

Отношение сигнал/шум (S/N) влияет на воспроизводимость (прецизионность)

количественного определения и рассчитывается из уравнения:

- высота пика

(Рисунок

2.2.46.-4), соответствующая рассматриваемому

компоненту, на хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного

раствора сравнения, измеренная от максимума пика до экстраполированной

базовой линии для сигнала, величина которого эквивалентна двадцатикратному

превышению величины ширины пика на половине высоты,

h - размах для фонового шума (уровень шума) на хроматограмме, полученной при

введении или нанесении холостой пробы, величина которого эквивалентна

двадцатикратному превышению щирины пика на половине высоты для пика на

хроматограмме, полученной при использовании рекомендованного раствора

сравнения и, если возможно, расположенного на одном и том же расстоянии от

места возможного обнаружения пика.

Рисунок 2.2.46.-4.

Сходимость (повторяемость)

Сходимость

(повторяемость) отклика выражается в виде рассчитанного

процентного относительного стандартного отклонения (RSD %) последовательных

серий измерений с участием исследуемой пробы или раствора сравнения и

рассчитывается из выражения:

100

RSD

-1

y_i

- индивидуальные значения площади пика, высоты пика или отношения

площадей в методе внутреннего стандарта,

y - среднее индивидуальных значений,

n - число индивидуальных значений.

Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение (RSD_max)

рассчитывается для серии измерений с участием исследуемой пробы или раствора

сравнения для определённых пределов с использованием следующего выражения:

RSD

max =

90%,n -

K - константа (0,349), полученная из выражения

90%,

K =

в котором

соответствует требуемому RSD при 6 измерениях для B=1,0,

B - верхний предел, приведенный в определении в частной статье минус 100

процентов, предполагая, что верхний предел установлен согласно

воспроизводимости методики,

n- число повторных измерений для раствора сравнения (3

£ n £ 6),

t90%,n-1- коэффициент Стьюдента t для

90%-ной доверительной вероятности

(двухсторонняя критическая область) с n - 1 степеней свободы.

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

Тесты на определение пригодности системы являются неотъемлемой частью

методики и используются для того, чтобы удостовериться в адекватном

функционировании хроматографической системы. Для оценки работы колонки

обычно используются следующие параметры: эффективность, концентрационный

коэффициент распределения, разрешение, относительное удерживание и фактор

асимметрии.

На хроматографическое поведение могут влиять такие факторы, как состав,

ионная сила, температура и рН подвижной фазы, скорость потока, длина колонки,

температура, давление, а также характеристики неподвижной фазы: пористость,

размер частиц, удельная площадь поверхности, а в случае обращённой фазы -

степень химической модификации (блокирование концевых групп, число атомов

углерода и т.д.).

Различные компоненты используемого оборудования должны быть

проверены на соответствие их качества и должны обладать точностью измерений

требуемой для проведения испытания или количественного определения.

Должны быть соблюдены следующие требования при отсутствии других

указаний в частной статье.

- Величина фактора асимметрии основного пика должна находиться в пределах от

0,8 до 1,5, если только нет иных указаний в частной статье. Данное требование

распространяется как на тесты, так и на количественные определения, описанные в

частных статьях.

- Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение для повторных

измерений для предписанного раствора сравнения не должно превышать величин,

приведенных в Таблице 2.2.46.-1. Данное требование распространяется только на

количественное определение вещества и не используется в случае проведения

испытания на родственные соединения.

- Предел обнаружения пика (соответствующий отношению сигнал/шум равному 3)

находится ниже допустимого содержания примеси

(порога, ниже которого

присутствие примеси отрицается) в тесте на родственные соединения.

- Предел количественного определения пика

(соответствующий отношению

сигнал/шум равному 10) равен или меньше, чем порог обнаружения примесей

(порог, при котором отрицается присутствие примеси) в тесте на родственные

соединения.

Taблица 2.2.46.-1.

Требования к сходимости (повторяемости)

Число индивидуальных измерений (вводов проб)

B, %

Максимальное допустимое относительное стандартное

отклонение

2,0

0,41

0,59

0,73

0,85

2,5

0,42

0,74

0,92

1,06

3,0

0,62

0,89

1,10

1,27

РЕГУЛИРОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ

В качестве информации ниже приведены интервалы, в пределах которых

могут изменяться различные параметры хроматографических испытаний, без

принципиального изменения методики, для того, чтобы удовлетворять критериям

пригодности системы. Описанные хроматографические условия были

валидированы в процессе подготовки этой статьи. Проверка пригодности системы

включена для того, чтобы гарантировать требуемое разделение для

удовлетворительного проведения теста или количественного определения.

Неподвижные фазы описаны только в общем виде, так как существует огромное

количество их доступных коммерческих разновидностей, отличающихся по

хроматографическому поведению и для того, чтобы достигнуть предписанных

требований пригодности системы, в ряде случаев приходится вносить некоторые

изменения в хроматографические условия. В методиках обращено-фазовой

хроматографии, в особенности, регулирование различных параметров не всегда

приводит к удовлетворительному разделению. В этом случае может возникнуть

необходимость заменить одну колонку другой, обеспечивающей желаемое

хроматографическое поведение, такого же типа (например, октадецилсиликагель),

но от другого производителя.

Регулирование критических параметров для гарантии пригодности системы

чётко указывается в частной статье.

Следует избегать множественных изменений условий, которые могут оказать

совместное влияние на эффективность системы.

Тонкослойная и бумажная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в

смеси минимально, может изменяться в пределах

±30%

(относительное

содержание) или

±2% (абсолютное содержание), в зависимости от того, что

больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено

более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ± 0,2 pH, если только иное не

указано в частной статье, или ± 1,0 pH в случаях исследования нейтральных

веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%.

Наносимый объём: уменьшается на

20% от требуемого объёма при

использовании пластинок с мелким размером частиц (2-10 мкм).

Расстояние перемещения фронта растворителя не должно быть меньше,

чем 50 мм.

Жидкостная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в

смеси минимально, может изменяться в пределах

±30%

(относительное

содержание) или ±2% (абсолютное содержание) в зависимости от компонента,

которого больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть

изменено более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ±0,2 pH, при отсутствии других

указаний в частной статье, или ±1,0 pH в случаях исследования нейтральных

веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%.

Длина волны детектора: изменения не допускаются.

Неподвижная фаза:

- длина колонки: ± 70%,

- внутренний диаметр колонки: ± 25%,

- размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается.

Скорость потока: ± 50%.

Температура: ± 10%, максимум при 60°C.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что

используемое детектирование и сходимость пика

(пиков)

остаются

удовлетворительными.

Градиентное элюирование: конфигурация используемого оборудования

может значительно изменить разрешение, время удерживания или относительные

удерживания, описанные в методике. Это может быть вызвано чрезмерной

величиной объёма, между точкой встречи двух элюентов и входом в колонку.

Газовая хроматография

Неподвижная фаза:

- длина колонки: ±70%,

- внутренний диаметр колонки: ±50%,

- размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается,

- толщина плёнки : от - 50% до + 100%.

Скорость потока: ±50%.

Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что

используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

Сверхкритическая флюидная хроматография

Состав подвижной фазы: для набивных колонок количество растворителя,

содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30%

(относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание), в зависимости от

компонента, которого больше. Для капиллярной колонки изменения не допускаются.

Длина волны детектора: изменения не допускаются.

Неподвижная фаза:

- длина колонки: ±70%,

- внутренний диаметр колонки:

±25% (набивные колонки),

±50% (капиллярные колонки),

- размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается

(набивные колонки).

Скорость потока: ±50%.

Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что

используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Метод внешнего стандарта. Концентрация анализируемого компонента

(компонентов) определяется путём сравнения сигнала (сигналов) (пика (пиков)),

полученного для исследуемого раствора, и сигнала

(сигналов)

(пика(пиков)),

полученного для раствора сравнения.

Метод внутреннего стандарта. В исследуемый раствор и раствор

сравнения вводятся одинаковые количества компонента (внутреннего стандарта),

который разделяется с исследуемым веществом и не взаимодействует с ним.

Концентрация исследуемого вещества определяется путём сравнения отношения

площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и

внутреннему стандарту, для анализируемого раствора и отношения площадей или

высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту,

для раствора сравнения.

Методика нормализации. Процентное содержание одного или большего

числа компонентов исследуемого вещества рассчитывается путём определения

площади пика или пиков, как процентной части общей площади всех пиков,

исключая пики, соответствующие растворителям или любым добавленным

реагентам и тем веществам, содержание которых ниже допустимого предельного

содержания.

Методика градуировки. Определяют связь между измеренным или

рассчитанным сигналом

(y) и количеством

(концентрацией, массой и т.д.)

определяемого вещества (x) и рассчитывают уравнение градуировочной функции.

Аналитические результаты рассчитывают из измеренного или рассчитанного

сигнала с помощью обратной функции.

Для количественных определений основного вещества и компонентов в

частных статьях обычно используются методы внешнего и внутреннего стандартов

или методика градуировки; методика нормализации обычно не применяется. При

проведении испытаний на родственные соединения обычно применяют метод

внешнего стандарта с одним раствором сравнения либо методику нормализации.

Вместе с тем, при использовании как методики нормализации, так и метода

внутреннего стандарта, в случае если для сравнения используются разбавления

исследуемого раствора, сигналы для родственных веществ должны быть близки к

сигналу самого вещества (фактор соответствия от 0,8 до 1,2), в противном

случае в тесте должны быть указаны величины поправочных факторов, обратных

факторам соответствия.

Фактор соответствия представляет собой относительную величину, равную

соответствию равных масс родственных веществ при условиях, описанных в тесте.

Если испытание на родственные соединения предписывает определение

общего содержания примесей либо подразумевает количественное определение

примеси, важно выбрать подходящую величину порога и подходящие условия

сложения площадей пиков. В таких испытаниях допустимый предел, т.е. площади

пиков, которые лежат ниже предела и не принимаются во внимание, обычно равен

0,05%. Таким образом, пороговая величина в случае сложения величин

соответствует, по крайней мере, половине допустимого предела. Сложение

площадей пиков примесей, которые не полностью разделяются с основным пиком,

лучше всего проводить экстраполяцией. Пики, соответствующие растворителям,

используемым для растворения образца, также не принимаются во внимание.

2.2.47. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 8