Иммунология в клинической практике

положительным признаком, указывающим на появление развитой реакции организма против чу-

жеродного.

1.3.4.3. ПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ,

ВЫЗВАННОЕ ВРОЖДЕННЫМ ИЛИ ПРИОБРЕТЕННЫМ ДЕФЕКТОМ

КОМПОНЕНТОВ ИЛИ ЗВЕНЬЕВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Существует группа заболеваний, связанных с истинной поломкой опреде-

ленных компонентов или звеньев самой системы иммунитета. Эти нарушения мо-

гут быть связаны как со злокачественным перерождением иммунокомпетентных клеток

определенных типов (лейкозы и другие лейкопролиферативные заболевания), так и с

нарушением, поломкой в тех или иных звеньях иммунной системы (врожденные - "пер-

вичные" или приобретенные - "вторичные" иммунодефекты). Классификацию лейкозов

можно найти в любом пособии по клинической гематологии (Кассирский, Алексеев,

1948; Руководство по гематологии, 1979; Клиническая гематология, 1985), первичных

иммунодефицитов - в любом издании по клинической иммунологии (Клиническая имму-

нология, 1986; Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний, 1982; Меха-

низмы иммунопатологии, 1983; Петров, 1983; Иммунология, 1987). Классическим при-

мером приобретенного иммунодефицита стало заболевание, широко известное под на-

званием "синдром приобретенного иммунодефицита" (СПИД), при котором от вируса

страдают Т-лимфоциты-хелперы. Во всех этих случаях, несомненно, имеется реаль-

ная патология иммунной системы, которая клинически выражается в резком ос-

лаблении сопротивляемости организма чужеродному в атипичности течения

иммунных реакций.

Все заболевания этой группы в отличие от заболеваний других типов могут быть

четко дифференцированы по резким отклонениям показателей иммунограммы в спо-

койном периоде (фазе ремиссии). Дефект того или иного звена накладывает на имму-

нограмму специфический отпечаток не только в спокойном состоянии организма, но и

при течении активного воспалительного процесса, обусловливая в большой части слу-

чаев атипичность его динамики. Однако, несмотря на эту атипичность, иммунограмма и

в этих случаях дает возможность следить за ходом воспалительной реакции.

1.3.4.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой части монографии мы лишь наметили общие контуры работы иммунной

системы, стараясь обосновать основные закономерности, лежащие в основе ее функ-

ционирования, постоянно проецируя их на сдвиги ИКК, выявляемые в периферической

крови. Однако наши знания сегодняшнего дня могут дать лишь эскиз реально функ-

ционирующей системы организма. Понимание этого поможет врачу правильно вос-

пользоваться знаниями современной иммунологии для осознанного подхода к интер-

претации иммунограммы периферической крови.

В зависимости от многочисленных внешних и внутренних причин целые эта-

пы иммунной реакции в отдельных случаях могут практически не проявляться

или же абсолютно доминировать при наличии нормальной иммунной системы.

Часть эффек-торных и регуляторных функций из-за сугубо морфологических

особенностей органа или ткани может практически не проявляться.

Почти каждая из ИКК имеет, кроме иммунных, ряд параллельных функций, о которых

мы часто забываем, изучая иммунную систему организма. Однако существование этих

функций, по-видимому, накладывает ощутимые искажения на сдвиги в показателях ИКК

периферической крови по сравнению с предсказываемыми теоретически. Исходя из

параллелизма и дублирования функций разными компонентами иммунной системы,

надо иметь в виду, что, например, уменьшение количества Т-супрессоров приведет к

усилению иммунного ответа, только если не увеличится уровень всех других супрессо-

ров (В-, макрофагальных, метаболитических) и при этом не сократится суммарная ак-

тивность всех стимулирующих факторов (Т-, В-, макрофагальных и гуморальных хелпе-

ров). В ином случае эффекта усиления не только может не быть, но даже возможен об-

ратный эффект.

Во всех звеньях реально существующих взаимодействий компонентов иммунной

системы как на уровне регуляции их образования, активации, так и на уровне непо-

средственного проявления эффекторных функций у нас остается еще слишком много

белых пятен для того, чтобы можно было создать реальную рабочую схему количест-

венной работы иммунной системы и на ее основе четко понять сдвиги клеток перифе-

рической крови при патологии и точно прогнозировать развитие дальнейших событий в

организме.

Основная задача этой теоретической главы состояла в том, чтобы дать клиницисту

общие представления о сегодняшних знаниях функционирования отдельных компонен-

тов иммунной системы и об их реальном месте в общей системе, функционирующей

как единое целое.

Самой большой ошибкой клиницистов (как, впрочем, и многих теоретиков- имму-

но-

логов), прочитавших данную главу и ознакомившихся с достижениями в теоретических

исследованиях механизмов регуляции, взаимодействий и функционирования отдель-

ных ИКК, будет решение непосредственно применить их для практической интерпрета-

ции динамики иммунограммы в клинике, забыв, что сегодня эти закономерности полу-

чены в основном в опытах, поставленных в отрыве от целостной реально функциони-

рующей иммунной системы. Ведь теоретические результаты свидетельствуют лишь о

возможных механизмах и в основном очень мало о реальной функциональной значи-

мости этих механизмов в реальных ткани или органе, подвергшихся агрессии чужерод-

ного.

И все же мы надеемся, что теоретические основы прикладной иммунологии, опи-

санные в этой главе, помогут читателю более глубоко осмыслить те закономерности

сдвигов в иммунограмме, которые выявила большая клиническая практика изучения

изменений в иммунограмме при различных патологиях. Возможно, этот теоретический

материал хотя бы частично поможет осознать и те имеющиеся ограничения в трактовке

иммунограммы, которые необходимо знать при работе с анализом крови в клинике.

2.0.

Глава 2

МЕТОДОЛОГИЯ И ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА

Можно с полным основанием утверждать, что становление и развитие важней-

шего направления клинической иммунологии - оценки иммунного статуса человека -

совпало с появлением и разработкой методов анализа клеток крови и продуктов их

функционирования. Это не случайно, поскольку именно кровь является практически

единственным легко доступным для исследования материалом, позволяющим судить о

состоянии иммунной системы всего организма (секреты и смывы со слизистых поверх-

ностей служат основным материалом для оценки местной иммунной системы). Хотя

кровь не является ареной непосредственного проявления главных - эффекторных

функций иммунокомпетентных клеток (ИКК), она служит основным руслом их транспор-

та к местам выполнения этих функций. Поэтому анализ клеток крови и их продуктов по-

зволяет судить о состоянии иммунной системы организма

Разработка методов анализа клеток крови проходила в два этапа.

Первый этап начался в конце прошлого века с разработки теорий кроветворения

и ретикуло-эндотелиальной системы П. Эрлихом, А.А. Максимовым и др. и завершился

работами В. Шиллинга, в которых отобраны простые надежные методы определения

основных клеточных показателей крови и даны основы их клинической интерпретации.

Огромное практическое значение этого этапа не вызывает сомнений: лейкограмма яв-

ляется важнейшим помощником врача и повседневно используется в клинике.

Второй этап хотя и зародился во времена И.И. Мечникова, но, по сути, начался с

клональной теории М.-Ф. Бернета в 50-е годы нашего века. Далее, в 60-70-е годы, по-

следовало интенсивное развитие методологии анализа популяций и функциональной

активности лимфоцитов. В эти годы были открыты и развиты основные иммунологиче-

ские методы: иммунофлюоресценции, бласттрансформации, розеткообразования, тор-

можения миграции лейкоцитов и др. Для завершения этого этапа необходимо широкое

внедрение наиболее простых и информативных из данных методов в практику, что в

отличие от методов первого этапа возможно только при высокой степени технологич-

ности и автоматизации с использованием стандартных комплектов реактивов, мате-

риалов и оборудования.

За рубежом для этой цели созданы высокопроизводительные автоматические

приборы, которые вместе с четко отработанной для них технологией и комплектами

специальных реактивов разрабатываются и продаются разными фирмами. Эти автома-

ты и наборы реактивов к ним весьма дорогостоящи. Их использование целесообразно

при большом потоке анализов. Дру-гой возможный путь внедрения иммунологических

методов состоит в разработке на основе их простых модификаций механизированных

технологий, для осуществления которых не требуется дорогостоящих автоматов и ре-

активов и которые при обеспечении возможности приобретения стандартных комплек-

тов реактивов и материалов могут повсеместно использоваться как для единичных, так

и для серийных анализов.

В настоящей главе кратко приводится методология иммунологического анализа

основных, преимущественно клеточных, компонентов периферической крови, которая

должна помочь читателю разобраться во всем многообразии иммунологических мето-

дик и их модификаций. Кроме того, подробно описана технология определения ком-

плекса важнейших иммунологических показателей. Описание ее, с одной стороны, по-

может желающим внедрить данный компекс в своей лаборатории, даже если эта лабо-

ратория принадлежит обычной больнице или поликлинике, с другой - явится примером,

иллюстрирующим фактическую сложность любого, даже самого простого метода, сви-

детельствующим о том, что использование любого иммунологического метода связано

с серьезной кропотливой повседневной работой сотрудников лаборатории.

2.1. ВАЖНЕЙШИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КРОВИ

Методы анализа основных типов(популяций) ядросодержащих клеток крови, со-

ставляющих лейкограмму, и большинство субпопуляций этих клеток принципиально

различаются.

В основе определения лейкоцитов разных типов лежат их морфологические раз-

личия по размеру, форме ядра, наличию в цитоплазме гранул и т.д., в связи с чем для

их идентификации достаточно подобрать условия, позволяющие выявлять указанные

особен-ности более четко (варианты окрашивания, приспособления для распознавания

клеток, такие, как микроскоп, гемоцитометр и др.). В противоположность этому субпо-

пуляции лимфоцитов морфологически обычно различаются слабо или не различаются

вообще, поэтому их можно определить только в иммунологических реакциях, позво-

ляющих оценивать функциональную активность или выявлять поверхностные структу-

ры (рецепторы или антигены), характерные для данной субпопуляции.

Лимфоциты подразделяют на субпопуляции на основании наличия на поверхности клеток

разнообразных маркеров (рецепторов, антигенов) и выполнения клетками определенных функ-

ций (эффекторных, регуля-торных). Долгое время считалось, что наличие на клетке того или ино-

го маркера соответствует выполнению ею определенной функции (например, наличие рецептора

к эритроцитам барана - Е-рецептора - характеризует Т-лимфоциты, в то время как наличие ре-

цептора к эритроцитам мыши и третьему компоненту комплемента СЗ отличает В-лимфоциты;

наличие Fсµ -рецептора и CD 4 антигена отличает Т-хелперы, а Fcγ-рецептора и CD 8 антигена

характеризует Т-лимфоциты, обладающие супрессорной и цитотоксической активностью). На са-

мом деле все обстоит значительно сложнее, и это надо хорошо понимать.

Во-первых, было показано, что определенную функцию осуществляет лишь очень не-

большое количество лимфоцитов с данным маркером (Mingari, Мorettа, 1982): выполнению

клетками данной функции более близко соответствует наличие на них сочетания нескольких мар-

керов (Miedema et al., 1985; Thomas et al., 1982). Более того, функциональная активность кле-

ток в сильной степени зависит от качественного и количественного состава гуморального

и клеточного окружения, составляющего среду, в которой клетки находятся: в зависимости от

этих факторов функция клеток (например, хелперная) может не только исчезать, но даже частич-

но заменяться другой (например, супрессорной)

(Lehner et al., 1985). Поэтому, говоря о функции клеток лишь на основании того или иного поверх-

ностного маркера, нужно понимать, что эта функция является лишь преимущественной, на самом

деле субпопуляция весьма гетерогенна.

Во-вторых, на поверхности каждой клетки находится огромное количество самых разнооб-

разных рецепторов и антигенов (Манько, 1987, 1988; McDonald, 1982; Winchester, Kunkel, 1979),

поэтому разделение популяций по одному маркеру позволяет выявлять лишь субпопуля-

ции, весьма гетерогенные по другим маркерам и выполняемой функции. В то же время раз-

деление клеток на субпопуляции с учетом нескольких маркеров приведет к выявлению фактиче-

ски бесчисленного количества субпопуляций, которые функционально будут частично дублиро-

вать друг друга. Таким образом, учитывая большое разнообразие рецепторов и антигенов на по-

верхности клеток, а также различие их экспрессии на отдельных клетках, можно прийти к выводу

о том, что каждая клетка по своему поверхностному составу индивидуальна, неповторима, а та

или иная функция выполняется за счет коллективного действия клеток, которые могут весьма

сильно различаться по своей поверхностной структуре.

Втретьих, необходимо учитывать различие в физиологической активности клеток одной

и той же субпопуляции, что проявляется в разной авидности и плотности рецепторов и ан-

тигенов на поверхности клеток (Лебедев, Понякина, 1981). По-видимому, какую-либо функцию

выполняют клетки не только с определенным сочетанием поверхностных маркеров, но и с опре-

деленной степенью экспрессии каждого из них, т.е. клетки, находящиеся в определенном физио-

логическом состоянии.

Наконец, ясно, что функции клеток in vivо и in vitro могут существенно различаться

(Mingari, Мorettа, 1982). Поскольку мы определяем функциональную активность клеток, выделен-

ных из крови и очищенных, при помощи специальных тестов (например, продукцию иммуноглобу-

линов В-клетками в смешанной культуре лимфоцитов или под влиянием митогенов, киллерную

активность в цитотоксическом тесте и др.), мы не можем быть полностью уверенными в том, что

в организме функциональная активность этих клеток будет аналогичной. Это подтверждается

данными о том, что функция клеток каждой субпопуляции сильно зависит от присутствия

клеток других субпопуляций (Lehner et al., 1985), их концентрации, наконец, от концентрации

лейкоцитов в крови, из которой клетки были выделены (Johnstone et al., 1982).

Каждый иммунолог или врач другой специальности, четко осознав сказанное выше, не должен

быть разочарован огромной сложностью рецепторного и антигенного поверхностного состава и

вариантов функционирования иммунокомпетентных клеток организма. Напротив, он должен по-

нять, как неограниченны его возможности в поисках того рационального, что не только поможет

оценивать состояние иммунной системы пациента, но и сделать новый шаг к осознанию общих и

частных закономерностей работы системы защиты организма.

2.1.1. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

Определение содержания в крови лейкоцитов и количественная оценка основных

типов клеток (формула крови, или лейкограмма) осуществляются в практической меди-

цине с ЗО-х годов нашего столетия, когда В. Шиллингом были описаны простые методы

определения этих показателей с применением микроскопического исследования. В на-

стоящее время на практике используются несколько способов подсчета количества

лейкоцитов и определения лейкограммы, основанных на одном принципе: распознава-

ние образа клеток за счет различия их внешнего вида (Шиллинг, 1931; Кассирский,

Алексеев, 1948; Кост, Смирнова, 1964; Козловская, Николаев, 1984).

В нашей стране наиболее распространен способ визуального определения клеток

с помощью микроскопа. Суммарное содержание лейкоцитов в объеме крови определя-

ют путем подсчета количества клеток в известном объеме жидкости, представляющей

собою кровь, разбавленную 20-кратным объемом 3%- ного водного раствора уксусной

кислоты, разрушающего эритроциты. Технически подсчет клеток в точном объеме осу-

ществляют при помощи камеры Горяева (Кост, Смирнова, 1964; Козловская, Николаев,

1984).

Лейкограмму определяют в мазке, который говорят из капли крови на предметном

стекле, и после фиксации окрашивают так, чтобы четко различать основные клеточные

структуры (ядро, цитоплазму, гранулы и т.д.), характеризующие клетки отдельных попу-

ляций. Клетки всех основных популяций хорошо различаются после окрашивания сме-

сями азура и эозина.

Широкому распространению визуального метода анализа крови способствовала

его простота и надежность, хотя низкая производительность, связанная с необходимо-

стью микроскопирования, заставляла искать новые методы.

За рубежом в последние 30 лет появились и сейчас широко распространены вы-

сокопроизводительные автоматические приборы для подсчета не только общего коли-

чества лейкоцитов, но и формулы клеток. В основе автоматического подсчета лейкоци-

тарной формулы лежит принцип распознавания образа клетки либо в окрашенном маз-

ке (сравнение морфологических характеристик клеток с образом клеток разных типов,

хранящимся в памяти компьютера), либо в цельной крови (по размеру и цитохимиче-

ским свойствам клеток после их окрашивания). Подобные автоматы обладают высокой

производительностью и точностью. Повышенная точность автоматического подсчета

достигается вследствие возможности оценки результата при просчете не 100-200 кле-

ток, как с использованием светового микроскопа, а нескольких тысяч клеток, что позво-

ляет более точно определять количество тех клеток, содержание которых в крови не-

велико (зозинофилы, базофилы, плазматические клетки).

Следует отметить, что высокая точность анализа в клинике нужна нечасто, в большинстве

случаев врача удовлетворяет обычный анализ на 100-200 клеток (Шиллинг, 1931). Во многих слу-

чаях на практике бывает достаточно определить в крови, помимо общего количества лейкоци-

тов, содержание лишь нескольких основных популяций - лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов.

Клетки всех этих популяций легко дифференцировать и подсчитывать в процессе определения

содержания в крови лейкоцитов, если кровь разбавлять не 3%-ным, а 10%-ным водным раство-

ром уксусной кислоты, который не только лизирует эритроциты, но и способствует набуханию

ядер клеток и за счет этого- четкой видимости формы ядер клеток основных популяций. Хотя

данный способ дает возможность получать лишь ограниченную лейкограмму, он обладает прин-

ципиальной простотой, доступен и требует минимального количества крови.

Поскольку клетки существуют и функционируют в обшей системе крови, лейко-

грамму целесообразно дополнять показателями, оценивающими свойства цельной

крови. Одним из таких показателей является скорость оседания эритроцитов (СОЭ),

отражающая реологи-ческие свойства плазмы (связанные, в частности, с содержанием

в ней белков). Для определения СОЭ кровь перемешивают с антикоагулянтом (обычно

цитратом натрия), помещают в мерный капилляр, выдерживают в течение часа и изме-

ряют столб плазмы над осевшим осадком клеток в миллиметрах (Козловская, Никола-

ев, 1984).

2.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ

ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

В отличие от методов определения лейкограммы, методы оценки субпопуляций

лимфоцитов более сложны, поскольку основаны на проведении иммунологических ре-

акций. Эта сложность обусловливает наличие огромного количества модификаций лю-

бого из этих методов, в связи с чем результаты, получаемые разными исследователя-

ми, зачастую не совпадают, что, в свою очередь, оказывает влияние на их интерпрета-

цию, а следовательно, снижает клиническую эффективность тестов. Поэтому в на-

стоящее время в широкую практику вошли лишь некоторые из иммунологических мето-

дов, а именно те, для которых была отработана несложная, стандартизированная тех-

нология.

Среди немногих иммунологических методов, вошедших в медицинскую практику

зарубежных стран, можно назвать методы определения субпопуляций ИКК с помощью

мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, оп-

ределение содержания иммуноглобулинов - основного продукта В-клеток - методами

лазерной нефелометрии и радиальной иммунодиффузии. Другие тесты используются

более или менее широко лишь в лабораториях научно-исследовательских медицинских

учреждений.

Клеточные реакции определения субпопуляций и функциональной активно-

сти ИКК проводят обычно в суспензиях лейкоцитов или их отдельных популяций,

которые выделяют из цельной крови. Большинство реакций (методы иммунофлюо-

ресценции, розеткообразования, фагоцитоза и др.) можно ставить с использованием

как суспензий очищенных клеточных популяций, так и суспензий неразделенных лейко-

цитов.

Для предотвращения свертывания в кровь при взятии обычно добавляют антикоагулянты:

гепарин (20 ед. на 1 мл крови), цитрат натрия (3,8%-ный раствор) или этилендиаминтетраацетат

натрия (ЭДТА) (5%-ный раствор) (Новикав, Новикова, 1979; Иммунологические методы, 1987).

Все антикоагулянты дозозависимо влияют на реакционную способность клеток (Steel et al., 1974).

Гепарин, пожалуй, оказывает на клетки наименьшее влияние, однако присутствие в нем консер-

ванта угнетает активность клеток. Поэтому для этих целей используют гепарин без консерванта.

Свертывание крови предотвращает также не менее чем 20-кратное разбавление ее сразу же по-

сле взятия, например, физиологическим раствором (Тотолян и др., 1986), а также дефибриниро-

вание при помощи вращения в стеклянной посуде в присутствии стеклянных бус.

В настоящее время разработаны и используются разнообразные способы выделения по-

пуляций и субпопуляций ядросодержащих клеток крови, основанные на их физических свойствах:

1) различиях удельной массы клеток разных популяций (способы выделения лейкоцитов и их по-

пуляций при помощи спонтанной седиментации или в результате центрифугирования с примене-

нием градиентов плотности); 2) различиях устойчивости клеток к изменениям осмотического дав-

ления среды (методы гемолиза эритроцитов дистиллированной водой или растворами различных

веществ); 3) различиях адгеэивной активности клеток (методы адгезии клеток на поверхности

пластмассы, нейлоновой вате и т.д.); 4) различиях поверхностного электростатического заряда

клеток (методы электрофореза); 5) различиях в физиологических свойствах клеток (методы ро-

зеткообразования и фагоцитоза с последующим отделением клеток, вступивших в реакцию, при

помощи градиентов плотности или магнита). Большинство из этих способов имеют важное пре-

паративное значение, т.е. позволяют выделять клетки тех или иных популяций и субпопуляций

для экспериментального исследования. Для аналитических целей, особенно для методик массо-

вого использования, пригодны лишь простые, надежные, наименее трудоемкие методы.

Получение суспензий лейкоцитов. Первая группа способов получения лейкоци-

тов основана на различиях удельной массы эритроцитов (1,097 кг/л) и лейкоцитов

(1,07-1,08 кг/л).

Одним из наиболее простых является метод спонтанной седиментации эритроци-

тов. Он состоит в том, что кровь выдерживают при 20-370 С в течение 0,5-1,5 ч, в ре-

зультате чего она расслаивается: нижний слой содержит преимущественно эритроциты

(с примесью лейкоцитов), верхний представляет собой плазму, обогащенную лейкоци-

тами (однако содержащую большую или меньшую примесь эритроцитов). Плазму отби-

рают, клетки осаждают центрифугированием.

Для улучшения отделения лейкоцитов от эритроцитов к крови можно добавлять вещества,

образующие коллоидные растворы (декстрин, желатин, метилцеллюлозу, фибриноген, гуммиа-

рабик и др.) (Новиков, Новикова, 1979; Линг, 1971). Например, З%-ный раствор желатина в фи-

зиологическом растворе смешивают с кровью в соотношении 1:3, после чего инкубируют при

370С в течение 30-40 мин, собирают надосадочную жидкость, полученные клетки осаждают цен-

трифугированием (Понякина и др., 1983).

Данный способ прост, он позволяет выделять лейкоциты крови с минимальным их повреж-

дением, и, что самое важное, в выделенных с его помощью лимфоцитах соотношение субпопу-

ляций почти такое же, как в цельной крови (Uduра et а1., 1980). Однако популяционный состав

выделенных лейкоцитов зависит от времени расслаивания крови: поскольку удельная масса гра-

нулоцитов больше, они осаждаются после эритроцитов в первую очередь. В связи с этим, учиты-

вая различие в вязкости плазмы разных образцов крови, трудно подобрать индивидуальное вре-

мя расслаивания крови так, чтобы состав лейкоцитов полностью соответствовал их соотношению

в крови. Кроме того, в выделенной суспензии лейкоцитов практически всегда присутствуют эрит-

роциты. Их можно удалять путем гемолиза дистиллированной водой или раствором хлористого

аммония (Иммунологические методы, 1987; Лебедев и др., 1976).

Вторая группа методов основана на удалении эритроцитов из цельной крови пу-

тем их гемолиза гипотоническими растворами (Новиков, Новикова, 1979; Иммунологи-

ческие методы, 1987; Лебедев и др., 1987). Поскольку содержание эритроцитов в цель-

ной крови велико, лизис ведут с использованием большого избытка растворов. Для ге-

молиза обычно берут либо дистиллированную воду, либо раствор хлористого аммония

(обычно 0,83%-ный, возможно, с различными добавками), реже - смесь уксусной и вин-

нокаменной кислот, сапонин, грамицидин, лизолецитин, гемолитические сыворотки,

стрептолизин и др.

Наиболее часто применяют следующие два способа гемолиэа.

Гемолиз дистиллированной водой. К крови добавляют 40-50-кратный объем дистиллиро-

ванной воды, перемешивают 30-40 сек., после чего восстанавливают осмотическое давление,

приливая соответствующее количество 10-кратного концентрата раствора Хенкса или забуфе-

ренного физиологического раствора (Тотолян и др., 1986). Клетки осаждают центрифугировани-

ем.

Гемолиз раствором хлористого аммония. К крови добавляют 8-10-кратный объем 0,83%-

ного раствора хлористого аммония (рН 7,4), перемешивают в течение 2-3 мин. Затем приливают

столько же раствора Хенкса. Клетки осаждают центрифугированием.

Одним из главных недостатков гемолиза является повреждение лейкоцитов, которое в

большей или меньшей степени происходит всегда. При этом гемолиз с использованием дистил-

лированной воды является более мягким, поскольку предполагает: а) менее длительное воздей-

ствие на клетки; б) практически мгно-венное и полное снятие этого воздействия, которое дости-

гается прибавлением 10-кратного концентрата раствора Хенкса. Это подтверждают данные о

жизнеспособности клеток, близкой к 100%, и полной сохранности фагоцитарной активности ней-

трофилов (Лебедев и др., 1987). При использовании раствора хлористого аммония воздействие

вещества на клетки не снимается фактически до их отмывки. По сравнению с лимфоцитами гра-

нулоциты менее устойчивы к воздействию ионов аммония: после гемолиза раствором хлористого

аммония способность нейтрофилов к фагоцитозу резко уменьшается, вплоть до полного исчез-

новения (Иммунологические методы, 1987; Лебедев и др., 1987).

Способ получения лейкоцитов путем гемолиза эритроцитов позволяет получать все лейко-

циты, содержащиеся в крови, практически без потерь, хотя гипотонический шок влияет на со-

стояние клеточной мембраны, в частности, открывает значительное количество Fc-рецепторов

(Saal et al., 1982).

Получение отдельных популяций лейкоцитов. Эти способы основаны на раз-

личиях удельной массы эритроцитов и лейкоцитов разных популяций (Boyum, 1968).

Для выделения моноядерных клеток обычно используют градиенты плотности. Гради-

ент обычно представляет собой водный раствор фиколла с добавкой гипака, изопака,

верографина, диагинола или других веществ. Принцип метода состоит в том, что сус-

пензию клеток помещают сверху градиента и центрифугируют. В результате те клетки,

которые имеют плотность больше, чем градиент, проходят через него и скапливаются

на дне пробирки, в то время как все остальные остаются над градиентом.

Одна из возможных схем такого выделения клеток состоит в следующем. На 3 мл смеси ги-

пак-фиколла (10 частей 34%-ного гипака и 24 части 8-9 %-ного раствора фиколла в дистиллиро-

ванной воде, плотность смеси доводится до 1,077 кг/л) наслаивают 6-12 мл крови, разбавленной

физиологическим раствором в 2-3 раза. Центрифугируют при 400g в течение 30- 40 мин. В ре-

зультате клетки крови разделяются: моноядерные клетки и тромбоциты находятся в интерфаз-

ном слое между плазмой и градиентом,

в то время как гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Интерфазный слой собирают

и пос-ле трехкратной отмывки получают суспензию моноядерных клеток - выход лимфоцитов со-

ставляет 60-75% (Нaугу et аl., 1977). Гранулоциты, осевшие на дно пробирки вместе с эритроци-

тами, выделяют так же, как лейкоциты из цельной крови: седиментацией в присутствии желатина

или декстрана.

В качестве градиента можно использовать также 35%-ный раствор химически чистой сахаро-

зы в воде (Лебедев, Андреева, 1974), 10%-ный раствор сахарозы в реополиглюкине, смеси веро-

графина и сахарозы (Новиков, Новикова, 1979) и т.д. Для выделения достаточного количества

клеток с использованием градиентов требуется не менее 1 мл цельной крови из-за потерь клеток

в процессе манипуляций.

Использование градиентов позволяет разделять сумму лейкоцитов на отдельные популя-

ции: моноядерные клетки и гранулоциты. Однако при постановке иммунологических реакций сле-

дует помнить, что получаемые моноядерные клетки на 8-35% обогащены моноцитами (в основ-

ном малыми), причем степень обогащения зависит не только от содержания моноцитов в крови

(Udupa еt аl., 1980). Поскольку в микро-скопе при малом увеличении (которое обычно используют

для оценки результатов иммунологических реакций) отличить малые моноциты от лимфоцитов

очень трудно, а зачастую невозможно, для корректного анализа субпопуляций лимфоцитов необ-

ходимо удалять моноциты, для чего используют их способность фагоцитировать частицы латекса

или карбонильного железа. Градиентное центрифугиро-вание, особенно при низких температу-

рах, приводит к более или менее выраженному изменению субпопуляционного состава лимфоци-

тов, поскольку часть Т- лимфоцитов может осаждаться на дно пробирки из-за образования ауто-

логичных розеток (Udupa et al., 1980). Кроме того, фиколл приводит к изменению физиологиче-

ской активности клеток, в частности, стимулирует экспрессию М-рецепторов (Eremin, Binns, 1982).

Таким образом, если методы спонтанной седиментации или гемолиза эритроцитов позволяют по-

лучать в общей суспензии лейкоцитов моноядерные клетки в таком же соотношении их популя-

ций и субпопуляций, как в цельной крови, то градиентное центрифугирование изменяет состав

моноядерных клеток за счет селективного обогащения одних и потерь других популяций или суб-

популяций клеток. Итак, использование градиентов создает дополнительные нефизиологические

условия (длительный контакт с градиентом) и приводит к изменениям состава моноядерных кле-

ток, степень которых предсказать невозможно.

Мы перечислили основные способы выделения клеток, применяемые для поста-

новки иммунологических реакций, различающиеся по степени сложности и популяцион-

ному составу получаемых клеток. Какой из этих способов следует предпочесть, зависит

от используемых иммунологических методик и целей исследования. Необходимо, одна-

ко, иметь в виду, что высокоочищенные клетки одной популяции (например, лимфоци-

ты) значительно слабее реагируют на различные воздействия и менее активны в имму-

нологических реакциях, чем те, которые имеют примесь клеток других популяций (Ле-

бедев, Понякина, 1985; Новиков, Новикова, 1979). Это может быть связано с наличием

кооперативного эффекта, влияющего на проявление клетками в реакциях полноценной

активности. Немаловажно и то, что более высокая степень очис-тки требует более

сложных и длительных манипуляций с клетками, что существенно их трав-мирует и

обусловливает частичные потери клеток. Поэтому при разработке аналитических мето-

дов для практической клинической иммунологии следует, по-видимому, предпочесть

наиболее простые, щадящие методы выделения, дающие минимальные потери клеток.

2.1.2.1. ОЦЕНКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ПО РЕЦЕПТОРАМ

И АНТИГЕНАМ НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК

Основой этих методов является обнаружение поверхностных маркеров (антиге-

нов, рецепторов), имеющихся на поверхности клеток определенных субпопуляций. Та-

кие поверхност-ные маркеры обнаруживают при помощи молекул или частиц, имеющих

молекулярные структуры, комплементарные тем, которые находятся на поверхности

клеток, и соединенных с индикаторами, позволяющими установить факт прикрепления

их к клетке. Индикаторами могут служить флюоресцирующие красители, ферменты или

крупные корпускулярные частицы, хорошо видимые в микроскоп при увеличении, дос-

таточном для идентификации клеток крови.

Методы, использующие в качестве индикаторов флюоресцентные красители

(методы мембранной иммунофлюоресценции), основаны на том, что если молекулы

иммуноглобулинов соединить с молекулами флюоресцентных красителей, то их спе-

цифическая активность в плане присоединения к соответствующим антигенам полно-

стью сохранится (Coons et al., 1941). В качестве таких красителей чаще всего исполь-

зуют препараты флюоресцеина (зеленое свечение) и родамина (красное свечение).

Люминесцентно-серологический метод. Этот метод применяют для обнаружения имму-

ноглобу-линов на поверхности лейкоцитов. Поверхностные иммуноглобулины присутствуют в

больших количествах на В-лимфоцитах, что дает возможность выявлять их среди общей популя-

ции лимфоцитов.

Для обнаружения мембранных иммуноглобулинов конъюгаты антител к иммуноглобулинам

крови человека и флюорохрома смешивают с суспензией живых, отмытых от сывороточных бел-

ков клеток крови человека и инкубируют при О- 4° С в течение 20-30 мин. Затем окрашенные та-

ким способом клетки трижды отмывают и просчитывают количество светящихся клеток с исполь-

зованием флюоресцентного микроскопа. Для увеличения информативности можно проводить

двойное окрашивание (окрашивание одной и той же клеточной суспензии двумя разными анти-

сыворотками). Увеличение чувствительности может быть достигнуто при помощи непрямого ок-

рашивания: для этого клетки вначале обрабатывают антисывороткой, затем, после отмывки,

флюоресцирующей антисывороткой, содержащей антитела к иммуноглобулинам первой сыво-

ротки (Лебедев, Ганина, 1969; Лебедев и др., 1976; Методы исследозаний в иммунологии 1981) .

Данный метод сложен и трудоемок, поскольку требует большой подготовительной работы,

связанной с получением и очисткой антисывороток, подбором подходящей партии флюорохрома,

приготовлением конъюгатов и подбором условий, индивидуальных для каждой системы, поэтому

нашел широкое практи-ческое применение лишь после разработки автоматизированной техноло-

гии и налаживания выпуска приборов (проточных цитофлюориметров) и комплектов меченых мо-

ноклональных антител.

Метод лазерной проточной цитофлюориметрии. С начала 80-х годов с разви-

тием техники иммунологического анализа люминесцентно-серологический метод всту-

пил на принципиально новый этап развития. К этому времени были разработаны гиб-

ридомные способы получения моноклональных антител к различным антигенам мем-

бран клеток, характеризующим разнообразные субпопуляции, был автоматизирован

способ учета результатов путем замены флюоресцентного микроскопа автоматическим

лазерным проточным цитофлюориметром, позволяющим идентифицировать клетки с

учетом интенсивности флюоресцентного свечения и размера при прохождении их в по-

токе жидкости.

На поверхности иммунокомпетентных клеток находят самые разнообразные дифференци-

ровочные антигены, которые можно выявлять при помощи соответствующих моноклональных ан-

тител (Манько, 1987, 1988; Bach, Bach, 1981а). В настоящее время моноклональные антитела для

определения субпопуляций иммунокомпетентных клеток человека производят и продают разные

зарубежные фирмы, в частности "Orto Diagnostic Systems Inc." (США) - антитела ОКТ, ОКВ, ОКМ и

др.(OK - Orto Klon) и "Becton Dickinson Monoclonal Center Inc". (США) - антитела Leu.

Антигены CD 3 (CD - кластер дифференцировки), выявляемые с помощью моноклональных

антител ОКТ 3, ОКТ 1, Leu 4, присутствуют на зрелых Т-лимфоцитах, находящихся в перифери-

ческих лимфоидных органах или тимической медулле.

Антигены CD 4, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 4 и Leu 2а, обнаруживают-

ся на Т-лимфоцитах, обладающих хелперной (для продукции иммуноглобулинов) и индукторной

(генерирующие цитотоксичные Т-клетки, отвечающие на растворимые антигены пролиферацией

и продукцией лимфокинов) функцией.

Антигены СD 8, выявляемые моноклональными антителам ОКТ 8 и Leu 3a, находятся наТ-

лимфоцитах, обладающих супрессорной (для продукции иммуноглобулинов) и цитотоксической

активностью, а также предшественниках цитотоксических клеток.

Антигены CD 2, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 11, присутствуют на всех

периферических Т-лимфоцитах. По-видимому, эти антигены являются рецепторами к эритроци-

там барана (В-рецепторами). Моноклональные антитела ОКТ 6 выявляют антигены (CD 1) на не-

зрелых, кортикальных тимоцитах. ОКТ 9 и ОКТ 10 выявляют антигены на претимических клетках,

Т-лимфоцитах, находящихся на ранних стадиях дифференцироаки, и на активированных Т-

лимфоцитах.

Моноклональные антитела ОКВ 1 и Leu 12 обнаруживают антигены на зрелых В-

лимфоцитах. ОКВ 2 выявляют антигены, характеризующие молодые формы В-лимфоцитов и на-

ходящиеся на гранулоцитах, ОКВ 7 выявляют типирующие В-лимфоциты; моноклональные анти-

тела OK la 1 выявляют клетки, экспрессирующие Iа (иммуноассоциированные) антигены, ОКМ 1 и

Leu 7 выявляют антигены, характерные для моноцитов, гранулоцитов, естественных киллеров,

ОКМ 5 обнаруживают антигены на молодых моноядерных клетках.

В настоящее время для изучения клеток используют и сочетания моноклональных антител,

позволяющие более узко характеризовать субпопуляции клеток, несущих одновременно два или

несколько антигенов (Nicholson et al., 1986).

Определение на клетках поверхностных антигенов методом иммунофлюориметрии с ис-

пользо-ванием лазерной цитометрии и моноклоиальных антител может проводиться как в цель-

ной крови, так и в клеточных суспензиях, выделенных из крови (так же как люминесцентно- серо-

логическим методом). В настоящее время в клинической иммунологии достаточно широко ис-

пользуется метод с применением небольших количеств капиллярной крови из пальца. Одна из

модификаций этого метода состоит в следующем. 0,05 мл крови с антикоагулянтом инкубируют с

раствором моноклональных антител, конъюгиро-ванных с флюорохромами при 00С в течение

15-30 мин. Затем эритроциты лизируют, выдерживая с гемолитической жидкостью (0,83%-ный

раствор хлористого аммония с добавкой ЭДТА) при 200С в течение 40-60 с. Результаты учиты-

вают при помощи жидкостного проточного цитофлюориметра, идентифицируя клетки по размеру

(популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) и по интенсивности свечения (определение

субпопуляций по присоединению конъюгатов моноклональных антител с флюорохромом).

Метод лазерной проточной цитофлюориметрии достаточно широко распространен в клини-

ческой иммунологии за рубежом, поскольку там налажен серийный выпуск и продажа комплектов

моноклональных антител и приборов с отработанной технологией анализа, подробно описанной

в инструкции. Однако как моноклональные антитела, так и прибор весьма дорогостоящи; кроме

того, прибор требует постоянного технического контроля специалистами. Поэтому данный способ

экономически оправдывает себя только при обеспечении высокопроизводительной работы (не-

прерывного потока анализов). Это несколько сужает возможности повсеместного применения

данного способа. Конечно, вместо жидкостного цитофлюориметра можно применять флюорес-

центный микроскоп, но в этом случае приходится менять технологию, подбирая условия таким

образом, чтобы свечение окрашенных конъюгатами клеток было хорошо видно; резко увеличива-

ется время анализа, поскольку исключается автоматизация.

Методы, использующие в качестве индикаторов корпускулярные частицы

( метод розеткообразования), используются и развиваются в клинической иммуноло-

гии с начала 70-х годов. Они основаны на феномене прилипания к поверхности клеток

корпускулярных частиц различной природы с образованием розеток (розеткой называ-

ют клетку, к которой прикреплено не менее трех таких индикаторных частиц) (Bach,

1973; Понякина, Лебедев, 1983). Акт прили-пания к поверхности клетки достаточно

крупной частицы происхо-дит за счет неспецифических сил адгезии, однако направля-

ется и обусловливается он взаимодействием комплементарных структур (рецепторов

или антигенов, имеющихся на поверхности клетки и индикаторной частицы).

Методы розеткообразования используют для определения на клетках самого широкого спек-

тра поверхностных маркеров. Розетки с определенными корпускулярными частицами образуют

клетки крови всех популяций: лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, базофилы (Ле-

бедев, Понякина, 1985). Однако в каждой популяции те или иные розетки образуют обычно не все

клетки, а их часть, т.е. клетки отдельных субпопуляций.

Наиболее давно открытыми и самыми простыми являются тесты розеткообразования с

эритроци-тами животных. Тест розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РО) применяют

для выявления Т-лимфоцитов (показано, что Е-рецепторы идентичны антигенам, выявляемым

моноклональными анти-телами ОКТ 11 и присутствуют в больших количествах на Т-клетках).

Кроме этого, Т-лимфоциты способ-ны образовывать розетки с эритроцитами козы, свиньи, лоша-

ди, обезьяны Rhesus, человека, собаки и др. (Stathopoulos еt аl., 1974; Charreire, Bach, 1974; You

et al., 1977).

Тест розеткообразования с эритроцитами мыши (М-РО) используют для обнаружения В-

лимфоцитов (показано, что М-рецепторы в больших количествах присутствуют на наименее зре-

лых В-клетках) (Новиков, Пчельников, 1983; Gupta еt al., 1975). В-лимфоциты могут образовывать

розетки также с эритроцитами обезьяны Масаса spesiosa (Paid et al., 1978). К розеткообраэова-

нию с эритроцитами животных способны не только лимфоциты, но также клетки всех других по-

пуляций крови, тканевые макрофаги, эпителиальные клетки (Кочергин и др., 1977; Петрова, Ва-

сильева, 1983; Понякина и др., 1984), поэтому данные тесты можно использовать и для оценки

субпопуляций всех указанных клеток.

Использование эритроцитов или иных корпускулярных частиц, нагруженных антителами,

компле-ментом, другими белками, существенно расширяет возможности розеткообразования.

Тест розетко-образования с эритроцитами, нагруженными иммуноглобулинами разных классов

(так называемыми ЕА-частицами, т.е. частицами эритроцит-антитело, при изготовлении которых

обычно используют относи-тельно инертные эритроциты, не образующие или образующие в ус-

ловиях теста минимальное количест-во спонтанных розеток с клетками человека, например,

эритроциты быка или человека), используют для обнаружения рецепторов к Fc-фрагментам им-

муноглобулинов соответствующего класса (Bаstеn et al., 1972; Johnsen, Madsen, 1978). Эти ре-

цепторы находят в больших количествах на В-лимфоцитах, в меньших - на нулевых клетках, к

числу которых относятся естественные киллеры, а также Т-лимфоцитах. Т-клетки, несущие ре-

цепторы к Fc-фрагменту lgG (Есγ-рецепторы), проявляют супрессорную и цитотоксическую актив-

ность. Т-лимфоциты с рецепторами к Fc-фрагменту lgM (Fcµ-рецепторы) обладают хелперной ак-

тивностью. Т-клетки, обладающие рецепторами к Fс-фрагменту lgA, входят в субпопуляцию кле-

ток, имеющих хелперную активность и обладающих цитотоксичностью. Fc-рецепторы находят

также на нейтрофилах, моноцитах, эозинофилах, макрофагах (Unkless et al..1981;

McDonald.1982).

Тест розеткообразования с эритроцитами, нагруженными антителами к иммуноглобулинам

человека (метод антиглобулинового РО) (Haegert, Coombs, А., 1976; Bright, cl al., 1977), исполь-

зуют для обнаруже-

ния клеток, несущих на своей поверхности большие количества иммуноглобулинов - В-

лимфоцитов

(т.е. для тех же целей, что и люминесцентно-серологический метод). Разработан метод прямого

и непрямого анти-глобулинового РО, причем последний более чувствителен и позволяет выяв-

лять поверхностные иммуноглобулины на части нулевых клеток.

Тест розеткообразования с инертными эритроцитами или искусственными частицами (на-

пример, латекса, полиакриламидного геля), покрытыми моноклональными антителами, можно

использовать для определения самых разнообразных субпопуляций иммунокомпетентных клеток

(тех же, которые определяют методами иммунофлюоресценции). В отличие от метода лазерной

проточной цитофлюориметрии, этот метод не требует дорогостоящего оборудования или флюо-

ресцентного микроскопа, а предполагает работу со световым микроскопом. Приготовление

инертных частиц с иммобилизованными на них моноклональными антителами, возможно, решит

проблему создания более стандартных индикаторных частиц, нежели эритроциты, к тому же об-

ладающих большей специфичностью и большими возможностями, что весьма важно для практи-

ки.

Метод комплементарного РО используют для обнаружения клеток, несущих на своей по-

верхности рецепторы к компонентам комплемента. С этой целью используют корпускулярные

частицы, нагружен-ные соответствующим компонентом комплемента (ЕАС-частицы: эритроцит-

антитело-комплемент; YC-частицы: пекарские дрожжи-комплемент; ZC-частицы: зимозан-

комплемент; ВАС-частицы: бактерия-антитело-ком-племент (НuЬег, Wigzell, 1975; Shannon,

Hostings, 1977; Gormus et al., 1980; Uchida et al., 1982). Рецепторы к компонентам комплемента,

особенно третьему компоненту (СЗ), находят на В-лимфоцитах, на части нулевых клеток, ней-

трофилах, эозинофилах, моноцитах, макрофагах.

Приведенные выше тесты РО наиболее хорошо разработаны и часто применяются, однако

не исчерпывают всех возможностей этого метода. Метод РО позволяет обнаруживать любые

маркеры, если для этого имеются подходящие корпускулярные частицы. Так, эритроциты, нагру-

женные стафилококковым белком А, используют для обнаружения В-лимфоцитов человека, не-

сущих lgG, lgM и lgD. С помощью метода РО можно обнаруживать на клетках HLA-антигены (ан-

тигены главного комплекса гистосовместимости человека), рецепторы к агглютинину арахиса и

т.д. (Indivery et al., 1979; Romagnani et al., 1980).

Смешанные тесты РО, основанные на одновременном испольэоаании двух видов индика-

торных частиц, дают возможность выявлять одновременно клетки, несущие несколько маркеров.

Для постановки таких тестов обычно берут частицы, различающиеся по внешнему виду (напри-

мер, эритроциты и ZC- или YC-частицы), либо какие-либо частицы метят флюорохромом (Поня-

кина, Лебедев, 1983).

Для постановки реакций розеткообразования используют суспензии клеток крови: либо сус-

пензию очищенных лимфоцитов, либо суспензию лейкоцитов цельной крови. Принцип постановки

всех тестов один. Суспензию исследуемых клеток смешивают с суспензией корпускулярных ин-

дикаторных частиц (эритроцитов, нагруженных эритроцитов или других частиц), клетки осаждают

центрифугированием и инкубируют при 4-200С обычно 30-60 мин. Подсчет количества розетксоб-

разующих клеток осуществляют либо непосредственно в полученной суспензии, либо в окрашен-

ных препаратах, полученных после фиксации, приготовления и окраски мазков, визуально, с ис-

пользованием светового микроскопа.

Способы розеткообразования просты, доступны, они не требуют дорогостоящих реактивов

и сложного оборудования, поэтому широко используются в клинической иммунологии. Число мо-

дификаций метода РО огромно: фактически почти в каждой лаборатории используется своя мо-

дификация метода. Это приводит к различиям получаемых результатов и, следовательно, к

сложностям их трактовки. Некоторые считают, что главным недостатком метода РО является его

нестабильность. Однако этот недостаток может быть устранен теми же способами, что и в отно-

шении других методов (в частности, мембранной имунофлюоресценции), а именно за счет упро-

щения методов, что позволит снизить количество влияющих факторов, создания на основе уп-

рощенной модификации четкой стандартной технологии постановки и создания коммерческих

стандартных наборов реактивов и материалов.

2.1.2.2. ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ТЕСТ (РЕАКЦИЯ ЦИТОЛИЗА)

Установить факт присоединения антител к антигенам клеточной поверхности мож-

но не только при помощи флюоресцентного красителя или корпускулярных частиц, но и

на основании изменения жизнеспособности клеток в цитотоксическом тесте (реакции

лимфо- или лейкоцитолиза), разработанном в 50-е годы (Вегенер, 1979; Gorer,

O’Corman, 1956). Этот тест основан на том, что живые клетки, несущие определенный

поверхностный антиген, после присоединения к нему антител в присутствии компле-

мента теряют жизнеспособность. Оценка количества погибших клеток позволяет опре-

делять число клеток этого типа в исследуемой популяции.

Реакцию обычно осуществляют в микроварианте (Terasaki, McClelland, 1964). В лунки панели

Терасаки для микротитрования вносят суспензию клеток, антисыворотку к лимфоцитарным анти-

генам определенного типа и комплемент. Инкубируют при 370С . Затем окрашивают витальным

красителем (чаще трипановым синим), после чего фиксируют формальдегидом. С использовани-

ем светового микроскопа просчитывают количество клеток, потерявших жизнеспособность (т.е.

окрашенных). В исполнении данный тест весьма прост. Сложность состоит в трудоемкости полу-

чения специфических антисывороток. В настоящее время цитотоксический тест наиболее часто

ставят с антисыворотками к Т-лимфоцитам, В-лимфоцитам, а также нейтрофилам, эозинофилам,

макрофагам (Новиков, Новикова, 1979).

При точно соблюдаемых условиях воспроизводимость цитотоксического теста высока и дос-

тигает 95% (Вегенер, 1979). Результаты оценки субпопуляций лимфоцитов, получаемые с приме-

нением данного теста, близки к тем, которые получают другими методами, например методом

розеткообразования (Ботвиньева, Федорова, 1988).

Наиболее широкое распространение цитотоксический тест получил для типироваиия HLA-

антиге-нов. Именно с помощью этого теста были открыты наиболее часто встречающиеся HLA-

антигены (Иммуно-логические методы, 1979, 1987). С целью типирования цитотоксический текст

осуществляют с исполь-зованием антисыворотки к HLA-антигенам (которые получают от добро-

вольцев, иммунизирован-ных этими антигенами, или от много рожавших женщин) (Зарецкая, Аб-

рамов, 1986). Антигены системы HLA экспрессируются в больших количествах на В-лимфоцитах.

В связи с тем, что В-лимфоцитов в крови относительно немного, для получения адекватных ре-

зультатов типирование клеток проводят обычно в очищенной суспензии В-лимфоцитов.

В-лимфоциты для типирования выделяют в два этапа: вначале получают моноядерные клет-

ки центрифугированием крови на градиенте плотности (п. 1.2), затем выделяют В-лимфоциты,

проводя реакцию

Е-розеткообразовання (для более полного связывания Т-лимфоцитов для реакции используют

эритроциты барана, обработанные нейраминидазой или папаином) и отделяя образовавшие ро-

зетки Т-лимфоциты повторным центрифугированием на градиенте. Полученные клетки исполь-

зуют для типирования, проводя цитотоксический тест с соответствующими антисыворотками так,

как описано выше. Результат типирова-ния оценивают в зависимости от количества погибших

клеток.

Успех HLA-типировання зависит от чистоты суспензии жизнеспособных В-лимфоцитов и от

концентрации клеток, используемой при проведении цитотоксического теста (Зарецкая, Абрамов

1986).

Процесс выделения В-клеток является многостадийным и сложным, и даже небольшие по-

грешности на каждой стадии, суммируясь, существенно увеличивают риск гибели клеток и обед-

нения получаемой суспензии В-лимфоцитов за счет присутствия малых моноцитов, нулевых кле-

ток, гранулоцитов и, следовательно, в конечном итоге приводят к ложноотрицательным резуль-

татам реакции лимфоцитолиза. Ложноотрицательная реакция может быть вызвана также повы-

шенной концентрацией клеток в суспензии, используемой при постановке цитотоксического теста

(и, напротив, слишком низкая концентрация клеток может привести к ложноположительной реак-

ции). Кроме того, этот метод требует большого (15-20 мл) количества венозной крови, что делает

его весьма травматичным для пациента.

Для уменьшения числа стадий метода и, следовательно, снижения вероятности погрешно-

стей разработан метод типирования с использованием двухцветного флюоресцентного окраши-

вания (Van Rood et al., 1977). Этот метод требует (Зарецкая, Абрамов, 1986) 5 мл крови и исклю-

чает этап выделения В-клеток. В соответствии с ним для проведения цитотоксического теста ис-

пользуют суспензию лимфоцитов пери-ферической крови, в которой В-клетки метят, проводя с

ними реакцию иммунофлюоресценции (т.е. присоединяя к ним антитела к иммуноглобулинам че-

ловека, коньюгированные с флюоресцеинизотиоцианатом, ФИТЦ.

Для выявления погибших в результате реакции цитолиза клеток используют флюоресцент-

ный краситель другого цвета - родамин или бромистый этидий. Реакцию учитывают с помощью

инвертированного флюо-ресцентного микроскопа с определенной комбинацией фильтров, по-

зволяющего наблюдать одновременно зеленое свечение ФИТЦ и красное свечение родамина

или бромистого этидия. Этот метод является более чувствительным и быстрым (из-за снижения

количества этапов реакции) и более информативным, поскольку позволяет определять, с клетка-

ми каких субпопуляций вступают в реакцию типирующие аллоантисыворотки. Однако метод тре-

бует высококачественных реактивов и сложного оптического оборудования, а также повышенного

внимания при учете результатов.

2.1.3. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

Основой этой группы методов является изучение физиологически обусловленного

изменения функционального состояния клеток при контактировании их с веществами,

чужеродными клетками или корпускулярными частицами.

2.1.3.1. РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (РБТЛ)

Реакция бласттрансформации основана на феномене активации лимфоцитов под

влиянием стимулов (митогенов или антигенов) с последующей трансформацией их в

бласты (большие делящиеся клетки). Эта реакция определяет пролиферативный по-

тенциал изучаемых клеток.

Реакцию осуществляют следующим образом (Новиков, Новикова, 1979; Jensen, Cristingen,

1981). К суспензии лимфоцитов или лейкоцитов крови (в последнее время чаще используют раз-

веденную в 10-20 раз цельную кровь) приливают раствор митогена или антигена в концентрации,

нетоксичной для клеток, но способной вызывать бласттрансформацию. Инкубируют в среде СО

при 370С . По окончании культивирования эритроциты (в тех случаях, когда для реакции исполь-

зуют цельную кровь) лизируют и подсчитывают количество клеток, трансформировавшихся в

бласты. Подсчет можно вести визуально в окрашенных мазках, однако морфологический метод

учета может давать субъективные ошибки. Поэтому чаще учет результатов ведут по изменению

радиоактивности культуры клеток в результате включения радиоактивного изотопа в клетки, вхо-

дящие в митотический цикл (например, 3H-тимидина), используя для этого автоматический сцин-

тилляционный счетчик.

В качестве активаторов РБТЛ обычно используют фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А

(Кон А), митоген лаконоса (МЛ), бактериальные липополисахариды (ЛПС), ферменты, стафило-

кокковый экстракт и др. ФГА и Кон А стимулируют преимущественно Т-лимфоциты, поэтому до

появления тестов розеткообразовання бласттрансформацию с этими митогенами использовали

для количественной оценки популяции Т-клеток. Липополисахариды (например, Е. coli, сальмо-

нелл и др.), антитела к иммуноглобулинам, очищенный белковый дериват туберкулина, декстра-

ны стимулируют бласттрансформацию преимущественно В-клеток. Митоген лаконоса стимулиру-

ет клетки обоих типов.

Таким образом, подбирая митогены, можно изучать функциональную активность отдельных

субпопуляций лимфоцитов; подбирая оптимальные условия проведения реакции, можно в прин-

ципе давать количественную оценку содержания Т- и В-лимфоцитов в общей популяции. Однако

реально такие условия подобрать весьма сложно, поскольку поведение плеток в многокомпо-

нентной среде может быть неоднозначным. Так, в определенных условиях под действием ФГА

могут трансформироваться в бласты В-клетки: надосадочная жидкость Т-клеточных культур вы-

зывает бласттрансформацию В-лимфоцитов.

Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому исполь-

зовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется. Постановка реакции и культивирование

должны осуществляться в стерильных условиях. Поскольку оптимальные дозы антигенов и мито-

генов и время инкубации для каждого случая индивидуальны, то рекомендуется применять не-

сколько доз стимуляторов (обычно, помимо оптимальной дозы, более низкую н более высокую) и

разное время культивирования (Лебедев и др., 1976; Zieger et al., 1974), а на основании получен-

ных данных строить кривые доза-эффект и время-эффект.

К трансформации лимфоцитов в бласты может приводить также совместное культивирова-

ние клеток двух разных доноров (культивирование в смешанной культуре лимфоцитов, СКЛ). Для

оценки результатов трансформации тестируемых клеток у стимулирующих клеток блокируют син-

тез ДНК (обработкой митомицином С или облучением) (Методы исследований в иммунологии,

1981). Уровень ответа в СКЛ зависит от генетических различий между индивидами, поэтому СКЛ

широко используется для подбора оптимальных пар при трансплантации органов и тканей. Ис-

пользование РБТЛ в клинике для количественной оценки субпопуляций лимфоцитов в настоящее

время в значительной степени утратило свое значение в связи с появлением более простых ме-

тодов (розеткообразования и мембранной иммунофлюоресценции с мечеными моноклональными

антителами). Однако достаточно большим остается значение бласттрансформации для опреле-

ления физиологической активности (пролифера-тивного потенциала) клеток как на неспецифиче-

ские активаторы (митогены), так и на специфические (антигены простейших, грибов, бактерий,

вирусов, тканей организма), хотя и в этом случае велика роль неспецифического воздействия ан-

тигенов. Результаты неспецифической и специфической РБТЛ взаимно дополняют друг друга,

поэтому рекомендуют ставить реакцию с набором тест- антигенов и митогенов. СКЛ имеет важ-

ное значение для трансплантационной иммунологии, подбора донора и реципиента (хотя при

этом не следует забывать, что уровень ответа зависит не только от аллоантигенных различий

лимфоцитов, но и от общей способности к стимуляции тестируемых клеток). Определенную важ-

ность представляет применение СКЛ и стимуляции МЛ для оценки глобулинопродукции стимули-

рованных В-лимфоцитов in vitro.

Метод РБТЛ достаточно распространен в лабораториях клиник медицинских институтов,

причем используется в многочисленных модификациях. Различие результатов, получаемых при

использовании различных модификаций, затрудняет четкую их трактовку в клинике. Широкому

распространению этого метода в практике препятствует необходимость стерильной работы и от-

сутствие стандартизированной технологии.

2.1.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Продукция иммуноглобулинов является одной из наиболее важных функций В-

лимфоци-тов. Это заставляет нас в данной главе, посвященной определению функцио-

нальной актив-ности клеток, остановиться на основных методах определения содержа-

ния иммуноглобулинов.

Принцип определения содержания иммуноглобулинов основан на взаимодействии их с

антителами, полученными против них (т.е. на реакции антиген-антитело, где в роли ан-

тигена выступают определяемые иммуноглобулины).

Методы иммунодиффузии в геле. Метод радиальной иммунодиффузии был предложен

Манчини (Manchini и др., 1964) и получил наиболее широкое из всех методов распространение в

клинике благодаря простоте и надежности. Суть его состоит в следующем. На гладкую поверх-

ность равномерно наносят гель агара или агарозы, содержащий антитела к иммуноглобулинам

определяемого класса. В затвердевшем геле вырезают лунки, которые заполняют исследуемой

биологической жидкостью. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретив-

шись с антителами, образуют кольцо преципитации. Площадь образующегося преципитата прямо

пропорциональна концентрации иммуноглобулинов в исследуемой жидкости. Для завершения

диффузии lgA и lgG требуется обычно 2 сут, lgM - 5-7 сут. Поэтому реакцию преципитации прово-

дят обычно в модификации Fahey (Fahey, 1965), не доводя реакцию до конца и считывая резуль-

таты для lgA и lgG через сутки, lgM - через 2 сут., поскольку было доказано, что в этом случае, так

же как при линейной иммунодиффузии, между диаметром кольца преципитата и логарифмом

концентрации антигена имеется линейная зависимость. Эта модификация менее точна, однако

ее точность, как правило, удовлетворяет запросы клиники. Учет реакции ведут обычно без окра-

шивания преципитатов. Слабые преципитаты становятся лучше различимы после обработки та-

нином или раствором уксусной кислоты. Иногда преципитаты окрашивают красками для белков

(амидочерным, кумасси синим, бромфенолом синим и др.), предварительно удалив все белки, не

принявшие участия в образовании преципитата, промывкой гипертоническим раствором NaCI.

В настоящее время рядом зарубежных фирм производятся коммерческие герметично закры-

тые готовые системы для определения содержания иммуноглобулинов методом радиальной им-

мунодиффузии, что очень важно для широкого практического использования метода, поскольку

применение готовых систем стандартизирует метод и упрощает проведение анализа.

Метод линейной иммунодиффузии состоит в том (Оudin, 1971), что агаровый или агарозный

гель, содержащий антисыворотку, заключают в тонкую трубочку или пробирку. Трубочку верти-

кально погружают в исследуемую биологическую жидкость (или в случае использования пробирки

жидкость наслаивают на столбик геля), инкубируют двое суток. Антигены диффундируют в гель

со скоростью, пропорциональной их концентрации, и в результате взаимодействия с антителами

образуют преципитаты. Концентрацию антигенов в исследуемой жидкости определяют по калиб-

ровочной кривой в соответствии с длиной преципитата.

Хотя этот метод был предложен Уденом в 1946 г., он не нашел широкого применения в связи

с низкой точностью результатов, на которые сильно влияют температура, малейшие отклонения

трубочки от вертикального положения и другие причины. Недавно (Лебедев и др., 1987, Петров и

др., 1987) была разработана новая модификация этого метода, позволившая устранить указан-

ный недостаток. Согласно этой модификации, гель с антисывороткой заключают в капилляры,

которые для проведения реакции погружают в исследуемую биологическую жидкость и инкуби-

руют в горизонтальном положении при 370 С в течение 1-1,5 сут. Для осуществления этой моди-

фикации А.А.Тотоляном и К.А. Лебедевым (1987) разработана стандартная система "Иммуно-

кап", представляющая собой трехканальный капилляр длиной 3 см, каждый канал которого за-

полнен агарозным гелем с антисывороткой соответственно для lgA, lgG и lgM, подкрашенным для

удобства в разные цвета. Капилляры консервируются в герметично закрытых пробирках. Пре-

имущества этой системы в сравнении с коммерческими системами, основанными на ра-

диальной иммунодиффузии, состоят в экономии реактивов и материалов, возможности длитель-

ного хранения без потери свойств (в связи с минимальной поверхностью испарения и снижением

температуры хранения благодаря использованию антифриза) и в простоте использования.

Методы иммунодиффузии довольно чувствительны (видимые преципитаты образуются при

концентрации белка свыше 5 мг/л), их ошибка составляет не более 10%. Основным недостатком

этих методов является длительное время анализа (1-2 сут). Сократить это время до 3-18 ч по-

зволяет использование электрического поля - метод иммуноэлектрофореза в геле, в частности

ракетного иммуноэлектрофореза (Иммунологичеекие методы, 1987; Saurell, 1966).

Суть метода состоит в том, что гель агарозы, содержащий моноспецифическую антисыворот-

ку, равномерно распределяют по гладкой поверхности. Вырезанные лунки заполняют исследуе-

мой жидкостью. В электрическом поле молекулы антигена мигрируют в гель и, взаимодействуя с

антителами, образуют преципитаты, вытянутые в сторону анода. Длина полосы такого преципи-

тата в стандартных условиях пропорциональна концентрации антигена в исследуемой жидкости.

Точность электроиммунного анализа не отличается от точности иммунодиффузии. Однако суще-

ственное увеличение скорости получения результата, достигаемое данным методом, требует

специальной аппаратуры и технических усложнений.

Метод лазерной нефелометрии. Суть этого метода состоит в том, что исследуемую биоло-

гическую жидкость, содержащую антиген, смешивают с моноспецифической антисывороткой. В

результате инкубации образуются иммунные комплексы, способные рассеивать проходящий

свет. Интенсивность рассеивания или поглощения света прямо пропорциональна количеству об-

разовавшихся компексов (Davies, 1971).

Данный метод обладает высокой точностью, он прост в исполнении и, самое главное, требу-

ет для анализа минимума времени. С широким внедрением в иммунологию лазерных нефело-

метров метод становится все более доступным для практики. Однако он требует использования

высокоочищенных антисывороток, дающих прозрачные растворы, очистки исследуемых биологи-

ческих жидкостей от твердых частиц, на которых могут осаждаться иммунные комплексы, и четко

отработанной технологии, - при выполнении всех этих требований метод целесообразно вне-

дрять а лабораториях крупных клинических больниц.

Радиоиммунологический метод. Этот метод развивается с 1960 г., основан на феномене

конкуренции определяемого (немеченого) антигена с известным количеством меченого антигена

(обычно антиген метят изотопами 131I, 125I, 3Н) за ограниченное количество специфических к анти-

гену антител, введенных в систему (Иммунологические методы, 1987; Клиническая иммунология,

1986). Чем больше в исследуемой жидкости содержится определяемого антигена, тем меньше

меченого антигена свяжется с антителами и, следовательно, больше останется в растворе. Для

определения соотношения связанного и свободного меченого антигена их необходимо разде-

лить. Разделение можно проводить методами копреципитации, адсорбции, электрофореза. Од-

нако наибольшее распространение получила твердофазная техника радиоиммунологического

анализа, в которой антитела или антиген иммобиотзуются на сорбенте (полистирол, полиэтилен,

полипропилен, акриламад, целлюлоза, сефадекс и др.), что существенно упрощает разделение

свободного и связанного антигена.

Метод твердофазного радиоиммунного анализа осуществляют следующим образом. Вначале

получают пробирки с адсорбированными антителами: для этого раствор антител инкубируют в

пластиковых пробирках, после чего избыток антител удаляют промыванием. Для проведения

анализа в обработанные таким образом пробирки заливают исследуемую жидкость, инкубируют,

далее ее удаляют и вносят известное количество меченого антигена. После инкубации и отмывки

определяют количество свяавшегося меченого антигена при помощи жидкостного сцинтилляци-

онного счетчика.

Часто используют неконкурентные методы анализа, суть которых состоит в том, что антигены

(или антитела) известной специфичности связывают на сорбентах. В результате инкубации их с

исследуемой пробой происходит связывание антител (или антигенов). Далее к ним добавляют

меченые антитела и после инкубации по радиоактивности определяют количество связавшихся

антител. К неконкурентным методам относится и метод двойных антител (сэндвич-метод), в ко-

тором используется свойство антигенов, связанных с иммобилизованными антителами, сохра-

нять способность участвовать в последующих реакциях.

Радиоиммунный анализ обычно используют для определения lgE, различных антител, гор-

монов, тиреоглобулина, компонентов комплемента и т.д.

Радиоиммунологические методы просты и надежны. Колебания в серии анализов не превы-

шают 10%. Несомненным их достоинством является высокая чувствительность (нанограммы ве-

ществ), которая повышается при использовании метода двойных антител. Однако использование

радиоактивной метки (необходимость специальных средств защиты от облучения, необходи-

мость иметь сцинтилляционный счетчик) и повышенные требования к чистоте реактивов ограни-

чивают его использование лабораториями институтов и специализированных клиник.

Иммуноферментный метод. Иммуноферментный анализ, предложенный в начале 70-х го-

дов, основан на том же принципе, что радиоиммунный и люминесцентно-серологический, только

в нем взамен радиоактивной или люминесцентной метки используют ферментную (пероксидаза,

щелочная фосфотаза, глюкозооксидаза и др.) (Иммунологические методы, 1987; Клиническая

иммунология, 1986).

Иммунология в клинической практике - часть 6