|
|
|
содержание .. 6 7 8 9 ..
105
Раствор Б: 0,02 М ацетатный буфер (рН 4,8). Для его приготовления 4,61 мл ледя-
ной уксусной кислоты и 16,3 г ацетата натрия смешивают с дистиллированной водой,
доводят объем раствора до 1 л.
Растворы А и Б смешивают в равных объемах, добавляют 15% этилового спирта.
Готовую краску фильтруют через плотный фильтр. Вновь приготовленную краску перед
использованием проверяют.
Краска Романовского-Гимза.
Для приготовления краски смешивают 3 г азура-2 (азур-2состоит из азура-1 и мети-
ленового синего в соотношении 1:1), 0,8 г эозина В (желтого водорастворимого эозина),
251) г глицерина и 250 г метанола. Перед использованием краску спешивают с ней-
тральной или слабокислой дистиллированной водой (с рН 6,7-7) в соотношении 1:10.
Поскольку часто дистиллированная вода имеет рН менее 6, то для разведения
краски лучше использовать буферный раствор, который готовят следующим образом.
Раствор А (рН 8,3):
17,81 г Na 2HPO 2 ⋅ 2Н 2 O в 1 л раствора.
Раствор Б (рН 4,5):
13,64 г КН 2РО 4 в 1 л раствора.
Буфер для разведения краски (рН 6,8); к 1 л дистиллированной воды приливают по
5 мл растворов А и Б.
Раствор канадского или пихтового бальзама.
Готовят насыщенный раствор канадского или пихтового бальзама в ксилоле. Для
этого бальзам заливают небольшим количеством ксилола и выдерживают при комнат-
ной температуре 1-2 нед, периодически встряхивая.
Суспензии эритроцитов
Эритроциты барана получают от одного и того же животного. Перед постановкой
реакции эритроциты отмывают физиологическим раствором, осаждая каждый раз цен-
трифугированием при 400g в течение 10 мин до тех пор, пока надосадочная жидкость
не станет бесцветной (обычно 2-3 раза). Для приготовления 0,05%-ной суспензии 0,02
мл отмытого плотного осадка эритроцитов смешивают с 10 мл раствора Хенкса, после
чего к 2,5 мл полученной суспензии добавляют 7,5 мл раствора Хенкса. Суспензию
хранят при 4-120С не более трех часов, перед использованием взбалтывают.
Свежие отмытые эритроциты хранят в растворе Олсвера при 4-120С не более 2
нед. Имеется способ, позволяющий хранить эритроциты без ухудшения их способности
к розеткообразованию до 12 мес. Для этого отмытые эритроциты смешивают с раство-
ром Олсвера или физиологическим раствором в соотношении 1:1, к 10 мл полученной
смеси добавляют 0,1 мл формалина, перемешивают и хранят при 1- 40С. В этом случае
эритроциты отмывают перед использованием физиологическим раствором 5 раз.
Для получения эритроцитов мыши кровь нелинейной мыши берут в пробирку с ге-
пари-ном. Отмывают и готовят суспензию таким же способом, что и суспензию эритро-
цитов барана. Хранят так же, как эритроциты барана.
Суспензия клеток пекарских дрожжей.
Свежие или люфилизированные пекарские дрожжи разводят в физиологическом
растворе (соотношение объем/объем 1:1) и выдер-живают на кипящей водяной бане 60
мин. После охлаждения половину надосадочной жидкости сливают и добавляют 10%
формалина. Хранят при +4-120 С до 12 мес. Не менее чем за 12 ч до иапользования
формалинизированные дрожжи трижды отмывают забуферен-ным физиологическим
раствором или раствором Хенкса и оставляют в растворе при 4-120С . Перед использо-
ванием дрожжи трижды отмывают (рН надосадочной жидкости после последней отмыв-
ки должен составлять 7,2-7,4, т.е. раствор Хенкса не должен менять свой цвет. В про-
тивном случае отмывку повторяют). Суспензию клеток дрожжей готовят и используют
так же, как суспензию эритроцитов.
106
Пластины, покрытые слоем агара с антисывороткой.
На крышку 96-луночного планшета (размером 9Х12 см), закрепленную по краям
винтами на нагревательной подставке из металла (температура 500С ) в строго гори-
зонтальном положении, наливают 16 мл раствора агара, содержащего моноспецифи-
ческую антисыворотку к имму-
ноглобулинам определенного класса. После осаждения на крышке получается ровный
слой геля.
Используемые металлические подставки с закрепленными на них крышками для
нагревания перед началом работы помещают в термостат с температурой 600С . Выни-
мают по очереди непосредственно перед заливкой агара.
Раствор агара, содержащий моноспецифическую антисыворотку, готовят следую-
щим образом. Вначале готовят раствор, содержащий 1,5% агара, 2% полиэтиленглико-
ля (М.м. 6000)
(в случае приготовления раствора агара для определения lgM полиэтиленгликоль не
добавляют), 0,0001% мертиолата, остальное - физиологический раствор (рН дистилли-
рованной воды, взятой для приготовления физиологического раствора, должен быть не
менее 6.8). Агар и полиэтиленгликоль смешивают с физиологическим раствором и на-
гревают на кипящей водяной бане до полного растворения всех компонентов (обычно в
течение 3-4 ч), после чего добавляют мертиолат. Приготовленный коллоидный раствор
(в застывшем виде - гель) можно хранить в холодильнике до использования. Готовый
раствор агара доводят до температуры 50 0C, после чего к нему приливают моноспе-
цифическую антисыворотку к иммуноглобулинам соответствующего класса в таком ко-
личестве, которое рекомендуется в паспорте используемого комплекта антисывороток.
Полученный раствор немедленно разливают на пластины (ими могут служить пласт-
массовые крышки планшетов).
Крышку со слоем агара, содержащего моноспецифическую антисыворотку, охлаж-
дают
до +40C , после чего плотно закрывают аналогичной пустой крышкой, герметизируют
при помощи изоляционной полиэтиленовой ленты и хранят при +4- +120 C до использо-
вания (в пределах года).
Система "Иммунокап".
При отсутствии коммерческой системы Иммунокап ее можно приготовить самостоя-
тельно (Петров и др., 1987; Лебедев и др., 1988). Приведем вариант системы, отрабо-
танный А.А. Тотоляном (Тохтабаев и др., 1987).
Готовят агарозную среду, содержащую 80 мг агарозы, 50 мг полиэтиленгликоля (М.
м. 6000), 80 мл веронал-мединалового буфера (рН 8.6), 0,0001% мертиолата и около 1
мл (в зависимости от партии) моноспецифической антисыворотки для определения
иммуноглобулинов классов А, М или G. При этом гель для определения lgA подкраши-
вают красным цветом (добавляя 20 мкг сафранина), для определения lgM - синим (до-
бавляя 10 мкг кумасси голубого), гель для определения lgG оставляют бесцветным.
Каждым из трех приготовленных растворов при температуре 50-520C заполняют по од-
ному каналу трехканального капилляра (длиной 3 см), после чего каналы запаивают с
обоих концов. Приготовленные таким способом капил-ляры укладывают во флакон, за-
ливают 10-20 % -ным раствором желатина и хранят при О- +40C до 1 года. Из указанно-
го количества агарозной среды может быть получено 300-350 готовых капилляров.
2.2.2. ТЕХНОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГРАММЫ
2.2.2.1. ВЗЯТИЕ КРОВИ
Кровь для определенна комплекса иммунологических показателей забирают ут-
ром. Кровь берут из 2-4-го пальца любой руки. Подушечку пальца обрабатывают ват-
ным тампоном, смоченным спиртом, затем протирают сухим стерильным ватным там-
поном, после чего прокалывают стерильным скарификатором- копьем однократного
107
применения резким быстрым движением. Первую каплю крови убирают при помощи
стерильного тампона. Затем, нажимая на палец, выдавливают следующую каплю, ко-
торую и используют для анализа. Кровь не должна растекаться на пальце, она должна
быть в виде капли. Кровь для определения содержания лейкоцитов и лейкограммы,
оценки показателей клеточного иммунитета и определения уровней иммуноглобулинов
обычно набирают раздельно (в этом случае на весь комплекс анализов идет 0,07-0,2
мл крови), но можно набирать одновременно на все тесты в пластмассовую гепарини-
зированную пробирку объемом 0,5 см 3 (в этом случае необходимо 0,2 - 0,3 мл крови).
Мазок крови для подсчета формулы делают вначале.
При взятии крови не следует сильно надавливать на палец, поскольку это спо-
собствует выходу вместе с кровью тканевой жидкости. Для облегчения взятия крови ру-
ки, если они холодные, лучше разогреть (например, теплой водой) или встряхнуть кисти
рук в опущенном положении. Качественный прокол пальца на всю длину копья не толь-
ко является менее болезненным, но и облегчает взятие крови.
Поскольку кровь, взятая из пальца, начинает свертываться не сразу, а через 1-2
мин, то в тех случаях, когда взятую кровь обрабатывают сразу (например, смешивают с
раствором уксусной кислоты или с дистиллированной водой при осуществлении гемо-
лиза), соответствующие капилляры и трубочки нет необходимости обрабатывать анти-
коагулянтом.
В капилляр кровь поступает самотеком, за счет капиллярной силы, в трубочку ее
набирают при помощи медицинской пипетки, надетой на противоположный ее конец.
2.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ И
ФОРМУЛЫ КЛЕТОК КРОВИ (ЛЕЙКОГРАММЫ)
Определение содержания лейкоцитов.
В стерильный стеклянный капилляр набирают 0,008 мл (точно до отметки) крови из
пальца (или из пробирки) и быстро переносят в лунку планшета для иммунологических
реакций, куда предварительно залито 0,1 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, пе-
ремешивают. Кровь сбрасывают из капилляра в лунку при помощи пипетки с переход-
ником, с которой соединяется капилляр. Полученная взвесь может храниться до 4 ча-
сов.
Перед просчетом результатов взвесь тщательно перемешивают пипеткой с пласт-
массовым наконечником и заполняют ею камеру Горяева (следить за тем, чтобы в ка-
меру не попали пузырьки воздуха). Подсчитывают с применением объектива ×20 и
окуляра ×7 общее количество лейкоцитов. При указанных условиях одновременно
можно подсчитывать и количества лимфоцитов и моноцитов. При подсчете количества
клеток в 20 больших квадратах камеры Горяева абсолютное содержание клеток в 1 мкл
крови определяют по формулам:
L=K х a1 / 1000,
где L - содержание лейкоцитов в крови (10 9 /л), а 1 - количество лейкоцитов, найденных
в 20 больших квадратах камеры Горяева
Л = K х а2 / 1000,
где Л - содержание лимфоцитов в крови, 10 9 /л, а 2 - количество лимфоцитов, найден-
ных в 20 больших квадратах камеры Горяева,
К - коэффициент пересчета; при указанном режиме подсчета в стандартной камере
Горяева (имеющей площадь 9 мм 2 и глубину 0.1 мм 2 ) К= 169.
При использовании других режимов подсчета (других объемах раствора уксусной
кислоты и крови, другом количестве просчитанных в камере квадратов) формулу пере-
счета можно вывести из следующей общей формулы:
108
Χ=400 х a х в
/ 1000 х б,
где Х - содержание исследуемых клеток в крови, 10 9л; а - количество клеток, най-
денных в определенном числе квадратов; б - количество сосчитанных малых квадратов
(в 1 большом квадрате содержится 16 малых); в - разведение крови.
Определение популяционного состава
клеток крови в мазке (формулы крови).
Для приготовления мазка необходимо использовать чистые тщательно обезжирен-
ные предметные стекла. Поверхностью предметного стекла (ближе к краю) касаются
капли крови, выступившей из пальца (или помещают на него небольшую каплю из про-
бирки), и тотчас же делают мазок при помощи другого стекла, имеющего шлифованный
край, ширина которого должна быть меньше ширины первого стекла. Для этого второе
стекло прикладывают к первому под углом 450 и после соприкосновения с каплей и рас-
текания последней по всей ширине шлифа двигают его в направлении свободного кон-
ца так, чтобы степень нажатия определя-лась только массой этого шлифованного стек-
ла. Полученный мазок сушат на воздухе, затем на нем пишут графитным карандашом
дату обследования и данные пациента. Высушенный мазок фиксируют, выдерживая в
метаноле в течение 5-10 мин.
Мазки окрашивают по методу Романовского-Гимза. Способ состоит в том, что на
мазок наливают краску, приготовленную так, как описано ранее (краску разводят буфе-
ром непосредственно перед окрашиванием). Выдерживают 5 мин, иногда до 20 мин
(время подбирают экспериментально), после чего препарат промывают водой и высу-
шивают на воздухе.
Обычно подсчет клеток проводят при иммерсионном увеличении объектива Х90.
(При определенном навыке и настройке света в микроскопе по Кеплеру можно считать
формулу клеток и при увеличении объектива ×20 и окуляра ×10, что существенно по-
вышает скорость счета без потери качества. В этом случае, конечно, любой мазок с по-
дозрением на присутствие атипичных клеток нужно просматривать при иммерсионном
увеличении объектива ×90.)
Подсчет ведут во всем мазке, передвигая его, пытаясь захватить разные поля, зиг-
загообразно. Следует помнить, что более крупные клетки крови находятся ближе к
краю препарата. Клетки различают по величине, форме ядра и окраске. Определяют
процентное соотношение клеток разных популяций.
В хорошо приготовленном, правильно зафиксированном и окрашенном мазке клет-
ки имеют следующий вид.
Лимфоциты - округлые клетки диаметром 5-15 мкм. Имеют округлое или овальное
хорошо прокрашивающееся (темно-фиолетовое) ядро, окруженное более или менее
узким поясом цитоплазмы, окрашивающейся в ярко-голубой или синий цвет.
Моноциты - крупные клетки округлой (реже неправильной) формы размером 12-20
мкм с хорошо выраженной цитоплазмой, окрашивающейся в серо-голубой или дымча-
тый цвет и имеющей мельчайшую азурофильную зернистость, с большим эксцентриче-
ски располо-женным ядром округлой, бобовидной или неправильной формы, которое
прокрашивается на столь интенсивно, как ядро лимфоцитов (в светло-фиолетовый или
сиреневый цвет).
Нейтрофилы - округлые клетки диаметром 10-15 мкм, имеющие узкое ядро, окра-
шивающееся в фиолетовый цвет, в виде изогнутой палочки или подковы (палочкоядер-
ные нейтрофилы) или в виде 2-5 сегментов (сегментоядерные нейтрофилы). У сегмен-
тоядерных нейтрофилов ядро прокрашивается более интенсивно. Цитоплазма нейтро-
109
филов прокрашивается слабо (обычно она бесцветная либо бледно-розовая, либо
бледно-сиреневая из-за очень мелкой зернистости).
Эозинофилы - округлые клетки диаметром 12-17 мкм. Ядро у них более широкое,
чем у нейтрофилов, состоит обычно из 2-3 сегментов и окрашивается в фиолетовый
цвет. Цитоплазма бесцветна и имеет характерные эозинофильные зерна ярко-
оранжевого или красного цвета.
Базофилы имеют округлую или округло-овальную форму и диаметр 8-12 мкм, яд-
ро неясной структуры, обычно двух- или трехлопастное или округлое, которое окраши-
вается в фиолетово- розовый цвет. Цитоплазма окрашивается в слабо-розовый цвет
(обычно более интенсивный, чем у нейтрофилов), но содержит крупные базофильные
гранулы, окрашивающиеся в темный фиолетовый цвет.
2.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСА ПОКАЗАТЕЛЕЙ
РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ И ФАГОЦИТОЗА
Получение лейкоцитов.
В стерильную пластмассовую трубочку, которая соединена с медицинской пипет-
кой, набирают 0,02-0,04 мл крови из пальца (или из ампулы), быстро переносят ее в
лунку планшета, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, тщательно перемеши-
вают. Через 40 с осмотическое давление среды восстанавливают, приливая в лунку той
же трубочкой 0,2 мл 10-кратного концентрата забуференного физиологического рас-
твора, содержащего 4% желатина, перемешивают. Полученная взвесь клеток может
храниться в лунке до 2 часов.
Клетки осаждают центрифугированием при 80-120g в течение 5 мин. Надосадочную
жидкость полностью сливают из планшета, осторожно, но быстро переворачивая его
вверх дном лунок. К полученному осадку лейкоцитов приливают 0,3 мл раствора Хен-
кса. В результате получают суспензию лейкоцитов, которую используют для постановки
комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза (перед использованием клетки ре-
суспендируют).
Постановка реакций розеткообразования и фагоцитоза.
Реакции ставят в 96-луночных планшетах доя иммунологических реакций одно-
кратного применения, имеющих круглодонные лунки объемом 0,2 мл. Для герметизации
в крышку планшета вкладывают полиэтиленовую пленку-прокладку. В процессе поста-
новки реакции крышку закрепляют на планшете при помощи обхвата из тонкой резины.
Для работы с суспензиями и растворами пользуются капельницами с объемом капель
0,05 и 0,025 мл.
Различают спонтанное розеткообразование и фагоцитоз (т.е. без дополнительной
нагрузки, используют для выявления Т-, В-лимфоцитов, фагоцитарной активности ней-
трофилов) и нагрузочные тесты розеткообразования.
Е-розеткообразование (Т-лимфоциты).
В лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов. Приливают 0,05 мл
0,05%-ной суспензии эритроцитов барана. Центрифугируют при 200g в течение 5 мин,
затем инкубируют при 8-120С 30 мин.
М-р о з е т к о о б р а з о в а н и е (В-л и м ф о ц и т ы).
Тест М-розеткообразования ставят так же,как тест Е-розеткообразования,но вместо
суспензии эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов
мыши.
Фагоцитоз нейтрофилов.
110
Тест фагоцитоза ставят так же, как тест Е-розеткообразования, но вместо суспензии
эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии фиксированных клеток
пекарских дрожжей (вместо дрожжевых клеток можно использовать эритроциты, фик-
сированные альдегидами, частицы латекса или микробы)
Нагрузочные тесты.
Нагрузочный тест Е-розеткообразовання с теофиллином ставят для оценки субпо-
пуляций Т-лимфоцитов, обладающих хелперной (теофиллин-резистентные Т-клетки) и
супрессорной (теофиллин-чувствительные Т-клетки) активностью. Для постановки это-
го теста в лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов, приливают 0,05 мл
0,01 М раствора теофиллина в растворе Хенкса. Инкубируют при 370С в течение 1 часа.
Далее приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана и ставят реакцию
Е-розеткообразования, как описано выше.
Нагрузочные тесты с другими препаратами (например, антигенами, иммуномодуля-
торами) ставят аналогично, но инкубируют обычно при 370С в течение 0,5 часа (можно
ставить нагрузочные тесты с инкубацией клеток при 370С без препаратов в течение
0,5;1,0; 1,5 часа; можно ставить нагрузочные тесты не только Е-розеткообразования, но
также М-розеткообразования и фагоцитоза).
После завершения реакций (т.е. после инкубации осадка при 8 −120С в течение 30
мин) приступают к этапу приготовления препаратов. Для этого в лунки осторожно, так,
чтобы не повредить осадок, добавляют 0,025 мл фиксатора, выдерживают при комнат-
ной температуре
10 мин. Надосадочную жидкость удаляют одновременно из всех лунок планшета ин-
тенсивным стряхиванием. Затем в каждую лунку заливают по 0,05 мл раствора краски.
Далее к планшету прикладывают лист триацетатцеллюлозной пленки, покрытый слоем
дубленого желатина. Сверху накладывают металлическую крышку, к нижней стороне
которой (той, которая прикладывается к пленке) приклеен ровный слой поролона тол-
щиной 0,5 см. Крышку плотно прижимают при помощи зажимов. Осадки клеток тща-
тельно ресуспендируют постукиванием планшета вверх и вниз дном лунок. Затем
планшет центрифугируют вверх дном лунок при 200g в течение 5-10 мин. После этого
планшет переворачивают, жидкость стряхивают обратно в лунки, а пленку осторожно
вынимают и быстро высушивают под вентилятором в токе воздуха (лучше теплого).
Высушенную пленку немедленно промывают водопроводной водой, промокают фильт-
ровальной бумагой и повторно сушат в токе воздуха в распрямленном состоянии.
На высушенную пленку со стороны препаратов наносят раствор канадского или
пихтового бальзама и прижимают к предметному стеклу. Препараты готовы к микроско-
пированию. На одном стандартном предметном стекле помещается 24 препарата.
Оценка результатов.
В готовых препаратах подсчитывают количество розеткообразующих лимфоцитов и
нейтрофилов на 50 соответствующих клеток или количество фагоцитирующих нейтро-
филов на 50 нейтрофилов с применением объективов ×20 или ×40 при обязательной
настройке света в микроскопе по Кеплеру. За розеткообразующую считают клетку, к ко-
торой прикрепилось 3 или большее количество эритроцитов. За фагоцитирующий счи-
тают нейтрофил, захвативший 1 или большее количество частиц. Вычисляют % розет-
кообразующих и фагоцитирующих клеток.
Определение абсолютного содержания клеток в объеме крови проводят по форму-
лам:
Е-РОЛ 10 9/л = Л 10 9/л ⋅Е-РОЛ%
/
100%,
М-РОЛ 10 9 /л = Л 10 9/л ⋅М-РОЛ%
/
100%,
где Е-РОЛ - Е-розеткообразующие лимфоциты, соответственно 10 9/л и %;
М-РОЛ - М-розеткообразующие лимфоциты, 10 9 /л и %, Л - содержание лимфо-
цитов в крови, 10 9 /л.
Абсолютное содержание остальных розеткообразующих и фагоцитирующих клеток
определяют аналогично.
111
Определение количества теофиллин-чувствительных Е- РОЛ осуществляют по
формуле
Етф.ч.- РОЛ = Е- РОЛ − Етф.р.- РОЛ,
где Е- РОЛ - количество Е-розеткообразующих лимфоцитов (спонтанных), %, Етф-р.-
РОЛ - количество теофиллин-резистентных Е- РОЛ, % (субпопуляция, обогащенная
клетками с хелперной активностью), Етф.ч.-РОЛ - количество теофиллин-
чувствительных Е-РОЛ, % (субпо-пуляция, обогащенная клетками с супрессорной ак-
тивностью). Определение содержания нулевых клеток производится по формуле
О-кл., %=100 % − (Е- РОЛ, % + М- РОЛ, %),
где О-кл. - нулевые клетки.
Определение индекса нагрузки производится по формуле
ИH = E- РОЛ, % / Е- РОН, %,
где ИН - индекс нагрузки (индекс напряженности). Вычисляется как для препаратов
спонтанных Е-РОК, так и для препаратов Е- РОК в нагрузочных тестах. Наибольшее
диагностическое и прогностическое значение приобретает ИН в препарате, имеющем
минимальный (среди прочих) уровень Е- РОН.
Полезно вычислять среднее значениеИН в комплексе нагрузочных тестов.
Определение индекса сдвига производится по формуле
ИC = E- РОК с препаратом / Е- РОК без препарата,
где ИС - индекс сдвига, показывающий влияние препара-
та(антигена,иммуномодулятора) на активность клеток в тесте; Е- РОК с препаратом -
количество Е-розеткообразующих клеток в нагрузочном тесте, который заключается в
инкубации клеток в течение определенного времени с препаратом; Е-РОК без препара-
та - количество Е-розеткообразующих клеток того же типа в нагрузочном тесте, который
заключается в инкубации клеток в тех же условиях и в течение того же времени, но без
препарата.
2.2.2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Модифицированный метод радиальной иммунодиффузии.
Определение содержания иммуноглобулинов в предлагаемом комплексе микроме-
тодов осуществляют с использованием либо цельной крови, либо плазмы, которыми
пропитывают полоску хроматографической бумаги размером 2×5 мм. Пропитку полоски
бумаги кровью ведут непосредственно на пальце, после чего ее немедленно помещают
на слой агара с антисывороткой.
Плазму получают следующим образом. В пластмассовую трубочку, предваритель-
но обработанную гепарином и высушенную, забирают из пальца 0,1 мл крови при по-
мощи глазной пипетки, подсоединенной к другому концу трубочки, после чего ее не-
медленно и осторожно вставляют в слой вязкого материала (например, в лунку план-
шета, набитую пластилином). Центрифугируют при 200g в течение 10 мин, в результате
чего кровь расслаивается: внизу находятся эритроциты и лейкоциты, вверху - плазма.
Трубочку в месте разделения слоев разрезают ножницами, и ту часть, где содержится
плазма, ставят в другой планшет с пластилином. Трубочки закрывают сверху кусочком
пластилина и хранят в морозильной камере до проведения анализа. Перед использо-
ванием плазму размораживают, пропитывают ею полоски бумаги и немедленно поме-
щают их на слой агара.
Если кровь забирают в гепаринизированную пробирку объемом 0,5 мл, то ее цен-
трифугируют при 100g 10 мин, плазму отбирают при помощи пласт массовой трубочки
(негепаринизированой), насаженной на пипетку, ставят ее в планшет, набитый пласти-
лином, хранят и используют так же, как описано выше.
112
Определение содержания иммуноглобулинов осуществляют так. Пропитанные кро-
вью или плазмой полоски хроматографической бумаги немедленно накладывают на
слои агара, содержащие антисыворотку к иммуноглобулинам классов А, М и G, плотно
прижимая к поверхности агара пинцетом. На каждый планшет с агаром накладывают
также полоски, пропитанные образцами стандартной сыворотки человека: неразведен-
ной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. После этого слои агара накрывают крышкой и
герметизируют при помощи изоляционной ленты. Инкубируют при комнатной темпера-
туре: для определения содержания lgG в течение 12-24 часов, lgA - 20-30, lgM - 24-60
часов. Увеличение времени инкубации повышает чувствительность реакции, т.е. сни-
жает порог выявления минимального уровня иммуноглобулинов.
По окончании инкубации на пластинах замеряют ширину полос преципитации от
края полоски бумаги при помощи окуляр-микрометра лупы бинокулярной стереоскопи-
ческой (МБС-9 или МБС-10) при косом освещении пластины, всегда используя одно и
то же выбранное увеличение лупы. Повысить визуальную четкость края преципитата
можно путем заливки пластин агара с преципитатами 10%-ным раствором уксусной ки-
слоты.
Содержание иммуноглобулинов в исследуемых образцах определяют по калибро-
вочной кривой, которую строят на полулогарифмической бумаге. Для этого по оси абс-
цисс откладывают размеры преципитатов стандартной сыворотки человека в различ-
ных разведениях, по оси ординат - известное количество иммуноглобулинов в граммах,
содержащееся в 1 л стандартной сыворотки. Полученные точки соединяют. Таким спо-
собом строят калибровочные кривые для каждого класса иммуноглобулинов.
Для определения содержания иммуноглобулинов в исследуемом образце на оси
абсцисс откладывают ширину преципитата, восстанавливают перпендикуляр до пере-
сечения с калибровочной кривой, точку пересечения проецируют на ось ординат и счи-
тывают содержание иммуноглобулинов.
Метод иммунодиффузии с использованием системы "Иммунокап"
Для определения содержания иммуноглобулинов этим способом обычно использу-
ют плазму (или сыворотку) крови, разбавленную в 10-50 раз физиологическим раство-
ром. Плазму вначале выделяют из крови, а потом уже разбавляют, поскольку разбав-
ление крови физиологическим раствором смещает равновесие белков, что приводит к
десорбции с поверхности клеток иммуноглобулинов и, следовательно, созданию до-
полнительных нестандартных условий.
Перед проведением анализа флакон с капиллярами, залитыми желатином, извле-
кают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 часов
или при 37-400С 10-15 мин. После разжижения желатина капилляр достают из флакона
пинцетом, отмывают под струей теплой водопроводной воды, высушивают фильтро-
вальной бумагой и погружают в пластмассовую пробирку объемом 0,5 см3 , заполнен-
ную смесью плазмы и физиологического раствора. Пробирку закрывают крышкой и ин-
кубируют в горизонтальном положении при 370C в течение 48 часов.. После окончания
инкубации капилляры вынимают, протирают сухой марлей и измеряют длину столбика
преципитации при помощи шкалы окуляр-микрометра бинокулярной стереоскопической
лупы. С помощью калибровочных кривых определяют содержание иммуноглобулинов
соответствующего класса.
При наличии коммерческих наборов системы Иммунокап данный способ явится для
практики более удобным в связи с простотой и экономией времени и материалов, а
также из-за возможности анализа не только одновременно десятков проб (как на пла-
стине), но и единичных проб фактически сразу же при их получении.
2.2.3. ВОЗМОЖНЫЕ ДЕФЕКТЫ ПОСТАНОВКИ КОМПЛЕКСА МЕТОДОВ
РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ И ФАГОЦИТОЗА И ПУТИ ИХ УСТРАНЕНИЯ
Поскольку клеточные иммунологические методы основаны на взаимодействии жи-
вых клеток с разнообразными идикаторными частицами, они крайне чувствительны к
изменению условий проведения реакции. Постановка этих методов требует особенной
113
тщательности, и в процессе обучения могут возникать ошибки, на первый взгляд мало-
заметные, которые могут существенно сказаться на конечном результате. Многие из
этих возможных ошибок неочевидны, и их устранение требует внимательного анализа.
Остановимся на типичных дефектах, которые наиболее часто встречаются при осуще-
ствлении описанной технологии, с указанием основных причин, их обусловливающих.
Безусловно, кроме приведенных, возможны и другие дефекты, но они встречаются
крайне редко и определение их причин потребует консультации опытного специалиста.
Заметим, что указанные здесь причины возможных ошибок представляют собой те са-
мые нюансы методики, своеобразное “ноу хау”,без знания которых трудно ожидать ус-
пешного и быстрого внедрения данной технологии. Мы надеемся, что подробный раз-
бор ряда ошибок, которые могут встретиться при постановке комплекса тестов розетко-
образования и фагоцитоза, поможет читателю глубже разобраться в методической сути
и тонкостях этих методов и легче их освоить.
1) Через некоторое время после лизиса эритроцитов среда, содержащая
клетки и оболочки эритроцитов, желируется в лунках планшета (это может
происходить как до, так и после центрифугирования). В связи с этим клеток
в получаемых препаратах содержится очень мало.
Причины. Образованию в лунках желеобразной массы способствуют: слишком
большое количество (более 0,035-0,04 мл) взятой для гемолиза крови; длительное хра-
нение суспензии клеток в лунках перед центрифугированием, особенно при температу-
ре воздуха выше 200С ; недостаточно хорошее перемешивание крови и раствора, ис-
пользуемого для восстановления осмотического давления
Устранение. Уменьшить количество забираемой крови до 0,02 - 0,03 мл. Уменьшить
время хранения крови перед центрифугированием. Проконтролировать качество пере-
мешивания крови с водой в процессе гемолиза и после добавления 10-кратного физио-
логического раствора.
2) В готовых препаратах большое количество эритроцитов человека
(они обычно крупнее, чем эритроциты барана или мыши).
Причина. Плохо прошел гемолиз эритроцитов.
Устранение. Прежде всего проверить используемую для этой цели дистиллиро-
ванную воду: из нескольких партий воды выбрать лучшую (дистиллированная вода, по-
лученная из водопроводной с большим содержанием ионов хора, даже после повтор-
ной дистилляции не дает хорошего гемолиза; в этом случае хорошие результаты мож-
но получить при деионизации такой воды). Улучшению гемолиза способствуют: интен-
сификация перемешивания крови с водой во время гемолиза; уменьшение количества
крови, взятой для гемолиза, до 0,02 - 0,03 мл. Следует заметить, что при некоторых за-
болеваниях (например, при гемолитической желтухе) часть эритроцитов весьма устой-
чива к изменениям осмотического давления. В этом случае даже повторный их гемолиз
дистиллированной водой, как правило, эффекта не дает. Однако нужно знать, что если
количество оставшихся нелизированными эритроцитов сравнимо с количеством лейко-
цитов (даже превышает их число, но не более чем в 2-3 раза), то это практически не
влияет на результаты розеткообразования и фагоцитоза.
3) В готовых препаратах (всех или части препаратов, полученных
на одной пленке) настолько мало клеток всех типов (лейкоцитов,
эритроцитов, дрожжей), что счет практически невозможен.
Причины. Во-первых, неплотное прижатие прокладки крышкой (либо из-за слабых
зажимов, либо из-за потери эластичности прокладкой из поролона), в связи с чем в
процессе центрифугирования суспензия клеток вытекает из лунок. Во-вторых, плохое
ресуспендирование осадка в краске, в связи с чем клетки остаются в осадке на дне
лунки и не попадают на пленку
114
Устранение. О наличии первой причины свидетельствует отсутствие краски в лун-
ках после центрифугирования, а также капли краски на кожухе центрифуги. Для устра-
нения причины необходимо проверить плотность прилегания крышки с прокладкой к
планшету, при наличии зазоров следует уплотнить зажимы. Кроме того, если исполь-
зуемая прокладка недостаточно эластичная и ровная, следует заменить ее новой.
Если вытекания краски с клетками при центрифугировании не отмечено, то наибо-
лее вероятная причина дефекта состоит в слабом ресуспендировании осадков с крас-
кой. В этом случае при внимательном просмотре препаратов иногда можно увидеть от-
дельные конгломераты клеток. Для устранения дефекта необходимо резко усилить ин-
тенсивность ресуспендирования. Правильное интенсивное ресуспендирование осадка
приводит к полной гомогенности распределения клеток на препарате. Следует иметь в
виду, что даже при максимальной силе взбалтывания интенсивность перемешивания
клеток с краской из-за малого объема лунок значительно меньше той, которая может
травмировать или разрушать образованные розетки.
4) В готовых препаратах попадаются клетки из соседних препаратов
(например, в препаратах с эритроцитами имеются дрожжевые
клетки и наоборот).
Причины. Этот дефект может отмечаться из-за недостаточно плотного прижатия
прокладки крышкой или из-за стекания жидкости в процессе извлечения пленки с пре-
паратами.
Устранение. Первую причину устраняют так же, как предыдущую. Для устранения
второй причины планшет с краской после центрифугирования переворачивают пленкой
вверх и для того чтобы краска лучше стекала обратно в лунки, постукивают им по по-
верхности стола несколько раз. Извлекают пленку очень осторожно, тут же перевора-
чивают ее и сушат в горизонтальном положении.
5) Клетки располагаются в препарате неравномерно,
имеются конгломераты.
Причина. Плохо ресуспендирован осадок. Как указывалось выше, ресуспендиро-
вание осадка должно быть интенсивным. Однако ресуспендирование резко затруднит-
ся, если среди выделенных лейкоцитов будет часть погибших и разрушенных клеток (из
них выбрасываются ДНК и РНК, которые способствуют склеиванию живых клеток в
конгломераты) или если из-за
плохого гемолиза среди них будет велико содержание эритроцитов человека.
Устранение. Повысить интенсивность ресуспендирования осадка. Проконтролиро-
вать точность соблюдения всех режимов постановки реакции (на предмет возможного
превышения времени хранения лейкоцитарной взвеси после ее получения, качества
гемолиза, скорости и времени центрифугирования в процессе постановки реакции, рН
используемого раствора Хенкса, времени фиксации). Краску необходимо заливать в
лунки немедленно после стряхивания фиксатора во избежание высыхания осадка.
6) В препаратах достаточное количество лейкоцитов, но почти
нет эритроцитов, низкое содержание розеток.
Причины. Во-первых, низкая концентрация эритроцитов в рабочем растворе сус-
пензии эритроцитов. Во-вторых, недостаточное (или отсутствие) перемешивание сус-
пензии эритроцитов непосредственно перед раскапыванием их в лунки планшета. В-
третьих, окрашивание недофиксированных клеток, приводящее к лизису эритроцитов.
Устранение. Если в препаратах снижено количество эритроцитов только одного
вида (барана или мыши), то третья причина ошибки маловероятна: целесообразно ос-
тановиться на анализе первых двух причин. Для выявления конкретной причины нужно
после тщательного перемешивания используемой суспензии эритроцитов подсчитать
содержание этих клеток в камере Горяева. Если содержание эритроцитов окажется ни-
же 7 х107/мл (обычно в нормальной суспензии их содержание колеблется в пределах
115
7−17·10 7/ мл), то следует проанализировать первую причину. Низкая концентрация
эритроцитов в суспензии может быть из-за недостаточной плотности базисного осадка
эритроцитов (в связи с уменьшением времени центрифугирования или снижением цен-
тробежного ускорения, в частности, из-за снижения напряжения в электросети); из-за
технической ошибки при разведении базисного осадка; из-за частичного лизиса эрит-
роцитов при их разведении в недостаточно чистой посуде, а также использования ги-
пертонических или гипотонических солевых растворов для разведения; из-за неполного
отмывания эритроцитов от лизированных клеток (это обычно бывает в том случае, если
отмывка эритроцитов проводится в малом объеме физиологи-ческого раствора, взвесь
центрифугируют с большим центробежным ускорением - более 400g и длительно - бо-
лее 10 мин). Для устранения этой причины необходимо приготовить новую суспензию
эритроцитов с учетом перечисленных замечаний.
Если же в рабочей суспензии содержание эритроцитов достаточно, то следует по-
вторить постановку реакции с той же суспензией, но после тщательного ее перемеши-
вания (поскольку эритроциты, обладающие большой удельной массой, быстро оседают
на дно пробирки). Получение качественных препаратов будет указывать на то, что де-
фект был обусловлен второй причиной.
Если дефект не устранился, то нужно внимательно пересмотреть дефектный пре-
парат. Отсутствие в нем целых эритроцитов, наличие мембран эритроцитов вокруг час-
ти лейкоцитов утвердят оставшееся предположение о том, что причина дефекта состо-
ит в применении испорченного фиксатора или в несоблюдении времени фиксации.
(Следует помнить, что глутаровый альдегид, который входит в основу фиксатора, - ве-
щество крайне неустойчивое и быстро разрушается, особенно на свету. По этой причи-
не срок хранения готового фиксатора не должен превышать 1 мес. Не рекомендуется
использовать для приготовления фиксатора старый глутаровый альдегид). Для устра-
нения дефекта следует приготовить свежий фиксатор из реактивов, использованных
ранее. Если это не поможет устранению дефекта, нужно приготовить новый фиксатор с
использованием свежих реактивов (глутарового альдегида, формалина, буферного
раствора).
7) В препарате мало лейкоцитов, в то время как количество
эритроцитов и дрожжевых клеток нормальное.
Причина. Потери клеток в процессе гемолиза или хранения лизированной крови в
физиологическом растворе.
Устранение. Для предупреждения потерь клеток в процессе гемолиза необходимо
точно
соблюдать все режимы операции: время гемолиза и соотношение дистиллированной
воды и
10-кратного концентрата физиологического раствора, добавляемого для восстановле-
ния осмотического давления (это соотношение должно составлять точно 9:1, т.е. на
восстановление осмотического давления среды после добавления 1,8 мл дистиллиро-
ванной воды необходимо брать точно 0,2 мл 10-кратного концетрата физиологического
раствора, быстро перемешивать). В результате гемолиза должны оставаться все лей-
коциты, присутствующие в данной капле крови (это проверяется по их соотношению,
которое должно быть таким же, как в крови). Следует помнить, что, повреждение лей-
коцитов вредно еще и потому, что разрушенные клетки высвобождают ДНК и РНК, ко-
торые способствуют слипанию других, неповрежденных клеток в конгломераты и, как
следствие этого, их потере.
Для сохранности клеток в процессе гемолиза, и особенно при хранении, важнейшее
значение имеет рН дистиллированной воды. Оптимальным для жизнедеятельности
клеток является рН 7,2-7,4. Однако часто дистиллированная (так же как и бидистилли-
рованная) вода имеет рН 5,5 и даже ниже. В этом случае с целью создания для клеток
оптимальной среды по окончании гемолиза используют забуференный 10-кратный фи-
зиологический раствор. Для гемолиза лучше использовать дистиллированную воду с
рН, во всяком случае, не ниже 6 (с этой целью перед перегонкой в дистилляторе в воду
добавляют раствор бикарбоната натрия - несколько капель 1%-ного раствора на 1 л
воды).
116
8) На всем препарате плотно лежат слабоокрашенные тени
оболочек клеток, при этом клеток очень мало, они плохо
контурированы.
Причина. Оседание оболочек эритроцитов, образовавшихся в результате гемоли-
за, на дно лунки вместе с клетками и последующий перенос их в лунки постановочных
планшетов. При изготовлении препаратов оболочки забивают поле пленки, препятствуя
осаждению клеток.
Устранение. Обратить внимание на этапы гемолиза и осаждения клеток. Прежде
всего необходимо проконтролировать скорость вращения центрифуги - следить за тем,
чтобы центробежное ускорение не превышало 120g (или даже уменьшить его до 80g)
при времени центрифугирования 5 мин. Из-за колебаний напряжения в электросети при
одном и том же положении ручки регулятора число оборотов ротора центрифуги может
существенно изменяться (эти изменения могут составлять до 50% от номинала). При
сильных колебаниях напряжения в сети к центрифуге необходимо поставить стабили-
затор напряжения или наблюдать по шкале число оборотов до выхода центрифуги в
режим с их последующей корректировкой. Если скорость центрифугирования нормали-
зована, а дефект сохраняется, необходимо проконтролировать тщательность переме-
шивания раствора лизированной крови с 10-кратным физиологическим раствором. Со-
держание желатина в 10-кратном физиологическом растворе должно составлять не
менее 4 %. Необходимо следить за полнотой сливания надосадочной жидкости, содер-
жащей оболочки эритроцитов.
9) Клетки на препарате видны плохо на фоне слабоокрашенных
теней. При большом увеличении видно достаточное количество
клеток и розеток.
Причина. Неровная поверхность слоя дубленого желатина на пленке, в связи с чем
клетки находятся на разной глубине препарата, а неровности отбрасывают тени.
Устранение. Заменить пленку на новую, с ровной поверхностью желатина.
10) Все поле препарата забито сильно окрашенными частицами.
Клетки видны плохо, их мало.
Причины. Загрязнение большим количеством корпускулярных частиц либо реакци-
онной среды, либо пленки. Эти примеси препятствуют прилипанию клеток к поверхно-
сти пленки, а если часть клеток все же осела, то затрудняют их различие.
Устранение. Для постановки реакции необходимо использовать чистые, отфильт-
рованные растворы. Особенно это касается раствора краски: вновь приготовленную
краску нужно тща-
тельно отфильтровать, иногда дважды, контролируя отсутствие в ней нерастворивших-
ся час
тиц под микроскопом. Новую партию пленки со слоем желатина перед использованием
также необходимо проверить. Пленка хорошего качества на вид должна быть абсолют-
но прозрачной: замутненность ее свидетельствует о наличии механических примесей.
Если пленка замутнена несильно, необходимо проверить в ней количество загрязняю-
щих ее частиц под микроскопом и, если оно слишком велико (более трех в поле зрения
при увеличении 40×7), заменить ее другой пленкой.
11) Окраска клеток в препаратах слабая, нечеткая.
Причина. Плохое окрашивание препаратов.
Устранение. Качество окрашивания препарата зависит от: 1) качества фиксатора;
2) качества краски и времени окрашивания; 3) отмывки окрашенного высушенного пре-
парата водой. Одним из первых признаков непригодности фиксатора является ослабе-
117
вание окрашивания клеток (конечно, при хорошей краске). Поэтому, не дожидаясь сле-
дующих признаков непригодности фиксатора (например, лизиса эритроцитов), необхо-
димо приготовить новый фиксатор. Если фиксатор работает хорошо, то необходимо
проверить краску. Если краска недостаточно сильная, то ее необязательно выбрасы-
вать: улучшить окрашивание можно за счет увеличения времени выдерживания клеток
с краской до 10-25 мин. При низкой эффективности этой меры лучше приготовить но-
вую краску. Наконец, эффект плохого окрашивания может наблюдаться в тех случаях,
когда упускают этап промывания проточной водой пленки с препаратами после пер-
вичного высушивания (или же промывают слишком долго, более 5 с, и не промокают
после промывки).
12) В препаратах достаточно лейкоцитов и дрожжевых клеток,
но фагоцитоз практически отсутствует.
Причины. Во-первых, плохое качество частиц, взятых для фагоцитоза. Во- вторых,
токсичность среды, в которой находятся клетки, или изменение условий их выделения и
хранения, что приводит к резкому угнетению физиологической активности нейтрофилов
вплоть до их гибели.
Устранение. Если в цельной крови фагоцитоз идет хорошо (проверочный тест), то
нужно проанализировать вторую причину. Нейтрофилы - клетки, пожалуй, наиболее
чувствительные к различным воздействиям. Поэтому необходимо проверить условия
выделения клеток (время гемолиза не должно превышать 45 с), токсичность среды, ис-
пользуемой для их выделения и проведения реакции (изменение рН, использование
некачественного раствора Хенкса и других реактивов), время хранения лизированной
крови в лунках, особенно при несоответствии рН значению 7,2-7,4, чистоту используе-
мой посуды. Устранение дефектов по перечисленным пунктам позволит устранить вто-
рую причину отсутствия фагоцитоза.
Если фагоцитоз не идет в цельной крови, то причина дефекта скорее всего в пло-
хом качестве (например, токсичности) частиц, используемых для фагоцитоза. В про-
цессе их хранения в суспензии могут накапливаться токсические для нейтрофилов про-
дукты, резко изменяться рН (например, рН хранящихся дрожжей составляет 2-3). По-
этому частицы перед использованием необходимо тщательно отмыть (не менее трех
раз) и проверить рН жидкости после последней промывки. Если это не устраняет де-
фект, следует приготовить новую партию частиц для фагоцитоза.
13) В препаратах встречаются микробы, которые частично
поглощены нейтрофилами.
Причина. Использование реактивов, контаминированных микроорганизмами (с ак-
тивным размножением последних).
Устранение. Проверить используемые реактивы, в которых могут развиваться мик-
робы: раствор гепарина (если кровь берется в пластмассовые пробирки); 10-кратный
концентрат фи-
зиологического раствора, содержащий желатин (в нем микробы размножаются наибо-
лее часто); забуференный физиологический раствор; раствор Хенкса, используемый
для реакции; растворы лекарственных препаратов и антигенов; суспензии хранящихся
(без добавления формалина) эритроцитов. При обнаружении в реактиве микробов (об
этом свидетельствуют изменение рН, помутнение, появление неприятного запаха) ре-
актив заменяют свежим.
2.2.4. ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИММУНОГРАММЫ
Организация труда по определению иммунограммы может различаться в зависи-
мости от реальных условий проведения анализа.
118
В тех случаях, когда забирают кровь непосредственно в лаборатории или месте,
находящемся в пределах 1 часа. транспортировки, т.е. в условиях лабораторий поли-
клиник, клиник, медсанчастей, медпунктов предприятий, передвижных лабораторий,
кровь из пальца на все виды анализа целесообразно забирать раздельно, что, во-
первых, сокращает необходимое количество крови, во-вторых, снижает затраты труда.
В этом случае применяется схема 1 организации труда.
Схема I
А. Взятие крови у пациента и ее начальная обработка:
а) приготовление мазка для подсчета формулы крови;
б) взятие крови на определение содержания лейкоцитов и перемешивание ее с ук-
сусной кислотой в лунках планшета;
в) взятие крови на определение субпопуляций и физиологической активности кле-
ток, проведение гемолиза в лунках планшетов;
г) взятие крови для определения содержания иммуноглобулинов - пропитывание
кровью полосок хроматографической бумаги и накладывание их на слой агара.
Б. Завершение анализа:
а) подсчет общего содержания лейкоцитов в камере Горяева, окрашивание мазков и
подсчет формулы лейкоцитов;
б) постановка комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза, подсчет резуль-
татов;
в) инкубация агаровых пластин и определение содержания иммуноглобулинов по
величине зоны преципитации.
В. Оценка результатов и оформление документации.
В тех случаях, когда на транспортировку крови требуется свыше 1 часа(но не более
4 часа), особенно если количество обследуемых невелико, целесообразно забирать
кровь в гепаринизированную пробирку, откуда затем ее берут на все виды анализа. В
этом случае применяют схему II организации труда.
Схема II
А. Взятие крови у пациента:
а) приготовление мазка для подсчета формулы крови;
б) взятие крови в гепаринизированную пластмассовую пробирку объемом 0,5 см 3
для определения содержания лейкоцитов и постановки иммунологических реакций.
Б. Разделение крови для каждого анализа и ее начальная обработка.
а) перемешивание и взятие в лунку с уксусной кислотой ;
б) центрифугирование, отбор плазмы в трубочки (при необходимости постановка их
на хранение);
в) взятие части осадка клеток из пробирки, проведение гемолиза.
В. Завершение анализа:
а) подсчет общего содержания лейкоцитов в камере Горяева, окрашивание мазков
и просчет формулы лейкоцитов;
б) постановка комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза, подсчет резуль-
татов;
в) постановка реакции преципитации (пропитка полосок хроматографической бумаги
плазмой, накладывание их на агар), инкубация пластин с агаром, определение содер-
жания иммуноглобулинов.
Г. Оценка результатов и оформление документации.
Мы привели две наиболее различающиеся схемы организации работ по проведе-
нию иммунологического обследования в пределах предложенной технологии. Однако в
зависимости от конкретных условий их можно варьировать. Например, если в условиях
119
лабораторий небольших поликлиник, больниц и т.д. поток больных невелик (менее 20
чел. в день) и если результаты не требуются достаточно быстро, то постановку реакции
преципитации для определения содержания иммунологлобулинов можно осуществлять
не сразу при взятии крови, а после накопления определенного количества образцов
плазмы. В этом случае при осуществлении схемы 1 кровь на иммуноглобулины берут
не на полоски бумаги, а в гепаринизированные трубочки. Конечно, в этом случае до-
бавляются операции их центрифугирования и отделения плазмы путем разрезания
трубочки. С другой стороны, при осуществлении схемы II полоски хроматографической
бумаги можно пропитывать непосредственно кровью из пробирки и сразу же наклады-
вать их на агар, не проводя операций по отделению и отбору плазмы.
При хорошо организованной работе и наличии готовых коммерческих комплектов
материалов и реактивов группа, состоящая из 3 сотрудников (1 врача- лаборанта и 2
лаборантов), может определять полную иммунограмму не менее чем у 100 пациентов в
неделю.
Приведем ориентировочные нормативы времени осуществления некоторых опера-
ций постановки иммунограммы для одного лаборанта.
Взятие крови с предварительной обработкой по схеме 1 у 24 пациентов (при обес-
печении непрерывного потока пациентов) - 1 час.
Подсчет содержания лейкоцитов в камере Горяева у 24 пациентов - 1 час.
Постановка комплекcа тестов розеткообразования и фагоцитоза для 48 пациентов
с получением окрашенных препаратов (по 5 тестов на каждого пациента) - 4 часа.
Просчет уровней розеткообразования или фагоцитоза лимфоцитов и нейтрофилов
в 24 препаратах - 1-1,5 часа.
Определение содержания иммуноглобулинов трех классов (с пересчетом по ка-
либровочной кривой) у 24 пациентов - 2 часов.
Заполнение всей документации (в том числе бланков ответов) на 24 пациента (без
составления заключения) - 2 часов.
Один лаборант может в течение 3 рабочих дней сделать 24 комплексные иммуно-
граммы.
3.0. Глава 3
ИММУНОГРАММА ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
Выше мы отмечали, что понятие нормы иммунной системы неоднозначно: нор-
мальным является не только спокойное состояние иммунной системы здорового
человека, но и ее активная работа в период протекания острого воспалительного
процесса. Для каждого из этих состояний - и спокойного, и активного , конечно, будут
свои нормативные значения показателей, которые могут различаться весьма сильно.
Например, значения уровней эозинофилов и Т-лимфоцитов периферической крови в
активном состоянии иммунной системы будут значительно ниже, чем в спокойном, а
уровни лейкоцитов - существенно выше. Впрочем, для каждой стадии нормально теку-
щего воспалительного процесса характерны свои уровни показателей. В целом они со-
ставляют определенную оптимальную (нормальную) динамику показателей, сравнение
содержание .. 6 7 8 9 ..
|
|
|